Summary
该协议描述了一种使用Schirmer条收集泪液样本的方法和用于发现非侵入性泪液蛋白生物标志物的集成定量工作流程。悬浮捕获样品制备工作流程可实现快速、稳定的泪液样品制备和质谱分析，与标准溶液中程序相比，可实现更高的肽回收率和蛋白质鉴定。
Abstract
泪液是一种易于获取的生物体液，可以非侵入性地收集。泪液蛋白质组学有可能发现多种眼部疾病和病症的生物标志物。据报道，悬浮捕获柱是一种高效且用户友好的样品制备工作流程，适用于下游蛋白质组学分析的广泛应用。然而，这种策略在人类泪液蛋白质组的分析中尚未得到充分研究。本方案描述了从临床人泪液样本到纯化肽的集成工作流程，用于使用质谱法进行非侵入性泪液蛋白生物标志物研究，当与生物信息学分析相结合时，它提供了对疾病生物标志物和监测的见解。应用蛋白质悬浮捕获样品制备，并证明了通过快速、可重复和用户友好的程序发现泪液蛋白质组，作为人类泪液分析的通用、优化样品制备。特别是，悬浮捕获程序在肽回收率、蛋白质鉴定和更短的样品制备时间方面优于溶液内样品制备。
Introduction
泪液蛋白质组学在探索眼部疾病和病症的潜在生物标志物1、2、3、4、5、6、了解眼部和全身疾病的发病机制以及利用使用 Schirmer 试纸收集非侵入性泪液样本的优势方面受到了关注。下一代质谱技术的进步使微升级泪液中的蛋白质定量成为可能，其准确度和精密度是过去无法实现的。样品制备方法尚未标准化。强大且标准化的样品制备工作流程对于泪液蛋白生物标志物研究的临床应用成功至关重要。悬浮捕获 （S-Trap） 样品制备工作流程最近被报道为一种有效且灵敏的样品制备方法，适用于广泛的下游蛋白质组学分析 7,8。然而，这种策略在人类泪液蛋白质组的分析中尚未得到充分报道，在酶消化效率和通过质谱分析鉴定更多的蛋白质方面优于过滤辅助样品制备 （FASP） 和溶液内消化9。基于 S-Trap 的方法在视网膜组织 10、福尔马林固定、石蜡包埋 （FFPE） 组织11、细胞 12、微生物 13 和液体活检 14,15 的制备中得到证明。
该协议描述了从临床样品到酶消化蛋白质的集成定量工作流程，用于发现具有快速、可重复和稳健技术策略的非侵入性泪液蛋白生物标志物组合。简而言之，使用标准 Schirmer 试纸收集泪液，并立即用眼架加热器干燥，以防止蛋白质在室温下自溶。根据制造商的建议，使用 5% 十二烷基硫酸钠 （SDS） 裂解缓冲液提取包埋的总蛋白，然后进行蛋白质测定测定。然后用二硫苏糖醇（DTT）对提取的裂解物进行标准还原，并用碘乙酰胺（IAA）进行烷基化。
用磷酸酸化后，将含有90%甲醇和100 mM三乙基碳酸氢铵（TEAB）的悬浮捕获柱蛋白沉淀缓冲液加入到聚集蛋白中。然后将样品转移到新的悬浮捕获微柱中。用测序级胰蛋白酶以1：25的比例（w / w，胰蛋白酶：蛋白质）在47°C下进行酶消化1小时。然后通过离心洗脱所得肽，依次用 50 mM TEAB、0.2% 甲酸水溶液 （FA） 和含有 0.2% FA 的 50% 乙腈 （ACN） 洗脱。将洗脱的肽真空干燥，并在0.1%FA中复溶。测量肽浓度并将其调节至0.5 μg/μL进行质谱分析。
Protocol
受试者在参与研究前提供了书面知情同意书。该研究已获香港理工大学人类伦理委员会批准，并遵守《赫尔辛基宣言》的原则。
1. 用 Schirmer 试纸收集人体泪液
- 戴上手套并消毒以避免样品污染。
- 检查内包装是否完好、无菌且未过期。
- 在 0 毫米标记处将 Schirmer 条带的顶部稍微向内弯曲，如条带半圆尖端附近所示（图 1）。
- 握住试纸的末端，从内包装中取出试纸，避免直接接触 0 至 25 毫米的样品收集区域。
- 要求受试者将视线从要放置的条带的位置移开。
- 轻轻拉下下眼睑，将条带末端钩在外眦区域附近的下穹窿处（图2）。在另一只眼睛上重复相同的步骤。
- 要求受试者轻轻闭上眼睑，以尽量减少刺激。
- 收集泪液约5分钟或优选15-20毫米的泪液样本。
- 让受试者睁开双眼，轻轻拉下下眼睑，然后从受试者身上取下条带。
- 检查 Schirmer 条带上的水合长度，并以毫米为单位记录收集的量。
- 用标准、干净的框架加热器干燥条带，直到流体完全干燥。
注意： 应避免可能使滤纸烧焦的过度加热。 - 将每个干燥的 Schirmer 条插入带标签的冷冻管中，最好将其存放在阴凉干燥处，直至进一步处理。
2.化学品和试剂的制备
- 裂解缓冲液（5% SDS，50 mM TEAB，pH 7.5），20 mL
- 移液 1 mL 的 1 M TEAB 和 80 μL 的 12% 磷酸。涡旋并短暂超声处理以去除气泡。用去离子水加满 20 mL。
- 称取 1 g SDS，振荡加入溶液直至溶解。
- 蛋白沉淀缓冲液（90% 甲醇，100 mM TEAB，pH 7.1），10 mL
- 加入 893 μL 1 M TEAB 和 92 μL 去离子水。
- 向溶液中加入 15 μL 85 wt. % 磷酸和 9 mL 甲醇，并短暂涡旋。
- 消化缓冲液（50 mM TEAB），1 mL
- 加入 50 μL 的 1 M TEAB，并用去离子水加至 1 mL。
- 200 mM 二硫苏糖醇 （DTT） 溶液，500 μL
- 称取 15 mg DTT 并溶于 500 μL 去离子水中;短暂地涡旋。
注意：使用前准备。
- 称取 15 mg DTT 并溶于 500 μL 去离子水中;短暂地涡旋。
- 400 mM 碘乙酰胺 （IAA） 溶液，200 μL
- 称取 15 mg IAA 并溶于 200 μL 去离子水中;短暂地涡旋。注意： 使用前准备并避光。
- 0.2%甲酸，50%乙腈，10毫升
- 在去离子水中制备 10 mL 50% 乙腈。
- 加入 20 μL 甲酸并短暂涡旋。
- 0.2%甲酸溶液，10 mL
- 将 20 μL 甲酸加入 10 mL 去离子水中并短暂涡旋。
- 0.1% 甲酸溶液，10 mL
- 将 10 μL 甲酸加入 10 mL 去离子水中;短暂地涡旋。
3. Schirmer 试纸中的蛋白质提取
- 将前端剪下并丢弃超过 0 毫米标记的条带，以去除由于结膜组织与干净的不锈钢剪刀接触而产生的潜在污染。
- 将条带以 1 mm 的间隔切入 1.5 mL 微量离心管中（图 3）。
- 向微量离心管中加入100μL裂解缓冲液，并在热混合器中以1,000rpm，室温涡旋1小时。
- 短暂离心并将上清液转移到新的 1.5 mL 微量离心管中。
- 使用干净的镊子将条带移入 200 μL 移液器吸头中。将吸头放入带有支架的步骤3.4中的同一管中，并在室温下以4,000× g 离心1分钟，以最大限度地回收试纸上剩余的样品。
- 使用二辛可宁酸（BCA）或兼容的蛋白质测定法测量蛋白质浓度。
4. 悬浮捕获样品制备
- 根据蛋白质测定结果将样品归一化至50μg蛋白质。
- 以1：10的比例加入200mM DTT（v / v，DTT：样品）至终浓度为20mM DTT，并在95°C下孵育10分钟。
- 将蛋白质溶液冷却至室温。
- 以1：10的比例加入400mM IAA（v / v，IAA：样品）至终浓度为40mM IAA，并在室温下在黑暗中孵育10分钟。
- 将12%磷酸水溶液以1：10的比例加入（v / v，酸：样品）至终浓度为1.2%的磷酸中，并短暂涡旋。
- 以 1：6 的比例加入蛋白质结合缓冲液（v/v，样品：缓冲液）并短暂涡旋。
注意：在此步骤中，应形成胶体蛋白颗粒，如果蛋白质量足够，溶液将呈半透明状。 - 打开悬浮捕获微量离心柱的盖子，将离心柱组装到 2 mL 微量离心管上以收集流出物。
- 向色谱柱中加入多达 200 μL 的酸化蛋白裂解物混合物。
- 将色谱柱以4,000× g 离心20秒。蛋白质颗粒被捕获;重复上述步骤，直到将样品加载到色谱柱中。
- 加入 150 μL 蛋白质结合缓冲液，并以 4,000 × g 离心 20 秒以洗涤悬浮蛋白。重复 3 次。
- 将悬浮捕获微量柱组装到新的 1.5 mL 微量离心管上。
- 将 20 μL 含有蛋白酶的 50mM TEAB 消化缓冲液以 1：25 的比例（w/w，胰蛋白酶：蛋白质）加入到离心柱内的过滤器上，避免过滤器和消化溶液之间出现气泡和气隙。
- 盖上悬浮捕获微量离心柱以防止蒸发。在47°C下在热混合器中孵育1小时;消化过程中不要摇晃或涡旋。
- 用 40 μL 50 mM TEAB 在 4,000 × g 下离心力洗脱肽 20 秒。
- 加入 40 μL 0.2% FA 并以 4,000 × g 离心 20 秒。
- 加入 35 μL 0.2% FA、50% 乙腈，并以 4,000 × g 离心 20 秒。
- 池三洗脱并用真空离心机干燥。
- 储存在-80°C超低温冰箱中，直至进一步分析。注意：可以在此处暂停协议。
5. 复溶肽用于质谱分析
- 用 12 μL 0.1% FA 复溶样品，涡旋并短暂离心。
- 使用肽测定试剂盒测量肽浓度。
- 在0.1%FA中将肽浓度归一化至0.5μg/ μL。
- 将肽混合物转移到自动进样器样品瓶中，准备进行质谱分析。
6. 液相色谱-串联质谱法采集样品
- 用等度上样缓冲液（0.1%FA，5%乙腈）将3μg肽以2μL / min的流速加载到陷阱柱（C18,5μm，100μm，20mm）中，持续15分钟。
- 使用反相纳米分析柱（C18,5μm，100μm，300mm）以350nL / min的流速在155分钟的分离梯度下分馏肽。使用流动相A，包括0.1%甲酸（v/v）、5%乙腈（v/v）的水溶液和流动相B（含0.1%FA（v/v）、98%乙腈（v/v）的水溶液。使用以下梯度：0-0.5 分钟：5% B，0.5-90 分钟：10% B，90-120 分钟：20% B，120-130 分钟：28% B，130-135 分钟：45% B，135-141 分钟：80% B，141-155 分钟：5% B。
- 执行数据依赖性采集 （DDA），TOF-MS 扫描范围在 350 至 1800 m/z 之间，累积时间为 250 ms，动态目标排除时间为 18 s。然后，在高灵敏度模式下以 100 至 1,800 m/z 的速度进行 MS/MS 扫描，每个周期前 50 个前驱体的累积时间为 50 ms，充电状态为 +2 至 +4 的 MS/MS 信号的阈值为 125 cps。
- 使用参考软件或其他兼容引擎，使用可公开访问的 UniProt 数据库中的 FASTA 参考数据库分析原始数据。
Representative Results
该协议允许在随后的样品制备用于质谱分析之前，使用在室温下干燥储存的Schirmer试纸收集泪液样品。与通常采用的需要过夜孵育的溶液内消解程序相比，采用悬浮捕获微柱的过滤辅助样品制备 （FASP） 工作流程可在数小时内快速完成样品制备。肽回收率显著高于标准溶液内酶解方案（p < 0.001），并且在变异系数（%CV）<7%时具有良好的重现性。在六次技术重复中重复使用泪液样品池，在通过溶液程序制备的样品中，肽回收率为74.2 ± 5.0%，肽回收率为52.8 ± 1.6%。将蛋白质量为 36.3 μg 的混合泪液样品加标到 Schirmer 条带上并如前所述提取，蛋白质的提取效率为 81%（29.5 ± 6.8 μg，平均值± SD）。
两种工作流程均在MS上加载了3 μg肽，DDA搜索在悬浮捕获组和溶液内组分别以1% FDR±1%获得了1,183118种蛋白质（5,757±537种不同的肽）和874±70种蛋白质（4,400±328种肽）。使用 PANTHER 分类系统对基因本体 （GO） 进行分析，发现两种方法的蛋白质组非常相似，结合、催化活性和分子功能调控是它们的主要分子功能（图 4）。
图 1：使用前将 Schirmer 条带的顶部弯曲到 0 毫米标记处。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：泪液收集过程中 Schirmer 条带的位置。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：蛋白质提取前 Schirmer 条带处理示意图。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：饼图显示了使用 PANTHER 分类系统，使用溶液内工作流程和悬浮捕获工作流程鉴定的蛋白质组的基因本体分析。 请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
为了使用这种方法获得准确的结果，从泪液样本采集开始的所有程序都应佩戴无电源的一次性手套，以避免样本污染。通过使用微离心柱，在每个步骤中避免过滤器和样品溶液之间出现气泡和气隙非常重要。如果样品体积大于色谱柱的容量，建议重复该过程。该方案已被证明在制备时间、蛋白质回收率和总蛋白鉴定方面比传统的溶液内方案更有效。这主要是因为样品在同一色谱柱上经历了大部分所需的程序，这与溶液内方法不同，后者涉及多个转移步骤，如丙酮沉淀、消解和净化（脱盐），这增加了结果数据变化的可能性。
除了使用微毛细管法16,17 收集的泪液样品外，这种带有悬浮捕获微量色谱柱的 FASP 工作流程提供了一种替代样品制备方法，允许使用 Schirmer 试纸条快速、稳健地收集泪液样品制备，只需最少的材料制备和用户友好的步骤即可遵循。这允许为多种眼部疾病或病症的大型队列研究提供可重复的泪液样品制备，与溶液内程序相比，MS的肽回收率和蛋白质鉴定率更高。这种可靠的工艺可以定期用于制备用于研究和其他临床目的的泪液生物标志物样品。最重要的是，它需要最少的员工培训即可进行现场采集，并且无需将样品储存在冰箱中。样品在现场干燥，以尽量减少蛋白质自溶和降解。因此，与使用微毛细管相比，这允许通过邮件方便地运输，以方便下游分析。
Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
这项工作得到了InnoHK创新香港研发平台和香港特别行政区政府的支持;夏普视觉研究中心;以及香港理工大学中医药创新研究中心。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9 mm Plastic Screw Thread Vials | Thermo Scientific | C4000-11 | |
| Acetonitrile, LCMS Grade | Anaqua | AC-1026 | |
| Centrifuge MiniSpin plus | Eppendorf | 5453000097 | |
| DL-dithiothreitol (DTT), BioUltra | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Formic acid, ACS reagent, ≥96% | Sigma-Aldrich | 695076 | |
| Frame Heater OPTIMONSUN Electronic | Breitfeld & Schliekert GmbH | 1203166 | |
| Iodoacetamide (IAA), BioUltra | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol, HPLC Grade | Anaqua | MA-1292 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes, 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 368632 | |
| Phosphoric acid, 85 wt.% in H2O | Sigma-Aldrich | 345245 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry | Sciex | TripleTOF 6600 | |
| Schirmer Ophthalmic Strips | Entod Research Cell UK Ltd | I-DEW Tearstrips | |
| S-Trap Micro Column | Protifi | C02-micro-80 | |
| SureSTART 9 mm Screw Caps | Thermo Scientific | CHSC9-40 | |
| Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M | Sigma-Aldrich | 18597 | |
| Ultra-performance Liquid Chromatography | Eksigent | NanoLC 400 | |
| UltraPure Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 |
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