Summary
このプロトコルでは、シルマーストリップを使用して涙のサンプルを収集する方法と、非侵襲的な涙蛋白質バイオマーカーを発見するための統合された定量的なワークフローについて説明します。懸濁液トラップサンプル調製ワークフローにより、迅速で頑健な涙液サンプル調製と質量分析が可能になり、標準的な溶液内手順よりも高いペプチド回収率とタンパク質同定が得られます。
Abstract
涙液は、非侵襲的に採取できる簡単にアクセスできる生体液の1つです。涙液プロテオミクスは、いくつかの眼疾患や状態のバイオマーカーを発見する可能性を秘めています。懸濁液トラップカラムは、ダウンストリームのプロテオミクス解析の幅広いアプリケーションのための効率的でユーザーフレンドリーなサンプル前処理ワークフローであることが報告されています。しかし、この戦略は、ヒト涙液プロテオームの解析では十分に研究されていません。本プロトコルは、バイオインフォマティクス分析と組み合わせた場合に疾患バイオマーカーとモニタリングに関する洞察を提供する質量分析を使用した非侵襲的涙液タンパク質バイオマーカー研究のための臨床ヒト涙液サンプルから精製ペプチドへの統合ワークフローを説明しています。タンパク質懸濁液トラップサンプル調製を適用し、ヒト涙液分析用の汎用的で最適化されたサンプル調製として、迅速で再現性が高く、ユーザーフレンドリーな手順で涙液プロテオームを発見したことを実証しました。特に、懸濁液トラップ法は、ペプチド回収率、タンパク質同定、およびサンプル調製時間の短縮の点で、溶液中のサンプル前処理よりも優れていました。
Introduction
涙液プロテオミクスは、眼の疾患や状態1,2,3,4,5,6の潜在的なバイオマーカーを探索し、眼および全身の状態の病因にアクセスし、シルマーストリップを使用した非侵襲的な涙液サンプル収集の利点を活用するために注目を集めています。次世代質量分析法の技術的進歩により、マイクロリットルスケールの涙液中のタンパク質定量が、従来では不可能であった正確かつ精密なものが可能になりました。サンプル調製方法はまだ標準化されていません。涙液タンパク質バイオマーカー研究における臨床応用を成功させるには、堅牢で標準化されたサンプル調製ワークフローが不可欠です。懸濁液トラップ(S-Trap)サンプル前処理ワークフローは、広範なダウンストリームプロテオミクス解析に効果的で高感度なサンプル前処理法として最近報告されました7,8。しかし、この戦略は、ヒト涙液プロテオームの分析では十分に報告されておらず、酵素消化効率と質量分析によるタンパク質同定数の点で、フィルター支援サンプル調製(FASP)および溶液内消化よりも優れています9。S-Trapベースのアプローチは、網膜組織10、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織11、細胞12、微生物13、およびリキッドバイオプシー14,15の調製において実証された。
このプロトコルは、迅速で再現性があり、堅牢な技術戦略を備えた非侵襲的な涙液タンパク質バイオマーカーパネルの発見のために、臨床サンプルから酵素的に消化されたタンパク質までの統合された定量ワークフローを説明しています。簡単に説明すると、涙液を標準的なシルマーストリップを使用して収集し、室温でのタンパク質の自己消化を防ぐために眼科用フレームヒーターで直ちに乾燥させました。包埋された総タンパク質は、メーカーの提案に従って 5% ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)溶解バッファーを使用して抽出し、続いてタンパク質アッセイ測定を行いました。次に、抽出されたライセートをジチオスレイトール(DTT)で標準還元し、ヨードアセトアミド(IAA)でアルキル化しました。
リン酸で酸性化した後、90%メタノールと100 mMの重炭酸トリエチルアンモニウム(TEAB)を含む懸濁トラップカラムタンパク質沈殿バッファーを凝集タンパク質に添加しました。次に、サンプルを新しい懸濁液トラップマイクロカラムに移しました。シーケンシンググレードのトリプシンを1:25の比率(w/w、トリプシン:タンパク質)で47°Cで1時間酵素消化します。次に、得られたペプチドを、50 mM TEAB、0.2% ギ酸水溶液(FA)、および 0.2% FA を含む 50% アセトニトリル(ACN)で順次遠心分離により溶出しました。溶出したペプチドを真空乾燥し、0.1%FAで再溶解した。ペプチド濃度を測定し、質量分析用に 0.5 μg/μL に調整しました。
Protocol
被験者は、研究に参加する前に書面によるインフォームドコンセントを提供しました。この研究は、香港理工大学の人間倫理委員会によって承認され、ヘルシンキ宣言の原則を遵守しました。
1. シルマーストリップによるヒト涙液の採取
- サンプルの汚染を避けるために、手袋を着用し、消毒してください。
- 内側のパッケージが無傷で、滅菌済みで、有効期限が切れていないことを確認してください。
- シルマーストリップの上部を、ストリップの半円の先端付近に示されているように、0mmのマークでわずかに内側に曲げます(図1)。
- ストリップの端を持ってストリップを内側のパッケージから取り出し、0〜25mmのサンプル収集領域に直接接触しないようにします。
- 被写体に、配置するストリップの位置から目をそらすように指示します。
- 下まぶたを静かに引き下げ、ストリップの端を外側眼窩領域近くの下部円蓋に引っ掛けます(図2)。もう一方の目も同じ手順を繰り返します。
- 刺激を最小限に抑えるために、被験者にまぶたをそっと閉じるように依頼します。
- 約5分間、または好ましくは15〜20mmの涙液を採取し、涙液サンプルを採取した。
- 被験者に両目を開けてもらい、下まぶたをそっと引き下げて、被験者からストリップを取り除きます。
- シルマーストリップの水和長さを検査し、収集量をmm単位で記録します。
- 液体が完全に乾くまで、標準の清潔なフレームヒーターでストリップを乾かします。
注意: ろ紙を焦がす可能性のある過度の加熱は避けてください。 - 乾燥した各シルマーストリップをラベル付きのクライオチューブに挿入し、さらに処理するまで暗所の涼しく乾燥した場所に保管してください。
2. 薬品・試薬の調製
- 溶解バッファー(5% SDS、50 mM TEAB、pH 7.5)、20 mL
- 1 mL の 1 M TEAB と 80 μL の 12% リン酸をピペットでつなぎます。ボルテックスと超音波処理を短時間行い、気泡を除去します。最大20 mLに脱イオン水を補充します。
- 1 g の SDS を秤量し、溶解するまで振動しながら溶液に加えます。
- タンパク質沈殿バッファー(90%メタノール、100 mM TEAB、pH 7.1)、10 mL
- 893 μL の 1 M TEAB と 92 μL の脱イオン水を加えます。
- 15 μL の 85 wt. % リン酸と 9 mL のメタノールを溶液に加え、短時間ボルテックスします。
- 消化バッファー(50 mM TEAB)、1 mL
- 50 μL の 1 M TEAB を加え、1 mL まで脱イオン水を補充します。
- 200 mM ジチオスレイトール(DTT)溶液、500 μL
- 15 mgのDTTを秤量し、500 μLの脱イオン水に溶解します。ボルテックスを簡潔に。
注意: 使用前に準備してください。
- 15 mgのDTTを秤量し、500 μLの脱イオン水に溶解します。ボルテックスを簡潔に。
- 400 mM ヨードアセトアミド(IAA)溶液、200 μL
- 15 mg の IAA を秤量し、200 μL の脱イオン水に溶解します。ボルテックスを簡潔に。注意: 使用前に準備し、光を避けてください。
- 0.2% ギ酸, 50% アセトニトリル, 10 mL
- 脱イオン水に 50% アセトニトリル 10 mL を調製します。
- 20 μLのギ酸を加え、短時間ボルテックスします。
- 0.2% ギ酸溶液、10 mL
- 20 μLのギ酸を10 mLの脱イオン水に加え、短時間ボルテックスします。
- 0.1% ギ酸溶液、10 mL
- 10 mLの脱イオン水に10 μLのギ酸を加えます。ボルテックスを簡潔に。
3. シルマーストリップでのタンパク質抽出
- ストリップの0mmマークを超えて前端を切断して廃棄し、結膜組織と清潔なステンレス鋼のはさみとの接触による潜在的な汚染を取り除きます。
- ストリップを1mm間隔でカットし、1.5 mLの微量遠心チューブに入れます(図3)。
- 100 μLの溶解バッファーを微量遠心チューブに加え、1,000rpm、室温でサーモミキサーで1時間ボルテックスします。
- 短時間遠心分離し、上清を新しい1.5 mL微量遠心チューブに移します。
- 清潔な鉗子を使用して、ストリップを200 μLのピペットチップに移します。チップをホルダー付きでステップ3.4と同じチューブに入れ、室温で4,000 × g でさらに1分間遠心分離し、ストリップ上の残りのサンプルを最大限回収します。
- ビシンコニン酸(BCA)または適合性タンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を測定します。
4. 懸濁液捕捉サンプル調製
- タンパク質アッセイ結果に基づいて、サンプルを 50 μg のタンパク質に正規化します。
- 200 mM DTT を 1:10 (v/v、DTT: サンプル) の比率で添加し、最終濃度 20 mM DTT になるようにし、95 °C で 10 分間インキュベートします。
- タンパク質溶液を室温まで冷却します。
- 400 mM IAA を 1:10 の比率で添加し(v/v、IAA: サンプル)、最終濃度 40 mM IAA とし、暗所で室温で 10 分間インキュベートします。
- 12%リン酸水溶液を1:10(v/v、酸:サンプル)の比率で加え、最終濃度が1.2%のリン酸になるようにし、短時間ボルテックスします。
- タンパク質結合バッファーを1:6の比率で添加し(v/v、サンプル:バッファー)、短時間ボルテックスします。
注:このステップでは、コロイド状のタンパク質粒子が形成され、タンパク質量が十分な場合、溶液は半透明に見えます。 - 懸濁液トラッピングマイクロスピンカラムのキャップを外し、スピンカラムを 2 mL の微量遠心チューブに組み立ててフロースルーを回収します。
- 最大 200 μL の酸性タンパク質ライセート混合物をカラムに添加します。
- カラムを 4,000 × g で 20 秒間遠心分離します。タンパク質微粒子が捕捉されました。サンプルがカラムにロードされるまで繰り返します。
- タンパク質結合バッファー150 μLを添加し、4,000 × g で20秒間遠心分離して、懸濁タンパク質を洗浄します。これを3回繰り返します。
- 懸濁液トラップマイクロカラムを新しい 1.5 mL 微量遠心チューブに組み立てます。
- プロテアーゼを含む50 mM TEAB消化バッファー20 μLを1:25(w/w、トリプシン:タンパク質)の比率でスピンカラム内のフィルターに添加し、フィルターと消化溶液の間に気泡やエアギャップが生じないようにします。
- 懸濁液トラップマイクロスピンカラムにキャップをして、蒸発を防ぎます。サーモミキサーで47°Cで1時間インキュベートします。消化中に振ったり渦を巻いたりしないでください。
- 40 μL の 50 mM TEAB で、4,000 × g の遠心力で 20 秒間ペプチドを溶出します。
- 40 μL の 0.2% FA を加え、4,000 × g で 20 秒間遠心分離します。
- 35 μL の 0.2% FA、50% アセトニトリルを加え、4,000 × g で 20 秒間遠心分離します。
- 3つの溶出液をプールし、真空遠心分離機で乾燥させます。
- さらに分析するまで、-80°Cの超低温冷凍庫で保管してください。注: プロトコルはここで一時停止できます。
5. 質量分析のためのペプチドの再構成
- 12 μL の 0.1% FA でサンプルを再溶解し、ボルテックスし、遠心分離機に短時間かけます。
- ペプチドアッセイキットでペプチド濃度を測定します。
- ペプチド濃度を 0.1% FA で 0.5 μg/μL に正規化します。
- ペプチド混合物をオートサンプラーバイアルに移し、質量分析の準備を整えます。
6. 液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析によるサンプル取得
- 3 μgのペプチドをアイソクラティックローディングバッファー(0.1% FA、5% ACN)とともにトラップカラム(C18、5 μm、100 μm、20 mm)に流速2 μL/分で15分間ロードします。
- 逆相ナノ分析カラム(C18、5 μm、100 μm、300 mm)を使用して、流速350 nL/分、155分の分離グラジエントでペプチドを分画します。0.1% ギ酸(v/v)、5% ACN(v/v)の混合液を含む移動相 A と、水中に 0.1% FA(v/v)、98% ACN(v/v)を含む移動相 B を使用します。0-0.5分:5%B、0.5-90分:10%B、90-120分:20%B、120-130分:28%B、130-135分:45%B、135-141分:80%B、141-155分:5%B。
- 350 〜 1800 m/z の TOF-MS スキャン範囲で、累積時間 250 ms、動的ターゲット除外時間 18 秒でデータ依存性取得 (DDA) を実行します。次に、100 から 1,800 m/z の高感度モードで、上位 50 の前駆体に対して 50 ミリ秒の累積時間、+2 から +4 の充電状態の MS/MS シグナルに対して 125 cps のしきい値で MS/MS スキャンを実行します。
- 一般にアクセス可能なUniProtデータベースからFASTAのリファレンスデータベースを使用して、参照ソフトウェアまたはその他の互換性のあるエンジンを使用して生データを分析します。
Representative Results
このプロトコルでは、質量分析のためのサンプル調製を行う前に、室温で乾燥して保存されたシルマーストリップで涙液サンプルを採取することができます。懸濁液トラップマイクロカラムを用いたフィルター支援サンプル前処理(FASP)ワークフローにより、一晩のインキュベーションを必要とする一般的な溶液内消化手順が数日かかるのに対し、数時間で迅速なサンプル前処理が可能になりました。ペプチド回収率は、標準的な溶液内消化プロトコルよりも有意に高く(p < 0.001)、変動係数(%CV)< 7% で良好な再現性を示しました。涙液サンプルのプールを 6 回のテクニカルレプリケートで繰り返し、溶液内手順で調製したサンプルで 74.2 ± 5.0% のペプチド回収率と 52.8 ± 1.6% のペプチド回収率を達成しました。タンパク質量36.3μgのプールされた涙液サンプルをシルマーストリップにスパイクし、前述のように抽出したところ、タンパク質の抽出効率は81%(29.5±6.8μg、平均±SD)でした。
どちらのワークフローでも MS に 3 μg のペプチドをロードし、DDA 検索では、懸濁トラップ群と溶液内群でそれぞれ 1% FDR で合計 1,183 ± 118 タンパク質(5,757 ± 537 の異なるペプチド)と 874 ± 70 タンパク質(4,400 ± 328 ペプチド)が得られました。PANTHER分類システムを用いた遺伝子オントロジー(GO)の解析では、結合、触媒活性、分子機能調節が主な分子機能であり、両方のアプローチで非常に類似したプロテオームが明らかになりました(図4)。
図1:塗布前にシルマーストリップの上部を0mmのマークで曲げます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:涙液採取時のシルマーストリップの位置。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:タンパク質抽出前のシルマーストリップ処理の図。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:PANTHER分類システムを用いて、溶液内ワークフローおよび懸濁液トラップワークフローを用いて同定されたプロテオームの遺伝子オントロジー解析を示す円グラフ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
Discussion
この方法を使用して正確な結果を得るには、サンプルの汚染を避けるために、涙液サンプルの採取からすべての手順でパワーフリーの使い捨て手袋を着用する必要があります。各ステップでフィルターとサンプル溶液の間に気泡やエアギャップが生じないようにするには、マイクロスピニングカラムを使用することが重要です。サンプル量がカラムの容量よりも大きい場合は、このプロセスを繰り返すことをお勧めします。このプロトコルは、調製時間、タンパク質回収率、および総タンパク質同定の点で、従来の溶液内プロトコルよりも効率的であることが証明されています。これは主に、アセトンの沈殿、分解、クリーンアップ(脱塩)などの複数の転写ステップを含む溶液内分析法とは異なり、サンプルが同じカラムで必要な手順のほとんどを経るため、結果のデータにばらつきが生じる可能性が高くなるためです。
マイクロキャピラリー法16,17で採取された涙液サンプルに加えて、懸濁液トラップマイクロカラムを用いたこのfaspワークフローは、最小限の材料前処理とユーザーフレンドリーな手順で、シルマーストリップを使用して収集した涙液サンプルを迅速かつ堅牢に調製できる代替サンプル前処理法を提供します。これにより、複数の眼疾患や状態にわたる大規模なコホート研究において、再現性のある涙液サンプルの調製が可能になり、ペプチドの回収率が向上し、溶液内手順よりもMSによるタンパク質の同定が向上します。この信頼性の高いプロセスは、研究用やその他の臨床目的での涙液バイオマーカーサンプルの調製に定期的に利用することができます。最も重要なのは、現場での採取に必要なスタッフのトレーニングが最小限で済み、サンプルを冷凍庫に保管する必要がないことです。サンプルは、タンパク質の自己分解と分解を最小限に抑えるために、その場で乾燥されます。したがって、これにより、マイクロキャピラリーチューブを使用するのとは対照的に、ダウンストリーム分析を容易にするための郵送による便利な出荷が可能になります。
Disclosures
著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この作業は、InnoHKイニシアチブと香港特別行政区政府の支援を受けました。SHARPビジョン研究センター;香港理工大学の中国医学イノベーション研究センター(RCMI)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9 mm Plastic Screw Thread Vials | Thermo Scientific | C4000-11 | |
| Acetonitrile, LCMS Grade | Anaqua | AC-1026 | |
| Centrifuge MiniSpin plus | Eppendorf | 5453000097 | |
| DL-dithiothreitol (DTT), BioUltra | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Formic acid, ACS reagent, ≥96% | Sigma-Aldrich | 695076 | |
| Frame Heater OPTIMONSUN Electronic | Breitfeld & Schliekert GmbH | 1203166 | |
| Iodoacetamide (IAA), BioUltra | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol, HPLC Grade | Anaqua | MA-1292 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes, 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 368632 | |
| Phosphoric acid, 85 wt.% in H2O | Sigma-Aldrich | 345245 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry | Sciex | TripleTOF 6600 | |
| Schirmer Ophthalmic Strips | Entod Research Cell UK Ltd | I-DEW Tearstrips | |
| S-Trap Micro Column | Protifi | C02-micro-80 | |
| SureSTART 9 mm Screw Caps | Thermo Scientific | CHSC9-40 | |
| Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M | Sigma-Aldrich | 18597 | |
| Ultra-performance Liquid Chromatography | Eksigent | NanoLC 400 | |
| UltraPure Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 |
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