Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تحضير عينة محاصرة بتعليق البروتين للبروتينات المسيل للدموع بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة - قياس الطيف الكتلي الترادفي

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/64617
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2, 1, 1,2,3,4
1Centre for Myopia Research, School of Optometry, The Hong Kong Polytechnic University, 2Centre for Eye and Vision Research (CEVR), 3Research Centre for SHARP Vision (RCSV), The Hong Kong Polytechnic University, 4Research Centre for Chinese Medicine Innovation (RCMI), The Hong Kong Polytechnic University
* These authors contributed equally

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة لجمع عينات الدموع باستخدام شرائط شيرمر وسير عمل كمي متكامل لاكتشاف المؤشرات الحيوية للبروتين المسيل للدموع غير الغازية. يتيح سير عمل تحضير عينة محاصرة التعليق إعداد سريع وقوي لعينة الدموع والتحليل الطيفي للكتلة ، مما يؤدي إلى زيادة إنتاجية استرداد الببتيد وتحديد البروتين مقارنة بالإجراءات القياسية في المحلول.

Abstract

السائل المسيل للدموع هو أحد السوائل الحيوية التي يمكن الوصول إليها بسهولة والتي يمكن جمعها بشكل غير جراحي. البروتيوميات المسيل للدموع لديها القدرة على اكتشاف المؤشرات الحيوية للعديد من أمراض وحالات العين. تم الإبلاغ عن أن عمود محاصرة التعليق هو سير عمل فعال وسهل الاستخدام لإعداد العينات للتطبيق الواسع للتحليل البروتيني النهائي. ومع ذلك ، لم تتم دراسة هذه الاستراتيجية جيدا في تحليل البروتين المسيل للدموع البشري. يصف البروتوكول الحالي سير عمل متكامل من عينات الدموع البشرية السريرية إلى الببتيدات المنقاة لأبحاث العلامات الحيوية للبروتين المسيل للدموع غير الغازية باستخدام قياس الطيف الكتلي ، والذي يوفر رؤى حول المؤشرات الحيوية للمرض والمراقبة عند دمجها مع تحليل المعلوماتية الحيوية. تم تطبيق تحضير عينة محاصرة معلق البروتين وأظهر اكتشاف بروتين الدموع بإجراءات سريعة وقابلة للتكرار وسهلة الاستخدام ، كتحضير عينة عالمي محسن لتحليل السائل المسيل للدموع البشري. على وجه الخصوص ، تفوقت عملية محاصرة التعليق على تحضير العينة في المحلول من حيث استعادة الببتيد ، وتحديد البروتين ، ووقت تحضير العينة الأقصر.

Introduction

تلقت البروتينات المسيل للدموع الاهتمام لاستكشاف المؤشرات الحيوية المحتملة لأمراض وظروف العين1،2،3،4،5،6 ، للوصول إلى التسبب في حالة العين والجهازية ، وكذلك لاستغلال ميزة جمع عينات الدموع غير الغازية باستخدام شرائط شيرمر. مكن التقدم التكنولوجي للجيل التالي من قياس الطيف الكتلي من تحديد كمية البروتين في الدموع على نطاق ميكرولتر بدقة ودقة لم تكن ممكنة في الماضي. طرق تحضير العينات ليست موحدة بعد. يعد سير عمل إعداد العينات القوي والموحد أمرا ضروريا لنجاح التطبيق السريري في أبحاث العلامات الحيوية للبروتين المسيل للدموع. تم الإبلاغ مؤخرا عن سير عمل تحضير عينة محاصرة التعليق (S-Trap) كطريقة تحضير عينة فعالة وحساسة للتحليل البروتيني الواسع النطاق 7,8. ومع ذلك ، لم يتم الإبلاغ عن هذه الاستراتيجية بشكل جيد في تحليل البروتين المسيل للدموع البشري ، وتفوقت على تحضير العينات بمساعدة المرشح (FASP) والهضم داخل المحلول من حيث كفاءة الهضم الأنزيمي والعدد الأكبر من تحديد البروتين عن طريق التحليل الطيفيالكتلي 9. تم توضيح النهج القائم على S-Trap في تحضير أنسجة الشبكية 10 ، والأنسجة الثابتة بالفورمالين ، والأنسجة المضمنة بالبارافين (FFPE)11 ، والخلايا 12 ، والكائنات الحية الدقيقة 13 ، والخزعات السائلة14،15.

يصف هذا البروتوكول سير عمل كمي متكامل من العينات السريرية إلى البروتين المهضوم إنزيميا لاكتشاف لوحة العلامات الحيوية للبروتين المسيل للدموع غير الغازية مع استراتيجية تقنية سريعة وقابلة للتكرار وقوية. لفترة وجيزة ، تم جمع السائل المسيل للدموع باستخدام شريط شيرمر القياسي وتجفيفه على الفور باستخدام سخان إطار العيون لمنع التحلل الذاتي للبروتين في درجة حرارة الغرفة. تم استخراج البروتينات الكلية المضمنة باستخدام محلول تحلل كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) بنسبة 5٪ وفقا لاقتراح الشركة المصنعة ، متبوعا بقياس مقايسة البروتين. ثم خضعت المحللة المستخلصة لاختزال قياسي مع ديثيوثريتول (DTT) والألكلة مع يودواسيتاميد (IAA).

بعد التحمض بحمض الفوسفوريك ، تمت إضافة محلول ترسيب بروتين عمود محاصرة معلق يحتوي على 90٪ ميثانول و 100 مللي متر ثلاثي إيثيل الأمونيوم بيكربونات (TEAB) إلى البروتينات الكلية. ثم تم نقل العينة إلى عمود صغير جديد لمحاصرة التعليق. الهضم الأنزيمي مع القيام به مع تسلسل درجة التربسين بنسبة 1:25 (وزن / وزن ، التربسين: البروتين) عند 47 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ثم تم استخلاص الببتيدات الناتجة عن طريق الطرد المركزي ، بالتتابع مع 50 mM TEAB ، و 0.2٪ حمض الفورميك المائي (FA) ، و 50٪ acetonitrile (ACN) التي تحتوي على 0.2٪ FA. تم تجفيف الببتيدات المستخلصة بالفراغ وإعادة تشكيلها بنسبة 0.1٪ FA. تم قياس تركيز الببتيد وتعديله إلى 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر لتحليل مطياف الكتلة.

Protocol

قدم الأشخاص موافقة خطية مستنيرة قبل المشاركة في الدراسة. تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات الإنسان بجامعة هونغ كونغ للفنون التطبيقية والتزمت بمبادئ إعلان هلسنكي.

1. جمع السائل المسيل للدموع البشري مع شريط شيرمر

  1. ارتد القفازات وعقم لتجنب تلوث العينات.
  2. تأكد من أن العبوة الداخلية سليمة ومعقمة وغير منتهية الصلاحية.
  3. ثني الجزء العلوي من شريط شيرمر إلى الداخل قليلا عند علامة 0 مم ، كما هو موضح بالقرب من طرف نصف دائرة الشريط (الشكل 1).
  4. قم بإزالة الشريط من العبوة الداخلية عن طريق الضغط على نهاية الشريط ، وتجنب الاتصال المباشر بمنطقة جمع العينات من 0 إلى 25 مم.
  5. اطلب من الموضوع أن ينظر بعيدا عن موضع الشريط المراد وضعه.
  6. اسحب الجفن السفلي لأسفل برفق واربط نهاية الشريط في الجزء السفلي بالقرب من منطقة canthus الجانبية (الشكل 2). كرر نفس الإجراء على العين الأخرى.
  7. اطلب من الشخص إغلاق الجفون برفق لتقليل التهيج.
  8. جمع السائل المسيل للدموع لمدة 5 دقائق أو يفضل جمع عينة المسيل للدموع 15-20 ملم.
  9. اطلب من الشخص فتح كلتا العينين ، واسحب الجفن السفلي برفق وأزل الشرائط من الموضوع.
  10. افحص الطول المائي على شريط شيرمر وسجل الكمية المجمعة بالملليمتر.
  11. جفف الشريط باستخدام سخان إطار قياسي ونظيف حتى يجف السائل تماما.
    ملاحظة: يجب تجنب التسخين الزائد الذي قد يؤدي إلى تفحم ورق الترشيح.
  12. أدخل كل شريط شيرمر مجفف في أنبوب تبريد مكتوب عليه وقم بتخزينه بشكل مفضل في مكان بارد وجاف في الظلام حتى تتم معالجته مرة أخرى.

2. تحضير المواد الكيميائية والكواشف

  1. المخزن المؤقت للتحلل (5٪ SDS ، 50 مللي متر TEAB ، درجة الحموضة 7.5) ، 20 مل
    1. ماصة 1 مل من 1 M TEAB و 80 ميكرولتر من حمض الفوسفوريك 12٪. دوامة و sonicate لفترة وجيزة لإزالة فقاعات. قم بتعبئة ما يصل إلى 20 مل بالماء منزوع الأيونات.
    2. تزن 1 غرام من SDS وتضاف إلى الحل مع التذبذب حتى يذوب.
  2. عازلة لترسيب البروتين (90٪ ميثانول ، 100 مللي متر TEAB ، درجة حموضة 7.1) ، 10 مل
    1. أضف 893 ميكرولتر من 1 M TEAB و 92 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات.
    2. أضف 15 ميكرولتر من 85 وزن٪ حمض الفوسفوريك و 9 مل من الميثانول إلى المحلول والدوامة لفترة وجيزة.
  3. محلول الهضم (50 مللي متر TEAB) ، 1 مل
    1. أضف 50 ميكرولتر من 1 متر TEAB وقم بتعبئة ما يصل إلى 1 مل بالماء منزوع الأيونات.
  4. محلول ديثيوثريتول (DTT) 200 مللي متر ، 500 ميكرولتر
    1. تزن 15 ملغ من DTT وتذوب في 500 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات ؛ دوامة لفترة وجيزة.
      ملاحظة: التحضير قبل الاستخدام.
  5. محلول يودوأسيتاميد (IAA) 400 مللي متر ، 200 ميكرولتر
    1. تزن 15 ملغ من IAA وتذوب في 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات ؛ دوامة لفترة وجيزة. ملاحظة: استعد قبل الاستخدام وتجنب الضوء.
  6. 0.2٪ حمض الفورميك ، 50٪ أسيتونيتريل ، 10 مل
    1. تحضير 10 مل من 50 ٪ أسيتونيتريل في الماء منزوع الأيونات.
    2. أضف 20 ميكرولتر من حمض الفورميك والدوامة لفترة وجيزة.
  7. 0.2٪ محلول حمض الفورميك ، 10 مل
    1. أضف 20 ميكرولتر من حمض الفورميك إلى 10 مل من الماء منزوع الأيونات والدوامة لفترة وجيزة.
  8. 0.1٪ محلول حمض الفورميك ، 10 مل
    1. أضف 10 ميكرولتر من حمض الفورميك إلى 10 مل من الماء منزوع الأيونات ؛ دوامة لفترة وجيزة.

3. استخراج البروتين في شريط شيرمر

  1. قم بقص وتجاهل الواجهة الأمامية بعد علامة 0 مم للشريط لإزالة التلوث المحتمل بسبب ملامسة أنسجة الملتحمة بمقص نظيف من الفولاذ المقاوم للصدأ.
  2. قطع الشريط على فترات 1 مم إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل (الشكل 3).
  3. أضف 100 ميكرولتر من محلول التحلل إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، ودوامة عند 1000 دورة في الدقيقة ، ودرجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة في خلاط حراري.
  4. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة ونقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل.
  5. حرك الشرائط إلى أطراف ماصة سعة 200 ميكرولتر باستخدام ملقط نظيف. ضع الأطراف في نفس الأنبوب من الخطوة 3.4 مع الحامل وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة عند 4000 × جم لمدة 1 دقيقة أخرى لتحقيق أقصى قدر من استرداد العينة المتبقية على الشريط.
  6. قم بقياس تركيز البروتين باستخدام حمض البيسينتشونينيك (BCA) أو مقايسة البروتين المتوافقة.

4. إعداد عينة محاصرة التعليق

  1. تطبيع العينات إلى 50 ميكروغرام من البروتين بناء على نتيجة فحص البروتين.
  2. أضف 200 mM DTT بنسبة 1:10 (v / v ، DTT: عينة) إلى تركيز نهائي قدره 20 mM DTT واحتضانها عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  3. يبرد محلول البروتين إلى درجة حرارة الغرفة.
  4. أضف 400 mM IAA بنسبة 1:10 (v / v ، IAA: عينة) إلى تركيز نهائي قدره 40 mM IAA واحتضانها في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  5. أضف 12٪ حمض الفوسفوريك المائي بنسبة 1:10 (v / v ، الحمض: عينة) إلى تركيز نهائي قدره 1.2٪ حمض الفوسفوريك والدوامة لفترة وجيزة.
  6. أضف المخزن المؤقت لربط البروتين بنسبة 1: 6 (v / v ، العينة: buffer) والدوامة لفترة وجيزة.
    ملاحظة: في هذه الخطوة ، يجب تكوين جسيمات البروتين الغروية ، وسيظهر المحلول شفافا إذا كانت كمية البروتين كافية.
  7. قم بفك غطاء عمود الدوران الصغير لمحاصرة التعليق وقم بتجميع عمود الدوران على أنبوب طرد مركزي صغير سعة 2 مل لجمع التدفق.
  8. أضف ما يصل إلى 200 ميكرولتر من خليط تحلل البروتين المحمض في العمود.
  9. أجهزة الطرد المركزي العمود في 4000 × غرام لمدة 20 ثانية. كانت جسيمات البروتين محاصرة. كرر حتى يتم تحميل العينات إلى العمود.
  10. أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت لربط البروتين وأجهزة الطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 20 ثانية لغسل البروتين العالق. كرر 3x.
  11. قم بتجميع العمود الصغير لمحاصرة التعليق على أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل.
  12. أضف 20 ميكرولتر من محلول الهضم TEAB 50mM الذي يحتوي على البروتياز بنسبة 1:25 (وزن / وزن ، التربسين: البروتين) على المرشح داخل عمود الدوران ، وتجنب الفقاعات وفجوة الهواء بين المرشح ومحلول الهضم.
  13. قم بتغطية عمود الدوران الصغير الذي يحبس التعليق لمنع التبخر. احتضان عند 47 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في خلاط حراري ؛ لا تهز أو دوامة أثناء الهضم.
  14. الببتيدات Elute مع 40 ميكرولتر من 50 mM TEAB بواسطة قوة الطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 20 ثانية.
  15. أضف 40 ميكرولتر من 0.2٪ FA وأجهزة طرد مركزي عند 4000 × جم لمدة 20 ثانية.
  16. أضف 35 ميكرولتر من 0.2٪ FA و 50٪ أسيتونيتريل وأجهزة طرد مركزي عند 4000 × جم لمدة 20 ثانية.
  17. حمام السباحة ثلاثة يشطف ويجفف مع جهاز طرد مركزي فراغ.
  18. يخزن في الفريزر بدرجة حرارة منخفضة للغاية -80 درجة مئوية حتى إجراء مزيد من التحليل. ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

5. إعادة تكوين الببتيدات لتحليل قياس الطيف الكتلي

  1. أعد تكوين العينة ب 12 ميكرولتر من 0.1٪ FA ، دوامة ، وأجهزة طرد مركزي لفترة وجيزة.
  2. قم بقياس تركيز الببتيد باستخدام مجموعة فحص الببتيد.
  3. تطبيع تركيز الببتيد إلى 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر في 0.1٪ FA.
  4. انقل خليط الببتيد إلى قارورة أخذ العينات الأوتوماتيكية وجاهز لتحليل قياس الطيف الكتلي.

6. الحصول على عينة بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة - قياس الطيف الكتلي الترادفي

  1. قم بتحميل 3 ميكروغرام من الببتيد مع مخزن تحميل متساوي (0.1٪ FA ، 5٪ ACN) إلى عمود مصيدة (C18 ، 5 ميكرومتر ، 100 ميكرومتر ، 20 مم) بمعدل تدفق 2 ميكرولتر / دقيقة لمدة 15 دقيقة.
  2. تجزئة الببتيدات باستخدام عمود تحليلي نانوي عكسي الطور (C18 ، 5 ميكرومتر ، 100 ميكرومتر ، 300 مم) بمعدل تدفق 350 nL / min في تدرج فصل 155 دقيقة. استخدم المرحلة المتنقلة A التي تتكون من خليط من 0.1٪ حمض الفورميك (v / v) ، و 5٪ ACN (v / v) في الماء والمرحلة المتنقلة B التي تحتوي على 0.1٪ FA (v / v) ، 98٪ ACN (v / v) في الماء. استخدم التدرج التالي: 0-0.5 دقيقة: 5٪ ب ، 0.5-90 دقيقة: 10٪ ب ، 90-120 دقيقة: 20٪ ب ، 120-130 دقيقة: 28٪ ب ، 130-135 دقيقة: 45٪ ب ، 135-141 دقيقة: 80٪ ب ، 141-155 دقيقة: 5٪ ب.
  3. قم بإجراء الاستحواذ المعتمد على البيانات (DDA) باستخدام نطاق فحص TOF-MS بين 350 إلى 1800 م / ز مع وقت تراكم يبلغ 250 مللي ثانية ووقت استبعاد هدف ديناميكي يبلغ 18 ثانية. بعد ذلك ، قم بإجراء مسح MS / MS عند 100 إلى 1800 م / ز في وضع الحساسية العالية مع وقت تراكم يبلغ 50 مللي ثانية لأفضل 50 سلائف لكل دورة مع عتبة 125 cps لإشارة MS / MS مع حالة شحن من +2 إلى +4.
  4. قم بتحليل البيانات الأولية باستخدام البرامج المشار إليها أو المحركات المتوافقة الأخرى باستخدام قاعدة بيانات مرجعية في FASTA من قاعدة بيانات UniProt المتاحة للجمهور.

Representative Results

يسمح هذا البروتوكول بجمع عينات المسيل للدموع باستخدام شرائط شيرمر التي يتم تخزينها جافة في درجة حرارة الغرفة قبل تحضير العينة لاحقا لتحليل قياس الطيف الكتلي. مكن سير عمل تحضير العينات بمساعدة المرشح (FASP) مع العمود الصغير لمحاصرة التعليق من إعداد سريع للعينة في ساعات ، مقارنة بإجراءات الهضم في المحلول المعتمدة بشكل شائع في الأيام التي تتطلب الحضانة طوال الليل. كان عائد استعادة الببتيد أعلى بكثير (p < 0.001) من بروتوكول الهضم القياسي في المحلول ومع قابلية استنساخ جيدة عند معامل الاختلاف (٪ CV) < 7٪. تم تكرار مجموعة من عينات الدموع في ستة مكررات تقنية مع 74.2 ± استرداد الببتيد بنسبة 5.0٪ واستعادة الببتيد بنسبة 52.8 ± 1.6٪ في العينات المحضرة بإجراءات في المحلول. تم رفع عينة تمزق مجمعة بكمية بروتين تبلغ 36.3 ميكروغرام على شريط شيرمر واستخلاصها كما هو موضح سابقا ، وكانت كفاءة استخراج البروتين 81٪ (29.5 ± 6.8 ميكروغرام ، متوسط ± SD).

قام كلا سير العمل بتحميل 3 ميكروغرام من الببتيدات على MS ، وأسفر بحث DDA عن إجمالي 1183 ± 118 بروتينا (5757 ± 537 ببتيدا متميزا) و 874 ± 70 بروتينا (4400 ± 328 ببتيد) عند 1٪ FDR في مجموعة محاصرة التعليق ومجموعة المحلول ، على التوالي. كشف تحليل أنطولوجيا الجينات (GO) باستخدام نظام تصنيف PANTHER عن بروتينات متشابهة جدا لكلا النهجين ، مع كون الارتباط والنشاط التحفيزي وتنظيم الوظيفة الجزيئية هي وظائفها الجزيئية الرئيسية (الشكل 4).

Figure 1
الشكل 1: ثني الجزء العلوي من شريط شيرمر عند علامة 0 مم قبل التطبيق. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: موضع شريط شيرمر أثناء تجمع الدموع. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: رسم توضيحي لمناولة شريط شيرمر قبل استخلاص البروتين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: مخطط دائري يوضح تحليل الأنطولوجيا الجينية للبروتينات المحددة باستخدام سير العمل في المحلول وسير عمل محاصرة التعليق ، باستخدام نظام تصنيف PANTHER. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Discussion

لتحقيق نتائج دقيقة باستخدام هذه الطريقة ، يجب ارتداء قفازات خالية من الطاقة يمكن التخلص منها في جميع الإجراءات من جمع عينات الدموع لتجنب تلوث العينة. من المهم تجنب الفقاعات والفجوات الهوائية بين المرشح ومحلول العينة في كل خطوة من خلال استخدام أعمدة الغزل الدقيقة. إذا كان حجم العينة أكبر من سعة الأعمدة ، فمن المستحسن تكرار العملية. أثبت هذا البروتوكول أنه أكثر كفاءة من البروتوكول التقليدي في المحلول من حيث وقت التحضير واستعادة البروتين وتحديد البروتين الكلي. ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى أن العينات تخضع لمعظم الإجراءات المطلوبة في نفس العمود ، على عكس طريقة المحلول التي تتضمن خطوات نقل متعددة مثل ترسيب الأسيتون والهضم والتنظيف (التحلية) ، مما يزيد من احتمال حدوث اختلافات في البيانات الناتجة.

بالإضافة إلى عينات المسيل للدموع التي تم جمعها باستخدام طريقة الشعيرات الدموية الدقيقة16,17 ، يوفر سير عمل FASP هذا مع العمود الصغير لمحاصرة التعليق طريقة بديلة لإعداد العينات تسمح بإعداد عينة تمزق سريعة وقوية تم جمعها باستخدام شرائط شيرمر ، مع الحد الأدنى من تحضير المواد وخطوات سهلة الاستخدام يجب اتباعها. وهذا يسمح بإعداد عينة الدموع القابلة للتكرار لدراسات الأتراب الكبيرة عبر أمراض أو حالات العين المتعددة مع تحسين استعادة الببتيد وتحديد البروتين بواسطة مرض التصلب العصبي المتعدد على الإجراءات داخل المحلول. يمكن استخدام هذه العملية الموثوقة بانتظام في تحضير عينات العلامات الحيوية المسيل للدموع لأغراض البحث والأغراض السريرية الأخرى. الأهم من ذلك ، أنه يتطلب الحد الأدنى من تدريب الموظفين للتجميع في الموقع ويلغي الحاجة إلى تخزين العينات في الثلاجة. يتم تجفيف العينات في الموقع لتقليل التحلل الذاتي للبروتين وتدهوره. وبالتالي ، فإن هذا يسمح بالشحن المريح عن طريق البريد لتسهيل التحليل النهائي ، بدلا من استخدام الأنابيب الشعرية الدقيقة.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgments

وحظي هذا العمل بدعم مبادرة إنو هونغ كونغ وحكومة منطقة هونغ كونغ الإدارية الخاصة؛ مركز أبحاث رؤية شارب ؛ ومركز أبحاث ابتكار الطب الصيني (RCMI) في جامعة هونغ كونغ للفنون التطبيقية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
9 mm Plastic Screw Thread Vials Thermo Scientific C4000-11
Acetonitrile, LCMS Grade Anaqua AC-1026
Centrifuge MiniSpin plus Eppendorf 5453000097
DL-dithiothreitol (DTT), BioUltra Sigma-Aldrich 43815
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL Eppendorf 30120086
Formic acid, ACS reagent, ≥96% Sigma-Aldrich 695076
Frame Heater OPTIMONSUN Electronic Breitfeld & Schliekert GmbH 1203166
Iodoacetamide (IAA), BioUltra Sigma-Aldrich I1149
Methanol, HPLC Grade Anaqua MA-1292
Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes, 2 mL Thermo Fisher Scientific 368632
Phosphoric acid, 85 wt.% in H2O Sigma-Aldrich 345245
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo Fisher Scientific 23275
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific A53225
Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry Sciex TripleTOF 6600
Schirmer Ophthalmic Strips Entod Research Cell UK Ltd I-DEW Tearstrips
S-Trap Micro Column Protifi C02-micro-80
SureSTART 9 mm Screw Caps Thermo Scientific CHSC9-40
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M Sigma-Aldrich 18597
Ultra-performance Liquid Chromatography Eksigent NanoLC 400 
UltraPure Sodium dodecyl sulfate (SDS) Thermo Fisher Scientific 15525017

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ma, J. Y. W., Sze, Y. H., Bian, J. F., Lam, T. C. Critical role of mass spectrometry proteomics in tear biomarker discovery for multifactorial ocular diseases (Review). International Journal of Molecular Medicine. 47 (5), 83 (2021).
  2. Tse, J. S. H., et al. Integrating clinical data and tear proteomics to assess efficacy, ocular surface status, and biomarker response after orthokeratology lens wear. Translational Vision Science & Technology. 10 (11), 18 (2021).
  3. Cheung, J. K., et al. Human tear proteome dataset in response to daily wear of water gradient contact lens using SWATH-MS approach. Data in Brief. 36, 107120 (2021).
  4. Tse, J. S., et al. Data on assessment of safety and tear proteome change in response to orthokeratology lens - Insight from integrating clinical data and next generation proteomics. Data in Brief. 29, 105186 (2020).
  5. Zhan, X., Li, J., Guo, Y., Golubnitschaja, O. Mass spectrometry analysis of human tear fluid biomarkers specific for ocular and systemic diseases in the context of 3P medicine. The EPMA Journal. 12 (4), 449-475 (2021).
  6. Ponzini, E., et al. Mass spectrometry-based tear proteomics for noninvasive biomarker discovery. Mass Spectrometry Reviews. 41 (5), 842-860 (2022).
  7. HaileMariam, M., et al. S-Trap, an ultrafast sample-preparation approach for shotgun proteomics. Journal of Proteome Research. 17 (9), 2917-2924 (2018).
  8. Ding, H., et al. Urine proteomics: evaluation of different sample preparation workflows for quantitative, reproducible, and improved depth of analysis. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1857-1862 (2020).
  9. Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
  10. Sze, Y. H., et al. High-pH reversed-phase fractionated neural retina proteome of normal growing C57BL/6 mouse. Scientific Data. 8 (1), 27 (2021).
  11. Marchione, D. M., et al. HYPERsol: High-quality data from archival FFPE tissue for clinical proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (2), 973-983 (2020).
  12. Chhuon, C., et al. A sensitive S-Trap-based approach to the analysis of T cell lipid raft proteome. Journal of Lipid Research. 61 (11), 1512-1523 (2020).
  13. Hayoun, K., et al. Evaluation of sample preparation methods for fast proteotyping of microorganisms by tandem mass spectrometry. Frontiers in Microbiology. 10, 1985 (2019).
  14. Templeton, E. M., et al. Comparison of SPEED, S-Trap, and in-solution-based sample preparation methods for mass spectrometry in kidney tissue and plasma. International Journal of Molecular Sciences. 24 (7), 6290 (2023).
  15. Ding, Z., Wang, N., Ji, N., Chen, Z. S. Proteomics technologies for cancer liquid biopsies. Molecular Cancer. 21 (1), 53 (2022).
  16. Nättinen, J., Aapola, U., Jylhä, A., Vaajanen, A., Uusitalo, H. Comparison of capillary and Schirmer strip tear fluid sampling methods using SWATH-MS proteomics approach. Translational Vision Science & Technology. 9 (3), 16 (2020).
  17. Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: from sampling to preanalytical processing. Scientific Reports. 11 (1), 10064 (2021).

Tags

الطب ، العدد 202 ، السائل المسيل للدموع ، شريط شيرمر ، البروتينات ، قياس الطيف الكتلي
تحضير عينة محاصرة بتعليق البروتين للبروتينات المسيل للدموع بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة - قياس الطيف الكتلي الترادفي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tse, J. S. H., Sze, Y. H., Ka-Wai… More

Tse, J. S. H., Sze, Y. H., Ka-Wai Cheung, J., Li, K. K., Lam, T. C. A Protein Suspension-Trapping Sample Preparation for Tear Proteomics by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (202), e64617, doi:10.3791/64617 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter