Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att samla in tårprover med hjälp av Schirmer-remsor och ett integrerat kvantitativt arbetsflöde för att upptäcka icke-invasiva biomarkörer för tårproteiner. Arbetsflödet för beredning av suspensionsfångar prover möjliggör snabb och robust tårprovsberedning och masspektrometrisk analys, vilket resulterar i högre peptidåtervinningsutbyte och proteinidentifiering än standardprocedurer i lösning.
Abstract
Tårvätska är en av de lättillgängliga biovätskor som kan samlas in icke-invasivt. Tear proteomics har potential att upptäcka biomarkörer för flera ögonsjukdomar och tillstånd. Suspensionskolonnen har rapporterats vara ett effektivt och användarvänligt arbetsflöde för provberedning för bred tillämpning av nedströms proteomikanalys. Ändå har denna strategi inte studerats väl i analysen av humant tårproteom. Det aktuella protokollet beskriver ett integrerat arbetsflöde från kliniska humana tårprover till renade peptider för icke-invasiv forskning om biomarkörer för tårproteiner med hjälp av masspektrometri, vilket ger insikter i sjukdomsbiomarkörer och övervakning i kombination med bioinformatisk analys. En provberedning med proteinsuspensionsfällor tillämpades och demonstrerade upptäckten av tårproteom med snabba, reproducerbara och användarvänliga procedurer, som en universell, optimerad provberedning för analys av mänsklig tårvätska. I synnerhet överträffade suspensionsfällningsproceduren provberedning i lösning när det gäller peptidåterhämtning, proteinidentifiering och kortare provberedningstid.
Introduction
Tear proteomics har fått uppmärksamhet för att utforska potentiella biomarkörer för okulära sjukdomar och tillstånd 1,2,3,4,5,6, för att få tillgång till patogenesen av det okulära och systemiska tillståndet, samt för att utnyttja fördelen med icke-invasiv tårprovsinsamling med Schirmer-remsor. Den tekniska utvecklingen av nästa generations masspektrometri har möjliggjort proteinkvantifiering i mikroliterskala med noggrannhet och precision som inte varit möjlig tidigare. Provberedningsmetoderna är ännu inte standardiserade. Ett robust och standardiserat arbetsflöde för provberedning är avgörande för framgångsrik klinisk tillämpning inom forskning om biomarkörer för tårproteiner. Arbetsflödet för provberedning av suspensionsfällor (S-Trap) rapporterades nyligen som en effektiv och känslig provberedningsmetod för bred nedströms proteomikanalys 7,8. Ändå har denna strategi inte rapporterats väl i analysen av humant tårproteom, överträffat filterstödd provberedning (FASP) och nedbrytning i lösning när det gäller enzymatisk nedbrytningseffektivitet och det större antalet proteinidentifiering genom masspektrometrisk analys9. Det S-Trap-baserade tillvägagångssättet demonstrerades vid beredning av näthinnevävnad 10, formalinfixerad, paraffininbäddad (FFPE) vävnad11, celler 12, mikroorganism 13 och flytande biopsier14,15.
Detta protokoll beskriver ett integrerat kvantitativt arbetsflöde från kliniska prover till enzymatiskt smält protein för upptäckten av en icke-invasiv biomarkörpanel för tårprotein med en snabb, reproducerbar och robust teknisk strategi. I korthet samlades tårvätskan upp med hjälp av en standard Schirmer-remsa och torkades omedelbart med en oftalmisk ramvärmare för att förhindra proteinautolys vid rumstemperatur. Inbäddade totalproteiner extraherades med hjälp av 5 % natriumdodecylsulfat (SDS) lysbuffert enligt tillverkarens förslag, följt av proteinanalysmätning. Det extraherade lysatet genomgick sedan standardreduktion med ditiotreitol (DTT) och alkylering med jodacetamid (IAA).
Efter försurning med fosforsyra tillsattes suspensionsfångande proteinfällningsbuffert innehållande 90 % metanol och 100 mM trietylammoniumbikarbonat (TEAB) till aggregatproteinerna. Provet överfördes sedan till en ny upphängningsfångande mikrokolonn. Enzymatisk nedbrytning med sekvenseringsklassad trypsin i förhållandet 1:25 (vikt/vikt, trypsin: protein) vid 47 °C i 1 timme. De resulterande peptiderna eluerades sedan via centrifugering, sekventiellt med 50 mM TEAB, 0,2 % vattenhaltig myrsyra (FA) och 50 % acetonitril (ACN) innehållande 0,2 % FA. De eluerade peptiderna vakuumtorkades och rekonstituerades i 0,1 % FA. Peptidkoncentrationen mättes och justerades till 0,5 μg/μL för masspektrometrisk analys.
Protocol
Försökspersonerna gav skriftligt informerat samtycke innan de deltog i studien. Studien godkändes av Human Ethics Committee vid Hong Kong Polytechnic University och följde grundsatserna i Helsingforsdeklarationen.
1. Uppsamling av mänsklig tårvätska med Schirmer-remsa
- Använd handskar och desinficera för att undvika kontaminering av prover.
- Kontrollera att innerförpackningen är hel, steril och inte har gått ut.
- Böj Schirmer-remsans överkant något inåt vid 0 mm-markeringen, som visas nära remsans halvcirkelspets (figur 1).
- Ta bort remsan från innerförpackningen genom att hålla i änden av remsan och undvik direktkontakt med provtagningsområdet från 0 till 25 mm.
- Be motivet att titta bort från positionen för remsan som ska placeras.
- Dra försiktigt ner det nedre ögonlocket och haka fast änden av remsan i den nedre fornixen nära den laterala kantusregionen (Figur 2). Upprepa samma procedur på det andra ögat.
- Be försökspersonen att försiktigt stänga ögonlocken för att minimera irritation.
- Samla tårvätska i ca 5 min eller helst 15-20 mm tårprov togs.
- Be försökspersonen att öppna båda ögonen, dra försiktigt ner det nedre ögonlocket och ta bort remsorna från motivet.
- Inspektera den hydratiserade längden på Schirmer-remsan och anteckna den uppsamlade mängden i mm.
- Torka remsan med en vanlig, ren ramvärmare tills vätskan är helt torr.
OBS: Överskottsvärme som potentiellt kan förkolna filterpapperet bör undvikas. - Sätt in varje torkad Schirmer-remsa i ett märkt kryorör och förvara den helst på en sval, torr plats i mörker tills vidare bearbetning.
2. Beredning av kemikalier och reagenser
- Lysbuffert (5 % SDS, 50 mM TEAB, pH 7,5), 20 ml
- Pipettera 1 ml 1 M TEAB och 80 μL 12% fosforsyra. Virvla och sonikera kort för att ta bort bubblor. Fyll på upp till 20 ml med avjoniserat vatten.
- Väg upp 1 g säkerhetsdatablad och tillsätt till lösningen med oscillation tills den är upplöst.
- Proteinutfällningsbuffert (90 % metanol, 100 mM TEAB, pH 7,1), 10 ml
- Tillsätt 893 μl 1 M TEAB och 92 μL avjoniserat vatten.
- Tillsätt 15 μl 85 viktprocent fosforsyra och 9 ml metanol till lösningen och virvla kort.
- Rötningsbuffert (50 mM TEAB), 1 ml
- Tillsätt 50 μL 1 M TEAB och fyll på upp till 1 ml med avjoniserat vatten.
- 200 mM ditiotreitol (DTT) lösning, 500 μL
- Väg upp 15 mg DTT och lös i 500 μl avjoniserat vatten; virvel kortfattat.
OBS: Förbered före användning.
- Väg upp 15 mg DTT och lös i 500 μl avjoniserat vatten; virvel kortfattat.
- 400 mM jodacetamid (IAA) lösning, 200 μL
- Väg upp 15 mg IAA och lös upp i 200 μl avjoniserat vatten. virvel kortfattat. OBS: Förbered före användning och undvik ljus.
- 0,2% myrsyra, 50% acetonitril, 10 ml
- Förbered 10 ml 50 % acetonitril i avjoniserat vatten.
- Tillsätt 20 μl myrsyra och virvla kort.
- 0,2% myrsyralösning, 10 ml
- Tillsätt 20 μL myrsyra till 10 ml avjoniserat vatten och virvla kort.
- 0,1% myrsyralösning, 10 ml
- Tillsätt 10 μL myrsyra till 10 ml avjoniserat vatten; virvel kortfattat.
3. Proteinextraktion i Schirmer-remsa
- Klipp och kassera den främre änden bortom 0 mm-märket på remsan för att ta bort potentiell kontaminering på grund av kontakt mellan konjunktival vävnader med ren sax av rostfritt stål.
- Skär remsan i 1 mm intervall i ett 1.5 ml mikrocentrifugrör (Figur 3).
- Tillsätt 100 μL lysbuffert till mikrocentrifugröret och virvla vid 1 000 varv per minut, rumstemperatur i 1 timme i en termomixer.
- Centrifugera kort och överför supernatanten till ett nytt 1.5 ml mikrocentrifugrör.
- Flytta remsorna till 200 μL pipettspetsar med en ren pincett. Placera spetsarna i samma rör från steg 3.4 med hållare och centrifugera i rumstemperatur vid 4 000 × g i ytterligare 1 minut för maximal återhämtning av det återstående provet på remsan.
- Mät proteinkoncentrationen med hjälp av bicinkoninsyra (BCA) eller kompatibel proteinanalys.
4. Provberedning med suspensionsfällor
- Normalisera samples till 50 μg protein baserat på proteinanalysresultatet.
- Tillsätt 200 mM DTT i förhållandet 1:10 (v/v, DTT: prov) till en slutlig koncentration av 20 mM DTT och inkubera vid 95 °C i 10 min.
- Kyl ner proteinlösningen till rumstemperatur.
- Tillsätt 400 mM IAA i förhållandet 1:10 (v/v, IAA: prov) till en slutlig koncentration av 40 mM IAA och inkubera i mörker vid rumstemperatur i 10 minuter.
- Tillsätt 12 % vattenhaltig fosforsyra i förhållandet 1:10 (v/v, syra: prov) till en slutlig koncentration av 1,2 % fosforsyra och virvla kort.
- Tillsätt proteinbindande buffert i förhållandet 1:6 (v/v, prov: buffert) och virvla kort.
OBS: I detta steg bör kolloidala proteinpartiklar bildas, och lösningen kommer att se genomskinlig ut om proteinmängden är tillräcklig. - Lossa locket på Suspension Trapping Micro Spin Column och montera spinnkolonnen på ett 2 ml mikrocentrifugrör för att samla upp genomflödet.
- Tillsätt upp till 200 μl surgjord proteinlysatblandning i kolonnen.
- Centrifugera kolonnen vid 4 000 × g i 20 s. Proteinpartiklar fångades in; Upprepa tills proverna har laddats till kolonnen.
- Tillsätt 150 μl proteinbindande buffert och centrifugera vid 4 000 × g i 20 sekunder för att tvätta det suspenderade proteinet. Upprepa 3 gånger.
- Montera mikrokolonnen för upphängningsfällning på ett nytt 1.5 ml mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 20 μl 50 mM TEAB-rötningsbuffert innehållande proteas i förhållandet 1:25 (vikt/vikt, trypsin: protein) på filtret inuti centrifugkolonnen, för att undvika bubblor och luftspalt mellan filtret och uppslutningslösningen.
- Täck över den upphängningsfångande mikrospinnkolonnen för att förhindra avdunstning. Inkubera vid 47 °C i 1 timme i en termomixer. Skaka eller virvla inte under matsmältningen.
- Eluera peptider med 40 μL 50 mM TEAB genom centrifugalkraft vid 4 000 × g i 20 s.
- Tillsätt 40 μl 0,2 % FA och centrifugera vid 4 000 × g i 20 s.
- Tillsätt 35 μl 0,2 % FA, 50 % acetonitril och centrifugera vid 4 000 × g i 20 s.
- Poola tre eluat och torka med en vakuumcentrifug.
- Förvaras vid -80 °C frys med ultralåg temperatur tills vidare analys. OBS: Protokollet kan pausas här.
5. Rekonstituera peptider för masspektrometrianalys
- Bered provet med 12 μl 0,1 % FA, virvel och centrifugera kort.
- Mät peptidkoncentrationen med ett peptidanalyskit.
- Normalisera peptidkoncentrationen till 0,5 μg/μL i 0,1 % FA.
- Överför peptidblandningen till en autosamplerflaska och gör den klar för masspektrometrianalys.
6. Provtagning med vätskekromatografi-tandemmasspektrometri
- Fyll på 3 μg av peptiden med isokratisk laddningsbuffert (0,1 % FA, 5 % ACN) i en fällkolonn (C18, 5 μm, 100 μm, 20 mm) med en flödeshastighet av 2 μL/min i 15 minuter.
- Fraktionera peptiderna med hjälp av en nanoanalyskolonn med omvänd fas (C18, 5 μm, 100 μm, 300 mm) med en flödeshastighet av 350 nL/min i en separationsgradient på 155 minuter. Använd mobil fas A som består av en blandning av 0,1 % myrsyra (v/v), 5 % ACN (v/v) i vatten och mobil fas B som innehåller 0,1 % FA (v/v), 98 % ACN (v/v) i vatten. Använd följande lutning: 0–0,5 min: 5 % B, 0,5–90 min: 10 % B, 90–120 min: 20 % B, 120–130 min: 28 % B, 130–135 min: 45 % B, 135–141 min: 80 % B, 141–155 min: 5 % B.
- Utför databeroende insamling (DDA) med ett TOF-MS-skanningsområde mellan 350 och 1800 m/z med en ackumuleringstid på 250 ms och en dynamisk måluteslutningstid på 18 s. Utför sedan en MS/MS-skanning vid 100 till 1 800 m/z i högkänsligt läge med en ackumuleringstid på 50 ms för de 50 främsta prekursorerna per cykel med ett tröskelvärde på 125 cps för MS/MS-signal med ett laddningstillstånd från +2 till +4.
- Analysera rådata med den refererade programvaran eller andra kompatibla motorer med en referensdatabas i FASTA från den offentligt tillgängliga UniProt-databasen.
Representative Results
Detta protokoll gör det möjligt att samla in tårprover med Schirmer Strips som förvaras torrt vid rumstemperatur innan provberedning för masspektrometrianalys. Arbetsflöde för filterstödd provberedning (FASP) med upphängningsfångande mikrokolonn möjliggjorde snabb provberedning på några timmar, jämfört med vanliga metoder för uppslutning i lösning under dagar som kräver inkubation över natten. Peptidutbytet var signifikant högre (p < 0,001) än standardprotokollet för nedbrytning i lösning och med god reproducerbarhet vid en variationskoefficient (% CV) < 7 %. En pool av tårprover upprepades i sex tekniska replikat med 74,2 ± 5,0 % peptidåtervinning och 52,8 ± 1,6 % peptidåtervinning i prover preparerade med lösningsprocedurer. Ett poolat tårprov med en proteinmängd på 36,3 μg spikades på Schirmerremsan och extraherades enligt tidigare beskrivning, extraktionseffektiviteten för protein var 81 % (29,5 ± 6,8 μg, medelvärde ± SD).
Båda arbetsflödena laddade 3 μg peptider på MS, och DDA-sökningen gav totalt 1 183 ± 118 proteiner (5 757 ± 537 distinkta peptider) och 874 ± 70 proteiner (4 400 ± 328 peptider) vid 1 % FDR i suspensionsfällningsgruppen respektive lösningsgruppen. Analys av genontologi (GO) med hjälp av PANTHER-klassificeringssystemet avslöjade mycket likartade proteom för båda metoderna, med bindning, katalytisk aktivitet och molekylär funktionsreglering som deras huvudsakliga molekylära funktioner (Figur 4).
Figur 1: Böj toppen av Schirmer-remsan vid 0 mm-markeringen före applicering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Schirmerremsans position under uppsamling av tårar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Illustration av Schirmer-bandhantering före proteinextraktion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Cirkeldiagram som illustrerar genontologianalysen för de proteom som identifierats med hjälp av arbetsflödet i lösningen och arbetsflödet för suspensionsfällor, med hjälp av klassificeringssystemet Panther. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
För att uppnå exakta resultat med denna metod bör kraftfria engångshandskar bäras i alla procedurer från tårprovsinsamling för att undvika provkontaminering. Det är viktigt att undvika bubblor och luftspalter mellan filtret och provlösningen i varje steg genom att använda mikrospinnkolonner. Om provvolymen är större än kolonnernas kapacitet, rekommenderas att upprepa processen. Detta protokoll har visat sig vara mer effektivt än det traditionella lösningsprotokollet när det gäller beredningstid, proteinåtervinning och total proteinidentifiering. Detta beror till stor del på att proverna genomgår de flesta av de nödvändiga procedurerna på samma kolonn, till skillnad från lösningsmetoden som involverar flera överföringssteg såsom acetonutfällning, uppslutning och sanering (avsaltning), vilket ökar sannolikheten för variationer i de resulterande data.
Förutom de tårprover som samlas in med mikrokapillärmetoden16,17, ger detta FASP-arbetsflöde med upphängningsfångande mikrokolonn en alternativ provberedningsmetod som möjliggör snabb och robust tårprovberedning som samlas in med Schirmer-remsor, med minimal materialförberedelse och användarvänliga steg att följa. Detta möjliggör reproducerbar tårprovsberedning för stora kohortstudier över flera ögonsjukdomar eller tillstånd med förbättrad peptidåterhämtning och proteinidentifiering av MS jämfört med procedurer i lösning. Denna tillförlitliga process kan användas regelbundet vid beredning av tårbiomarkörprover för forskning och andra kliniska ändamål. Viktigast av allt är att det kräver minimal personalutbildning för insamling på plats och förnekar behovet av provförvaring i en frys. Proverna torkas på plats för att minimera proteinautolys och nedbrytning. Därför möjliggör detta bekväm leverans via post för att underlätta nedströmsanalys, i motsats till att använda mikrokapillärrör.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av InnoHK-initiativet och Hongkongs regering i den särskilda administrativa regionen. Forskningscentrum för SHARP Vision; och Research Centre for Chinese Medicine Innovation (RCMI) vid Hong Kong Polytechnic University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9 mm Plastic Screw Thread Vials | Thermo Scientific | C4000-11 | |
| Acetonitrile, LCMS Grade | Anaqua | AC-1026 | |
| Centrifuge MiniSpin plus | Eppendorf | 5453000097 | |
| DL-dithiothreitol (DTT), BioUltra | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Formic acid, ACS reagent, ≥96% | Sigma-Aldrich | 695076 | |
| Frame Heater OPTIMONSUN Electronic | Breitfeld & Schliekert GmbH | 1203166 | |
| Iodoacetamide (IAA), BioUltra | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol, HPLC Grade | Anaqua | MA-1292 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes, 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 368632 | |
| Phosphoric acid, 85 wt.% in H2O | Sigma-Aldrich | 345245 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry | Sciex | TripleTOF 6600 | |
| Schirmer Ophthalmic Strips | Entod Research Cell UK Ltd | I-DEW Tearstrips | |
| S-Trap Micro Column | Protifi | C02-micro-80 | |
| SureSTART 9 mm Screw Caps | Thermo Scientific | CHSC9-40 | |
| Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M | Sigma-Aldrich | 18597 | |
| Ultra-performance Liquid Chromatography | Eksigent | NanoLC 400 | |
| UltraPure Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 |
References
- Ma, J. Y. W., Sze, Y. H., Bian, J. F., Lam, T. C. Critical role of mass spectrometry proteomics in tear biomarker discovery for multifactorial ocular diseases (Review). International Journal of Molecular Medicine. 47 (5), 83 (2021).
- Tse, J. S. H., et al. Integrating clinical data and tear proteomics to assess efficacy, ocular surface status, and biomarker response after orthokeratology lens wear. Translational Vision Science & Technology. 10 (11), 18 (2021).
- Cheung, J. K., et al. Human tear proteome dataset in response to daily wear of water gradient contact lens using SWATH-MS approach. Data in Brief. 36, 107120 (2021).
- Tse, J. S., et al. Data on assessment of safety and tear proteome change in response to orthokeratology lens - Insight from integrating clinical data and next generation proteomics. Data in Brief. 29, 105186 (2020).
- Zhan, X., Li, J., Guo, Y., Golubnitschaja, O. Mass spectrometry analysis of human tear fluid biomarkers specific for ocular and systemic diseases in the context of 3P medicine. The EPMA Journal. 12 (4), 449-475 (2021).
- Ponzini, E., et al. Mass spectrometry-based tear proteomics for noninvasive biomarker discovery. Mass Spectrometry Reviews. 41 (5), 842-860 (2022).
- HaileMariam, M., et al. S-Trap, an ultrafast sample-preparation approach for shotgun proteomics. Journal of Proteome Research. 17 (9), 2917-2924 (2018).
- Ding, H., et al. Urine proteomics: evaluation of different sample preparation workflows for quantitative, reproducible, and improved depth of analysis. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1857-1862 (2020).
- Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
- Sze, Y. H., et al. High-pH reversed-phase fractionated neural retina proteome of normal growing C57BL/6 mouse. Scientific Data. 8 (1), 27 (2021).
- Marchione, D. M., et al. HYPERsol: High-quality data from archival FFPE tissue for clinical proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (2), 973-983 (2020).
- Chhuon, C., et al. A sensitive S-Trap-based approach to the analysis of T cell lipid raft proteome. Journal of Lipid Research. 61 (11), 1512-1523 (2020).
- Hayoun, K., et al. Evaluation of sample preparation methods for fast proteotyping of microorganisms by tandem mass spectrometry. Frontiers in Microbiology. 10, 1985 (2019).
- Templeton, E. M., et al. Comparison of SPEED, S-Trap, and in-solution-based sample preparation methods for mass spectrometry in kidney tissue and plasma. International Journal of Molecular Sciences. 24 (7), 6290 (2023).
- Ding, Z., Wang, N., Ji, N., Chen, Z. S. Proteomics technologies for cancer liquid biopsies. Molecular Cancer. 21 (1), 53 (2022).
- Nättinen, J., Aapola, U., Jylhä, A., Vaajanen, A., Uusitalo, H. Comparison of capillary and Schirmer strip tear fluid sampling methods using SWATH-MS proteomics approach. Translational Vision Science & Technology. 9 (3), 16 (2020).
- Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: from sampling to preanalytical processing. Scientific Reports. 11 (1), 10064 (2021).
