Summary
Este protocolo describe un método para recolectar muestras de lágrimas utilizando tiras de Schirmer y un flujo de trabajo cuantitativo integrado para descubrir biomarcadores de proteínas lagrimales no invasivos. El flujo de trabajo de preparación de muestras con captura en suspensión permite una preparación rápida y robusta de muestras de lágrimas y análisis por espectrometría de masas, lo que da como resultado mayores rendimientos de recuperación de péptidos e identificación de proteínas que los procedimientos estándar en solución.
Abstract
El líquido lagrimal es uno de los biofluidos de fácil acceso que se puede recolectar de forma no invasiva. La proteómica lagrimal tiene el potencial de descubrir biomarcadores para varias enfermedades y afecciones oculares. Se ha informado que la columna de captura de suspensión es un flujo de trabajo de preparación de muestras eficiente y fácil de usar para la amplia aplicación del análisis proteómico posterior. Sin embargo, esta estrategia no ha sido bien estudiada en el análisis del proteoma lagrimal humano. El presente protocolo describe un flujo de trabajo integrado desde muestras clínicas de lágrimas humanas hasta péptidos purificados para la investigación no invasiva de biomarcadores de proteínas lagrimales mediante espectrometría de masas, que proporciona información sobre los biomarcadores de enfermedades y el seguimiento cuando se combina con el análisis bioinformático. Se aplicó una preparación de muestras de captura de suspensión de proteínas y se demostró el descubrimiento del proteoma lagrimal con procedimientos rápidos, reproducibles y fáciles de usar, como una preparación de muestras universal y optimizada para el análisis del fluido lagrimal humano. En particular, el procedimiento de captura de suspensión superó a la preparación de muestras en solución en términos de recuperación de péptidos, identificación de proteínas y menor tiempo de preparación de muestras.
Introduction
La proteómica lagrimal ha recibido atención para explorar biomarcadores potenciales para enfermedades y afecciones oculares 1,2,3,4,5,6, para acceder a la patogénesis de la afección ocular y sistémica, así como para explotar la ventaja de la recolección no invasiva de muestras lagrimales utilizando tiras de Schirmer. El avance tecnológico de la espectrometría de masas de próxima generación ha permitido la cuantificación de proteínas en lágrimas a escala de microlitros con una exactitud y precisión que no eran posibles en el pasado. Los métodos de preparación de muestras aún no están estandarizados. Un flujo de trabajo de preparación de muestras robusto y estandarizado es esencial para el éxito de la aplicación clínica en la investigación de biomarcadores de proteínas lagrimales. El flujo de trabajo de preparación de muestras con trampeo en suspensión (S-Trap) se ha descrito recientemente como un método de preparación de muestras eficaz y sensible para un amplio análisis proteómico posterior 7,8. Sin embargo, esta estrategia no ha sido bien reportada en el análisis del proteoma lagrimal humano, superó a la preparación de muestras asistida por filtro (FASP) y a la digestión en solución en términos de eficiencia de digestión enzimática y el mayor número de identificación de proteínas por análisis de espectrometría de masas9. El enfoque basado en S-Trap se demostró en la preparación de tejido retiniano 10, tejido fijado en formol e incluido en parafina (FFPE)11, células 12, microorganismos 13 y biopsias líquidas14,15.
Este protocolo describe un flujo de trabajo cuantitativo integrado desde muestras clínicas hasta proteínas digeridas enzimáticamente para el descubrimiento de un panel de biomarcadores de proteínas lagrimales no invasivo con una estrategia técnica rápida, reproducible y robusta. Brevemente, el líquido lagrimal se recolectó con una tira Schirmer estándar y se secó inmediatamente con un calentador de marco oftálmico para evitar la autólisis de proteínas a temperatura ambiente. Las proteínas totales incluidas se extrajeron utilizando un tampón de lisis de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 5% de acuerdo con la sugerencia del fabricante, seguido de la medición del ensayo de proteínas. A continuación, el lisado extraído se sometió a una reducción estándar con ditiotreitol (DTT) y alquilación con yodoacetamida (IAA).
Después de la acidificación con ácido fosfórico, se añadió a las proteínas agregadas un tampón de precipitación de proteínas de la columna que atrapa la suspensión que contenía un 90% de metanol y 100 mM de bicarbonato de trietilamonio (TEAB). A continuación, la muestra se transfirió a una nueva microcolumna de captura de suspensión. Digestión enzimática con tripsina de grado secuencial en una proporción de 1:25 (p/p, tripsina: proteína) a 47 °C durante 1 h. A continuación, los péptidos resultantes se eluyeron mediante centrifugación, secuencialmente con 50 mM de TEAB, ácido fórmico acuoso (AG) al 0,2% y acetonitrilo (ACN) al 50% que contenía un 0,2% de AG. Los péptidos eluidos se secaron al vacío y se reconstituyeron en AG al 0,1 %. La concentración peptídica se midió y se ajustó a 0,5 μg/μL para el análisis por espectrometría de masas.
Protocol
Los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito antes de participar en el estudio. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética Humana de la Universidad Politécnica de Hong Kong y se adhirió a los principios de la Declaración de Helsinki.
1. Recolección de líquido lagrimal humano con tira de Schirmer
- Use guantes y desinfecte para evitar la contaminación de la muestra.
- Compruebe que el embalaje interior esté intacto, estéril y no caducado.
- Doble la parte superior de la tira Schirmer ligeramente hacia adentro en la marca de 0 mm, como se indica cerca de la punta semicircular de la tira (Figura 1).
- Retire la tira del paquete interior sujetando el extremo de la tira y evite el contacto directo con el área de recolección de muestras de 0 a 25 mm.
- Pídale al sujeto que desvíe la mirada de la posición de la tira que se va a colocar.
- Tire suavemente hacia abajo del párpado inferior y enganche el extremo de la tira en el fórnix inferior cerca de la región lateral del canto (Figura 2). Repita el mismo procedimiento en el otro ojo.
- Pídale al sujeto que cierre suavemente los párpados para minimizar la irritación.
- Recoja el líquido lagrimal durante unos 5 minutos o, preferiblemente, se recolectó una muestra lagrimal de 15-20 mm.
- Pídale al sujeto que abra ambos ojos, tire suavemente hacia abajo del párpado inferior y retire las tiras del sujeto.
- Inspeccione la longitud hidratada en la tira Schirmer y registre la cantidad recolectada en mm.
- Seque la tira con un calentador de marco limpio estándar hasta que el líquido esté completamente seco.
NOTA: Se debe evitar el calentamiento excesivo que podría carbonizar el papel de filtro. - Inserte cada tira seca de Schirmer en un criotubo etiquetado y guárdela preferiblemente en un lugar fresco y seco en la oscuridad hasta su posterior procesamiento.
2. Preparación de productos químicos y reactivos
- Tampón de lisis (SDS al 5 %, 50 mM TEAB, pH 7,5), 20 ml
- Pipeta 1 mL de TEAB 1 M y 80 μL de ácido fosfórico al 12%. Vórtice y sonique brevemente para eliminar las burbujas. Rellene hasta 20 ml con agua desionizada.
- Pesar 1 g de SDS y añadir a la solución con oscilación hasta que se disuelva.
- Tampón de precipitación de proteínas (metanol al 90 %, 100 mM de TEAB, pH 7,1), 10 ml
- Añadir 893 μL de 1 M de TEAB y 92 μL de agua desionizada.
- Añadir 15 μL de ácido fosfórico al 85 % en peso y 9 mL de metanol a la solución y al vórtice brevemente.
- Tampón de digestión (50 mM TEAB), 1 mL
- Añadir 50 μL de TEAB 1 M y rellenar hasta 1 mL con agua desionizada.
- 200 mM de solución de ditiotreitol (DTT), 500 μL
- Pesar 15 mg de DTT y disolver en 500 μL de agua desionizada; vórtice brevemente.
NOTA: Preparar antes de usar.
- Pesar 15 mg de DTT y disolver en 500 μL de agua desionizada; vórtice brevemente.
- 400 mM de solución de yodoacetamida (IAA), 200 μL
- Pesar 15 mg de IAA y disolver en 200 μL de agua desionizada; vórtice brevemente. NOTA: Preparar antes de usar y evitar la luz.
- 0,2 % ácido fórmico, 50 % acetonitrilo, 10 ml
- Preparar 10 mL de acetonitrilo al 50% en agua desionizada.
- Añadir 20 μL de ácido fórmico y vórtice brevemente.
- Solución de ácido fórmico al 0,2 %, 10 ml
- Añadir 20 μL de ácido fórmico a 10 mL de agua desionizada y vórtice brevemente.
- Solución de ácido fórmico al 0,1 %, 10 ml
- Añadir 10 μL de ácido fórmico a 10 mL de agua desionizada; vórtice brevemente.
3. Extracción de proteínas en tira de Schirmer
- Corte y deseche la parte delantera más allá de la marca de 0 mm de la tira para eliminar la posible contaminación debido al contacto de los tejidos conjuntivales con unas tijeras limpias de acero inoxidable.
- Corte la tira en intervalos de 1 mm en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (Figura 3).
- Añadir 100 μL de tampón de lisis al tubo de microcentrífuga y vórtice a 1.000 rpm, temperatura ambiente durante 1 h en una termomezcladora.
- Centrifugar brevemente y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Mueva las tiras a puntas de pipeta de 200 μL con unas pinzas limpias. Coloque las puntas en el mismo tubo del paso 3.4 con soporte y centrífuga a temperatura ambiente a 4.000 × g durante 1 minuto más para obtener la máxima recuperación de la muestra restante en la tira.
- Mida la concentración de proteínas mediante ácido bicincónico (BCA) o un ensayo de proteínas compatibles.
4. Preparación de muestras con atrapamiento de suspensión
- Normalice las muestras a 50 μg de proteína en función del resultado del ensayo de proteína.
- Añadir 200 mM de TDT en una proporción de 1:10 (v/v, TDT: muestra) a una concentración final de 20 mM de TDT e incubar a 95 °C durante 10 min.
- Enfríe la solución proteica a temperatura ambiente.
- Añadir 400 mM de IAA en una proporción de 1:10 (v/v, IAA: muestra) hasta una concentración final de 40 mM de IAA e incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 min.
- Añadir un 12% de ácido fosfórico acuoso en una proporción de 1:10 (v/v, ácido: muestra) hasta una concentración final de ácido fosfórico al 1,2% y vórtice brevemente.
- Agregue tampón de unión a proteínas en una proporción de 1:6 (v/v, muestra: tampón) y vórtice brevemente.
NOTA: En este paso, se deben formar partículas de proteína coloidal y la solución aparecerá translúcida si la cantidad de proteína es suficiente. - Destape la columna de microcentrifugación de captura de suspensión y ensamble la columna de centrifugación en un tubo de microcentrífuga de 2 ml para recolectar el flujo.
- Añadir hasta 200 μL de mezcla de lisado de proteínas acidificadas en la columna.
- Centrifugar la columna a 4.000 × g durante 20 s. Las partículas proteicas quedaron atrapadas; Repita hasta que las muestras se carguen en la columna.
- Añadir 150 μL de tampón fijador de proteínas y centrifugar a 4.000 × g durante 20 s para lavar la proteína en suspensión. Repita 3 veces.
- Ensamble la microcolumna de captura de suspensión en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Añadir 20 μL de tampón de digestión TEAB de 50 mM que contenga proteasa en una proporción de 1:25 (p/p, tripsina: proteína) en el filtro dentro de la columna de centrifugación, evitando burbujas y espacio de aire entre el filtro y la solución de digestión.
- Tape la columna de microgiro de atrapamiento de suspensión para evitar la evaporación. Incubar a 47 °C durante 1 h en una termobatidora; No agite ni haga vórtices durante la digestión.
- Eluir péptidos con 40 μL de TEAB de 50 mM por fuerza centrífuga a 4.000 × g durante 20 s.
- Añadir 40 μL de AG al 0,2% y centrifugar a 4.000 × g durante 20 s.
- Añadir 35 μL de AG al 0,2%, acetonitrilo al 50% y centrifugar a 4.000 × g durante 20 s.
- Piscina tres eluidos y secado con una centrífuga al vacío.
- Almacenar a -80 °C en el congelador a temperatura ultrabaja hasta su posterior análisis. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
5. Reconstituir péptidos para análisis de espectrometría de masas
- Reconstituya la muestra con 12 μL de AG al 0,1%, vórtice y centrifugar brevemente.
- Mida la concentración de péptidos con un kit de ensayo de péptidos.
- Normalizar la concentración de péptidos a 0,5 μg/μL en AG al 0,1%.
- Transfiera la mezcla de péptidos a un vial de muestreador automático y esté lista para el análisis de espectrometría de masas.
6. Adquisición de muestras por cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem
- Cargue 3 μg del péptido con tampón de carga isocrática (0,1 % de AG, 5 % de ACN) en una columna trampa (C18, 5 μm, 100 μm, 20 mm) a un caudal de 2 μL/min durante 15 min.
- Fraccionar los péptidos utilizando una nanocolumna analítica de fase reversa (C18, 5 μm, 100 μm, 300 mm) a un caudal de 350 nL/min en un gradiente de separación de 155 min. Utilice la fase móvil A que comprende una mezcla de 0,1% de ácido fórmico (v/v), 5% de ACN (v/v) en agua y la fase móvil B que contiene 0,1% de FA (v/v), 98% de ACN (v/v) en agua. Utilice el siguiente gradiente: 0-0,5 min: 5% B, 0,5-90 min: 10% B, 90-120 min: 20% B, 120-130 min: 28% B, 130-135 min: 45% B, 135-141 min: 80% B, 141-155 min: 5% B.
- Realice la adquisición dependiente de datos (DDA) con un rango de escaneo TOF-MS entre 350 y 1800 m/z con un tiempo de acumulación de 250 ms y un tiempo de exclusión de objetivos dinámicos de 18 s. A continuación, realice un escaneo MS/MS a 100 a 1.800 m/z en modo de alta sensibilidad con un tiempo de acumulación de 50 ms para los 50 precursores principales por ciclo con un umbral de 125 cps para la señal MS/MS con un estado de carga de +2 a +4.
- Analice los datos sin procesar con el software referenciado u otros motores compatibles con una base de datos de referencia en FASTA de la base de datos UniProt de acceso público.
Representative Results
Este protocolo permite la recogida de muestras de lágrimas con tiras Schirmer que se almacenan secas a temperatura ambiente antes de la posterior preparación de la muestra para el análisis de espectrometría de masas. El flujo de trabajo de preparación de muestras asistido por filtro (FASP) con microcolumna de captura de suspensión permitió una preparación rápida de muestras en horas, en comparación con los procedimientos de digestión en solución comúnmente adoptados en días que requieren incubación durante la noche. El rendimiento de recuperación peptídica fue significativamente mayor (p < 0,001) que el protocolo estándar de digestión en solución y con buena reproducibilidad a un coeficiente de variación (%CV) < 7%. Se repitió un pool de muestras de lágrimas en seis réplicas técnicas con 74,2 ± 5,0% de recuperación de péptidos y 52,8 ± 1,6% de recuperación de péptidos en muestras preparadas con procedimientos en solución. Se colocó una muestra de lágrima combinada con una cantidad de proteína de 36,3 μg en la tira de Schirmer y se extrajo como se describió anteriormente, la eficiencia de extracción de la proteína fue del 81% (29,5 ± 6,8 μg, media ± DE).
Ambos flujos de trabajo cargaron 3 μg de péptidos en el MS, y la búsqueda de DDA arrojó un total de 1.183 ± 118 proteínas (5.757 ± 537 péptidos distintos) y 874 ± 70 proteínas (4.400 ± 328 péptidos) al 1% de FDR en el grupo de captura de suspensión y en el grupo en solución, respectivamente. El análisis de la ontología génica (GO) utilizando el sistema de clasificación PANTHER reveló proteomas muy similares para ambos enfoques, siendo la unión, la actividad catalítica y la regulación de la función molecular sus principales funciones moleculares (Figura 4).
Figura 1: Doble la parte superior de la tira Schirmer en la marca de 0 mm antes de la aplicación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Posición de la tira Schirmer durante la recolección de lágrimas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ilustración de la manipulación de la tira de Schirmer antes de la extracción de proteínas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Gráfico circular que ilustra el análisis de ontología génica para los proteomas identificados mediante el flujo de trabajo en solución y el flujo de trabajo de captura de suspensión, utilizando el sistema de clasificación PANTHER. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Para lograr resultados precisos con este método, se deben usar guantes desechables sin energía en todos los procedimientos, desde la recolección de muestras de lágrimas para evitar la contaminación de la muestra. Es importante evitar burbujas y espacios de aire entre el filtro y la solución de muestra en cada paso mediante la utilización de columnas de microhilado. Si el volumen de la muestra es mayor que la capacidad de las columnas, se recomienda repetir el proceso. Este protocolo ha demostrado ser más eficiente que el protocolo tradicional en solución en términos de tiempo de preparación, recuperación de proteínas e identificación total de proteínas. Esto se debe en gran medida a que las muestras se someten a la mayoría de los procedimientos requeridos en la misma columna, a diferencia del método en solución que implica múltiples pasos de transferencia, como la precipitación de acetona, la digestión y la limpieza (desalinización), lo que aumenta la probabilidad de variaciones en los datos resultantes.
Además de las muestras de lágrimas recogidas con el método microcapilar16,17, este flujo de trabajo FASP con microcolumna de atrapamiento de suspensión proporciona un método alternativo de preparación de muestras que permite una preparación rápida y robusta de las muestras de lágrimas recogidas con tiras Schirmer, con una preparación mínima del material y pasos fáciles de seguir. Esto permite la preparación reproducible de muestras de lágrimas para estudios de grandes cohortes en múltiples enfermedades o afecciones oculares con una mejor recuperación de péptidos e identificación de proteínas por parte de MS en comparación con los procedimientos en solución. Este proceso confiable se puede utilizar regularmente en la preparación de muestras de biomarcadores lagrimales para investigación y otros fines clínicos. Y lo que es más importante, requiere una formación mínima del personal para la recogida in situ y elimina la necesidad de almacenar las muestras en un congelador. Las muestras se secan in situ para minimizar la autólisis y la degradación de las proteínas. Por lo tanto, esto permite un envío conveniente por correo para facilitar el análisis posterior, en lugar de usar tubos microcapilares.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Esta labor contó con el apoyo de la iniciativa InnoHK y del Gobierno de la Región Administrativa Especial de Hong Kong; Centro de Investigación de la Visión SHARP; y el Centro de Investigación para la Innovación de la Medicina China (RCMI) de la Universidad Politécnica de Hong Kong.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9 mm Plastic Screw Thread Vials | Thermo Scientific | C4000-11 | |
| Acetonitrile, LCMS Grade | Anaqua | AC-1026 | |
| Centrifuge MiniSpin plus | Eppendorf | 5453000097 | |
| DL-dithiothreitol (DTT), BioUltra | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Formic acid, ACS reagent, ≥96% | Sigma-Aldrich | 695076 | |
| Frame Heater OPTIMONSUN Electronic | Breitfeld & Schliekert GmbH | 1203166 | |
| Iodoacetamide (IAA), BioUltra | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol, HPLC Grade | Anaqua | MA-1292 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes, 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 368632 | |
| Phosphoric acid, 85 wt.% in H2O | Sigma-Aldrich | 345245 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry | Sciex | TripleTOF 6600 | |
| Schirmer Ophthalmic Strips | Entod Research Cell UK Ltd | I-DEW Tearstrips | |
| S-Trap Micro Column | Protifi | C02-micro-80 | |
| SureSTART 9 mm Screw Caps | Thermo Scientific | CHSC9-40 | |
| Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M | Sigma-Aldrich | 18597 | |
| Ultra-performance Liquid Chromatography | Eksigent | NanoLC 400 | |
| UltraPure Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 |
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