Summary
Denne protokollen beskriver en metode for innsamling av tåreprøver ved hjelp av Schirmer-strimler og en integrert kvantitativ arbeidsflyt for å oppdage ikke-invasive tåreproteinbiomarkører. Arbeidsflyten for klargjøring av suspensjonsprøver muliggjør rask og robust fremstilling av tåreprøver og massespektrometrisk analyse, noe som resulterer i høyere peptidgjenvinningsutbytte og proteinidentifikasjon enn standard prosedyrer i løsningen.
Abstract
Tårevæske er en av de lett tilgjengelige biofluidene som kan samles ikke-invasivt. Tåreproteomikk har potensial til å oppdage biomarkører for flere okulære sykdommer og tilstander. Suspensjonskolonnen for overlapping har blitt rapportert å være en effektiv og brukervennlig arbeidsflyt for prøveklargjøring for bred anvendelse av nedstrøms proteomisk analyse. Likevel har denne strategien ikke blitt godt studert i analysen av humant tåreproteom. Den nåværende protokollen beskriver en integrert arbeidsflyt fra kliniske humane tåreprøver til rensede peptider for ikke-invasiv tåreproteinbiomarkørforskning ved hjelp av massespektrometri, som gir innsikt i sykdomsbiomarkører og overvåking når kombinert med bioinformatikkanalyse. En proteinsuspensjonsfangstprøvepreparering ble påført og demonstrerte oppdagelsen av tåreproteom med raske, reproduserbare og brukervennlige prosedyrer, som et universelt, optimalisert prøvepreparat for human tårevæskeanalyse. Spesielt utkonkurrerte suspensjonsfangstprosedyren prøvepreparering i løsningen når det gjelder peptidgjenvinning, proteinidentifikasjon og kortere prøveprepareringstid.
Introduction
Tåreproteomikk har fått oppmerksomhet for å utforske potensielle biomarkører for okulære sykdommer og tilstander 1,2,3,4,5,6, for å få tilgang til patogenesen av den okulære og systemiske tilstanden, samt å utnytte fordelen med ikke-invasiv tåreprøvesamling ved hjelp av Schirmer-strimler. Den teknologiske utviklingen av neste generasjons massespektrometri har muliggjort proteinkvantifisering i mikroliterskala tårer med nøyaktighet og presisjon som ikke var mulig tidligere. Prøveprepareringsmetoder er ennå ikke standardisert. En robust og standardisert arbeidsflyt for prøvepreparering er avgjørende for å lykkes med klinisk anvendelse i forskning på tåreproteinbiomarkører. Arbeidsflyten for prøvepreparering av suspensjonsfangst (S-Trap) ble nylig rapportert som en effektiv og sensitiv prøveprepareringsmetode for bred nedstrøms proteomisk analyse 7,8. Likevel har denne strategien ikke blitt godt rapportert i analysen av humant tåreproteom, utkonkurrert filterstøttet prøvepreparering (FASP) og fordøyelse i løsningen når det gjelder enzymatisk fordøyelseseffektivitet og større antall proteinidentifikasjon ved massespektrometrisk analyse9. Den S-Trap-baserte tilnærmingen ble demonstrert i fremstillingen av retinalt vev 10, formalinfiksert, parafininnebygd (FFPE) vev 11, celler 12, mikroorganisme 13 og flytende biopsier14,15.
Denne protokollen beskriver en integrert kvantitativ arbeidsflyt fra kliniske prøver til enzymatisk fordøyd protein for oppdagelsen av et ikke-invasivt tåreproteinbiomarkørpanel med en rask, reproduserbar og robust teknisk strategi. Kort fortalt ble tårevæske samlet opp ved hjelp av en standard Schirmer-strimmel og umiddelbart tørket med en oftalmisk rammevarmer for å forhindre proteinautolyse ved romtemperatur. Innebygde totale proteiner ble ekstrahert ved bruk av 5% natriumdodecylsulfat (SDS) lysisbuffer i henhold til produsentens forslag, etterfulgt av proteinanalysemåling. Det ekstraherte lysatet gjennomgikk deretter standard reduksjon med dithiothreitol (DTT) og alkylering med jodoacetamid (IAA).
Etter forsuring med fosforsyre ble suspensjonsfangstkolonneproteinutfellingsbuffer inneholdende 90 % metanol og 100 mM trietylammoniumbikarbonat (TEAB) tilsatt aggregerte proteiner. Prøven ble deretter overført til en ny suspensjonsfangstmikrokolonne. Enzymatisk fordøyelse med trypsin av sekvenseringsgrad i forholdet 1:25 (w/w, trypsin: protein) ved 47 °C i 1 time. De resulterende peptidene ble deretter eluert via sentrifugering, sekvensielt med 50 mM TEAB, 0,2 % vandig maursyre (FA) og 50 % acetonitril (ACN) inneholdende 0,2 % FA. De eluerte peptidene ble vakuumtørket og rekonstituert i 0,1 % FA. Peptidkonsentrasjonen ble målt og justert til 0,5 μg/μL for massespektrometrisk analyse.
Protocol
Forsøkspersonene ga skriftlig informert samtykke før deltakelse i studien. Studien ble godkjent av Human Ethics Committee of The Hong Kong Polytechnic University og fulgte prinsippene i Helsinkideklarasjonen.
1. Oppsamling av human tårevæske med Schirmer-stripe
- Bruk hansker og desinfiser for å unngå prøveforurensning.
- Kontroller at den indre emballasjen er intakt, steril og ikke utløpt.
- Bøy toppen av Schirmer-stripen litt innover ved 0 mm-merket, som angitt nær halvsirkelspissen av stripen (figur 1).
- Fjern stripen fra den indre pakningen ved å holde enden av stripen, og unngå direkte kontakt med prøveoppsamlingsområdet fra 0 til 25 mm.
- Be motivet om å se bort fra posisjonen til stripen som skal plasseres.
- Trekk forsiktig ned det nedre øyelokket og hekt enden av strimmelen i nedre fornix nær den laterale kantusregionen (figur 2). Gjenta samme prosedyre på det andre øyet.
- Be motivet om å lukke øyelokkene forsiktig for å minimere irritasjon.
- Samle tårevæske i ca 5 min eller helst 15-20 mm tåreprøve ble samlet.
- Be motivet om å åpne begge øynene, trekk forsiktig ned det nedre øyelokket og fjern strimlene fra motivet.
- Inspiser den hydrerte lengden på Schirmer-stripen og registrer den oppsamlede mengden i mm.
- Tørk stripen med en standard, ren rammevarmer til væsken er helt tørr.
MERK: Overflødig oppvarming som potensielt kan røye filterpapiret bør unngås. - Sett hver tørkede Schirmer-strimmel inn i et merket kryorør og oppbevar det helst på et kjølig, tørt sted i mørket til videre behandling.
2. Fremstilling av kjemikalier og reagenser
- lysisbuffer (5 % SDS, 50 mM TEAB, pH 7,5), 20 ml
- Pipett 1 ml 1 M TEAB og 80 μL 12% fosforsyre. Vortex og sonicate kort for å fjerne bobler. Fyll på opptil 20 ml med avionisert vann.
- Vei 1 g SDS og tilsett oppløsningen med oscillasjon til den er oppløst.
- Proteinutfellingsbuffer (90 % metanol, 100 mM TEAB, pH 7,1), 10 ml
- Tilsett 893 μL 1 M TEAB og 92 μL avionisert vann.
- Tilsett 15 μL 85 vekt% fosforsyre og 9 ml metanol til løsningen og virvel kort.
- Fordøyelsesbuffer (50 mM TEAB), 1 ml
- Tilsett 50 μL 1 M TEAB og fyll opp til 1 ml med avionisert vann.
- 200 mM dithiothreitol (DTT) oppløsning, 500 μL
- Veie 15 mg DTT og oppløses i 500 μL avionisert vann; Vortex kort.
MERK: Forbered før bruk.
- Veie 15 mg DTT og oppløses i 500 μL avionisert vann; Vortex kort.
- 400 mM jodoacetamid (IAA) oppløsning, 200 mikrol
- Veie 15 mg IAA og oppløses i 200 μL avionisert vann; Vortex kort. MERK: Forbered før bruk og unngå lys.
- 0,2% maursyre, 50% acetonitril, 10 ml
- Tilbered 10 ml 50% acetonitril i avionisert vann.
- Tilsett 20 μL maursyre og hvirvel kort.
- 0,2 % maursyreoppløsning, 10 ml
- Tilsett 20 μL maursyre til 10 ml avionisert vann og virvel kort.
- 0,1 % maursyreoppløsning, 10 ml
- Tilsett 10 μL maursyre til 10 ml avionisert vann; Vortex kort.
3. Proteinekstraksjon i Schirmer-strimmel
- Klipp og kast frontenden utover 0 mm-merket på stripen for å fjerne potensiell forurensning på grunn av kontakt med konjunktivvev med ren saks i rustfritt stål.
- Skjær brettet i intervaller på 1 mm i et mikrosentrifugerør på 1,5 ml (figur 3).
- Tilsett 100 μL lysisbuffer til mikrosentrifugerøret, og virvel ved 1000 o / min, romtemperatur i 1 time i en termomixer.
- Sentrifuge kort og overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Flytt strimlene inn i 200 μL pipettespisser med rene tang. Plasser spissene i samme rør fra trinn 3.4 med holder og sentrifuge ved romtemperatur ved 4000 × g i ytterligere 1 min for maksimal gjenvinning av den gjenværende prøven på brettet.
- Mål proteinkonsentrasjonen ved hjelp av bicinchoninsyre (BCA) eller kompatibel proteinanalyse.
4. Suspensjon-fangst prøveklargjøring
- Normaliser prøver til 50 μg protein basert på proteinanalyseresultatet.
- Tilsett 200 mM DTT i forholdet 1:10 (v/v, DTT: prøve) til en endelig konsentrasjon på 20 mM DTT og inkuber ved 95 °C i 10 minutter.
- Avkjøl proteinoppløsningen til romtemperatur.
- Tilsett 400 mM IAA i forholdet 1:10 (v/v, IAA: prøve) til en endelig konsentrasjon på 40 mM IAA og inkuber i mørket ved romtemperatur i 10 minutter.
- Tilsett 12% vandig fosforsyre i forholdet 1:10 (v / v, syre: prøve) til en endelig konsentrasjon på 1,2% fosforsyre og virvel kort.
- Legg til proteinbindingsbuffer i forholdet 1: 6 (v / v, prøve: buffer) og vortex kort.
MERK: I dette trinnet skal kolloidalt proteinpartikler dannes, og løsningen vil virke gjennomskinnelig hvis proteinmengden er tilstrekkelig. - Fjern hetten på suspensjonsfangsten av mikrospinnkolonnen og monter sentrifugerøret på et 2 ml mikrosentrifugerør for å samle gjennomstrømning.
- Tilsett opptil 200 μL surgjort proteinlysatblanding i kolonnen.
- Sentrifuge kolonnen ved 4000 × g i 20 s. Proteinpartikler ble fanget; Gjenta til prøvene er lastet inn i kolonnen.
- Tilsett 150 μL proteinbindingsbuffer og sentrifuge ved 4000 × g i 20 s for å vaske det suspenderte proteinet. Gjenta 3x.
- Monter mikrokolonnen for suspensjonsoverlapping på et nytt mikrosentrifugerør på 1,5 ml.
- Tilsett 20 μL av 50mM TEAB fordøyelsesbuffer som inneholder protease i forholdet 1:25 (w / w, trypsin: protein) på filteret inne i spinnkolonnen, unngå bobler og luftgap mellom filteret og fordøyelsesløsningen.
- Sett lokk på suspensjonsfangsten av mikrospinnkolonnen for å forhindre fordampning. Inkuber ved 47 °C i 1 time i en thermomixer; Ikke rist eller virvel under fordøyelsen.
- Elute peptider med 40 μL av 50 mM TEAB ved sentrifugalkraft ved 4000 × g i 20 s.
- Tilsett 40 μL med 0,2% FA og sentrifuge ved 4000 × g i 20 s.
- Tilsett 35 μL med 0,2% FA, 50% acetonitril og sentrifuge ved 4000 × g i 20 s.
- Basseng tre eluates og tørk med en vakuum sentrifuge.
- Oppbevares ved -80 °C ultra-lav temperatur fryser inntil videre analyse. MERK: Protokollen kan settes på pause her.
5. Rekonstituer peptider for analyse av massespektrometri
- Rekonstituer prøven med 12 μL 0,1 % FA, virvel og sentrifuge kort.
- Mål peptidkonsentrasjon med et Peptide Assay Kit.
- Normaliser peptidkonsentrasjonen til 0,5 μg / μL i 0,1% FA.
- Overfør peptidblandingen til et hetteglass med automatisk prøvetaker og klar for analyse av massespektrometri.
6. Prøveinnsamling ved væskekromatografi-tandemmassespektrometri
- Last 3 μg av peptidet med isokratisk lastbuffer (0,1 % FA, 5 % ACN) til en fellesøyle (C18, 5 μm, 100 μm, 20 mm) med en strømningshastighet på 2 μL/min i 15 minutter.
- Fraksjoner peptidene ved hjelp av en omvendt fase nanoanalytisk kolonne (C18, 5 μm, 100 μm, 300 mm) ved en strømningshastighet på 350 nL / min i en 155 minutters separasjonsgradient. Bruk mobilfase A som består av en blanding av 0,1 % maursyre (v/v), 5 % ACN (v/v) i vann og mobilfase B som inneholder 0,1 % FA (v/v), 98 % ACN (v/v) i vann. Bruk følgende stigning: 0-0,5 min: 5% B, 0,5-90 min: 10% B, 90-120 min: 20% B, 120-130 min: 28% B, 130-135 min: 45% B, 135-141 min: 80% B, 141-155 min: 5% B.
- Utfør dataavhengig innsamling (DDA) med et TOF-MS-skanneområde mellom 350 og 1800 m/z med en akkumuleringstid på 250 ms og en dynamisk målekskluderingstid på 18 s. Deretter utfører du en MS / MS-skanning ved 100 til 1,800 m / z i høysensitivitetsmodus med en akkumuleringstid på 50 ms for de 50 beste forløperne per syklus med en terskel på 125 cps for MS / MS-signal med en ladetilstand fra +2 til +4.
- Analyser rådata med den refererte programvaren eller andre kompatible motorer med en referansedatabase i FASTA fra den offentlig tilgjengelige UniProt-databasen.
Representative Results
Denne protokollen tillater riveprøvetaking med Schirmer-strimler som lagres tørt ved romtemperatur før påfølgende prøvepreparering for massespektrometrianalyse. Arbeidsflyt for filterassistert prøvepreparering (FASP) med mikrokolonne for suspensjonsfangst muliggjorde rask prøveklargjøring i løpet av timer, sammenlignet med vanlige fordøyelsesprosedyrer i løsningen på dager som krever inkubasjon over natten. Peptidutvinningsutbyttet var signifikant høyere (p < 0,001) enn standard protokoll for fordøyelse i løsningen og med god reproduserbarhet ved en variasjonskoeffisient (% CV) < 7%. En pool av tåreprøver ble gjentatt i seks tekniske replikater med 74,2 ± 5,0% peptidutvinning og 52,8 ± 1,6% peptidgjenvinning i prøver fremstilt med prosedyrer i oppløsning. En samlet tåreprøve med en proteinmengde på 36,3 μg ble pigget på Schirmer-strimmelen og ekstrahert som tidligere beskrevet, ekstraksjonseffektiviteten av protein var 81% (29,5 ± 6,8 μg, gjennomsnittlig ± SD).
Begge arbeidsflytene lastet 3 μg peptider på MS, og DDA-søket ga totalt 1.183 ± 118 proteiner (5.757 ± 537 forskjellige peptider) og 874 ± 70 proteiner (4.400 ± 328 peptider) ved 1% FDR i henholdsvis suspensjonsfangstgruppen og løsningsgruppen. Analyse av genontologi (GO) ved hjelp av PANTHER-klassifikasjonssystemet viste svært like proteomer for begge tilnærminger, med binding, katalytisk aktivitet og molekylær funksjonsregulering som deres viktigste molekylære funksjoner (figur 4).
Figur 1: Bøy toppen av Schirmer-stripen ved 0 mm-merket før påføring. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Schirmer-stripens posisjon under riveoppsamling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Illustrasjon av Schirmers strimmelhåndtering før proteinekstraksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Sektordiagram som illustrerer genontologisk analyse for proteomene identifisert ved hjelp av arbeidsflyten i løsningen og arbeidsflyten for suspensjonsfangst, ved hjelp av PANTHER-klassifiseringssystemet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
For å oppnå nøyaktige resultater ved hjelp av denne metoden, bør strømfrie engangshansker brukes i alle prosedyrer fra riveprøveinnsamling for å unngå prøveforurensning. Det er viktig å unngå bobler og luftspalter mellom filteret og prøveløsningen i hvert trinn ved å bruke mikrospinnende kolonner. Hvis prøvevolumet er større enn kapasiteten til kolonnene, anbefales det å gjenta prosessen. Denne protokollen har vist seg å være mer effektiv enn den tradisjonelle protokollen i løsningen når det gjelder forberedelsestid, proteingjenoppretting og total proteinidentifikasjon. Dette skyldes i stor grad at prøvene gjennomgår de fleste av de nødvendige prosedyrene i samme kolonne, i motsetning til løsningsmetoden som involverer flere overføringstrinn som acetonutfelling, fordøyelse og opprydding (avsalting), noe som øker sannsynligheten for variasjoner i de resulterende dataene.
I tillegg til tåreprøvene samlet inn med mikrokapillærmetoden16,17, gir denne FASP-arbeidsflyten med suspensjonsfangende mikrokolonne en alternativ prøveprepareringsmetode som muliggjør rask og robust tåreprøvepreparering samlet inn ved hjelp av Schirmer-strimler, med minimal materialforberedelse og brukervennlige trinn å følge. Dette tillater reproduserbar tåreprøveforberedelse for store kohortstudier på tvers av flere okulære sykdommer eller tilstander med forbedret peptidutvinning og proteinidentifikasjon av MS over prosedyrer i løsningen. Denne pålitelige prosessen kan brukes regelmessig i utarbeidelsen av tårebiomarkørprøver for forskning og andre kliniske formål. Viktigst av alt, det krever minimal opplæring av personalet for innsamling på stedet og negerer behovet for prøvelagring i en fryser. Prøvene tørkes på stedet for å minimere proteinautolyse og nedbrytning. Derfor tillater dette praktisk forsendelse via post for å lette nedstrømsanalyse, i motsetning til å bruke mikrokapillærrør.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av InnoHK-initiativet og Hong Kong Special Administrative Region Government; Forskningssenter for SHARP Vision; og Research Centre for Chinese Medicine Innovation (RCMI) ved Hong Kong Polytechnic University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9 mm Plastic Screw Thread Vials | Thermo Scientific | C4000-11 | |
| Acetonitrile, LCMS Grade | Anaqua | AC-1026 | |
| Centrifuge MiniSpin plus | Eppendorf | 5453000097 | |
| DL-dithiothreitol (DTT), BioUltra | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Formic acid, ACS reagent, ≥96% | Sigma-Aldrich | 695076 | |
| Frame Heater OPTIMONSUN Electronic | Breitfeld & Schliekert GmbH | 1203166 | |
| Iodoacetamide (IAA), BioUltra | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol, HPLC Grade | Anaqua | MA-1292 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes, 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 368632 | |
| Phosphoric acid, 85 wt.% in H2O | Sigma-Aldrich | 345245 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry | Sciex | TripleTOF 6600 | |
| Schirmer Ophthalmic Strips | Entod Research Cell UK Ltd | I-DEW Tearstrips | |
| S-Trap Micro Column | Protifi | C02-micro-80 | |
| SureSTART 9 mm Screw Caps | Thermo Scientific | CHSC9-40 | |
| Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M | Sigma-Aldrich | 18597 | |
| Ultra-performance Liquid Chromatography | Eksigent | NanoLC 400 | |
| UltraPure Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 |
References
- Ma, J. Y. W., Sze, Y. H., Bian, J. F., Lam, T. C. Critical role of mass spectrometry proteomics in tear biomarker discovery for multifactorial ocular diseases (Review). International Journal of Molecular Medicine. 47 (5), 83 (2021).
- Tse, J. S. H., et al. Integrating clinical data and tear proteomics to assess efficacy, ocular surface status, and biomarker response after orthokeratology lens wear. Translational Vision Science & Technology. 10 (11), 18 (2021).
- Cheung, J. K., et al. Human tear proteome dataset in response to daily wear of water gradient contact lens using SWATH-MS approach. Data in Brief. 36, 107120 (2021).
- Tse, J. S., et al. Data on assessment of safety and tear proteome change in response to orthokeratology lens - Insight from integrating clinical data and next generation proteomics. Data in Brief. 29, 105186 (2020).
- Zhan, X., Li, J., Guo, Y., Golubnitschaja, O. Mass spectrometry analysis of human tear fluid biomarkers specific for ocular and systemic diseases in the context of 3P medicine. The EPMA Journal. 12 (4), 449-475 (2021).
- Ponzini, E., et al. Mass spectrometry-based tear proteomics for noninvasive biomarker discovery. Mass Spectrometry Reviews. 41 (5), 842-860 (2022).
- HaileMariam, M., et al. S-Trap, an ultrafast sample-preparation approach for shotgun proteomics. Journal of Proteome Research. 17 (9), 2917-2924 (2018).
- Ding, H., et al. Urine proteomics: evaluation of different sample preparation workflows for quantitative, reproducible, and improved depth of analysis. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1857-1862 (2020).
- Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
- Sze, Y. H., et al. High-pH reversed-phase fractionated neural retina proteome of normal growing C57BL/6 mouse. Scientific Data. 8 (1), 27 (2021).
- Marchione, D. M., et al. HYPERsol: High-quality data from archival FFPE tissue for clinical proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (2), 973-983 (2020).
- Chhuon, C., et al. A sensitive S-Trap-based approach to the analysis of T cell lipid raft proteome. Journal of Lipid Research. 61 (11), 1512-1523 (2020).
- Hayoun, K., et al. Evaluation of sample preparation methods for fast proteotyping of microorganisms by tandem mass spectrometry. Frontiers in Microbiology. 10, 1985 (2019).
- Templeton, E. M., et al. Comparison of SPEED, S-Trap, and in-solution-based sample preparation methods for mass spectrometry in kidney tissue and plasma. International Journal of Molecular Sciences. 24 (7), 6290 (2023).
- Ding, Z., Wang, N., Ji, N., Chen, Z. S. Proteomics technologies for cancer liquid biopsies. Molecular Cancer. 21 (1), 53 (2022).
- Nättinen, J., Aapola, U., Jylhä, A., Vaajanen, A., Uusitalo, H. Comparison of capillary and Schirmer strip tear fluid sampling methods using SWATH-MS proteomics approach. Translational Vision Science & Technology. 9 (3), 16 (2020).
- Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: from sampling to preanalytical processing. Scientific Reports. 11 (1), 10064 (2021).
