Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor het verzamelen van traanmonsters met behulp van Schirmer-strips en een geïntegreerde kwantitatieve workflow voor het ontdekken van niet-invasieve traaneiwitbiomarkers. De workflow voor de voorbereiding van het suspensievangmonster maakt een snelle en robuuste traanmonstervoorbereiding en massaspectrometrische analyse mogelijk, wat resulteert in hogere peptideterugwinningsopbrengsten en eiwitidentificatie dan standaard procedures in de oplossing.
Abstract
Traanvocht is een van de gemakkelijk toegankelijke biovloeistoffen die niet-invasief kunnen worden verzameld. Traanproteomics heeft het potentieel om biomarkers te ontdekken voor verschillende oogziekten en aandoeningen. Naar verluidt is de suspensievangkolom een efficiënte en gebruiksvriendelijke workflow voor monstervoorbereiding voor de brede toepassing van stroomafwaartse proteomische analyse. Toch is deze strategie niet goed bestudeerd in de analyse van menselijk traanproteoom. Het huidige protocol beschrijft een geïntegreerde workflow van klinische menselijke traanmonsters tot gezuiverde peptiden voor niet-invasief onderzoek naar traaneiwitbiomarkers met behulp van massaspectrometrie, dat inzicht geeft in ziektebiomarkers en monitoring in combinatie met bioinformatica-analyse. Een monstervoorbereiding voor het vangen van eiwitsuspensie werd toegepast en demonstreerde de ontdekking van traanproteoom met snelle, reproduceerbare en gebruiksvriendelijke procedures, als een universele, geoptimaliseerde monstervoorbereiding voor menselijke traanvloeistofanalyse. Met name de procedure voor het vangen van suspensie presteerde beter dan de monstervoorbereiding in de oplossing in termen van peptideherstel, eiwitidentificatie en kortere monstervoorbereidingstijd.
Introduction
Tear proteomics heeft aandacht gekregen om potentiële biomarkers voor oogziekten en aandoeningen 1,2,3,4,5,6 te onderzoeken, om toegang te krijgen tot de pathogenese van de oculaire en systemische aandoening, en om het voordeel van niet-invasieve traanmonsterafname met behulp van Schirmer-strips te benutten. De technologische vooruitgang van de volgende generatie massaspectrometrie heeft het mogelijk gemaakt om eiwitten te kwantificeren in tranen op microliterschaal met een nauwkeurigheid en precisie die in het verleden niet mogelijk waren. De methoden voor de voorbereiding van monsters zijn nog niet gestandaardiseerd. Een robuuste en gestandaardiseerde workflow voor monstervoorbereiding is essentieel voor het succes van klinische toepassing in onderzoek naar traaneiwitbiomarkers. De workflow voor monstervoorbereiding met suspensievanging (S-Trap) werd onlangs gerapporteerd als een effectieve en gevoelige methode voor monstervoorbereiding voor brede stroomafwaartse proteomische analyse 7,8. Toch is deze strategie niet goed gerapporteerd in de analyse van menselijk traanproteoom, presteerde het beter dan filterondersteunde monstervoorbereiding (FASP) en vertering in oplossing in termen van enzymatische verteringsefficiëntie en het grotere aantal eiwitidentificatie door massaspectrometrische analyse9. De op S-Trap gebaseerde benadering werd gedemonstreerd bij de bereiding van netvliesweefsel 10, formaline-gefixeerd, in paraffine ingebed (FFPE) weefsel 11, cellen 12, micro-organisme 13 en vloeibare biopsieën14,15.
Dit protocol beschrijft een geïntegreerde kwantitatieve workflow van klinische monsters tot enzymatisch verteerd eiwit voor de ontdekking van een niet-invasief traaneiwit-biomarkerpanel met een snelle, reproduceerbare en robuuste technische strategie. In het kort werd traanvocht opgevangen met behulp van een standaard Schirmer-strip en onmiddellijk gedroogd met een oogheelkundige frameverwarmer om eiwitautolyse bij kamertemperatuur te voorkomen. Ingebedde totale eiwitten werden geëxtraheerd met behulp van 5% natriumdodecylsulfaat (SDS) lysisbuffer volgens de suggestie van de fabrikant, gevolgd door eiwittestmeting. Het geëxtraheerde lysaat onderging vervolgens een standaardreductie met dithiothreitol (DTT) en alkylering met jodoacetamide (IAZ).
Na aanzuring met fosforzuur werd aan de geaggregeerde eiwitten een neerslagbuffer toegevoegd die 90% methanol en 100 mM triethylammoniumbicarbonaat (TEAB) bevatte. Het monster werd vervolgens overgebracht naar een nieuwe microkolom voor het vangen van suspensie. Enzymatische vertering met trypsine van sequentiegraad in een verhouding van 1:25 (w/w, trypsine: eiwit) bij 47 °C gedurende 1 uur. De resulterende peptiden werden vervolgens geëlueerd via centrifugatie, achtereenvolgens met 50 mM TEAB, 0,2% waterig mierenzuur (FA) en 50% acetonitril (ACN) met 0,2% FA. De geëlueerde peptiden werden vacuümgedroogd en gereconstitueerd in 0,1 % FA. De peptideconcentratie werd gemeten en aangepast naar 0,5 μg/μL voor massaspectrometrische analyse.
Protocol
Proefpersonen gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming voorafgaand aan deelname aan het onderzoek. De studie werd goedgekeurd door de Human Ethics Committee van de Hong Kong Polytechnic University en voldeed aan de principes van de Verklaring van Helsinki.
1. Afname van menselijk traanvocht met Schirmer-strip
- Draag handschoenen en ontsmet om besmetting van het monster te voorkomen.
- Controleer of de binnenverpakking intact, steriel en niet verlopen is.
- Buig de bovenkant van de Schirmer-strip iets naar binnen bij de 0 mm-markering, zoals aangegeven bij de halve cirkelpunt van de strip (Figuur 1).
- Verwijder de strip uit de binnenverpakking door het uiteinde van de strip vast te houden en vermijd direct contact met het monsterafnamegebied van 0 tot 25 mm.
- Vraag de proefpersoon om weg te kijken van de positie van de te plaatsen strip.
- Trek het onderste ooglid voorzichtig naar beneden en haak het uiteinde van de strip in de onderste fornix bij het laterale canthusgebied (Figuur 2). Herhaal dezelfde procedure op het andere oog.
- Vraag de proefpersoon om de oogleden voorzichtig te sluiten om irritatie tot een minimum te beperken.
- Verzamel traanvocht gedurende ongeveer 5 minuten of bij voorkeur 15-20 mm traanmonster werd verzameld.
- Vraag de proefpersoon om beide ogen te openen, trek het onderste ooglid voorzichtig naar beneden en verwijder de strips van het onderwerp.
- Inspecteer de gehydrateerde lengte op de Schirmer-strip en noteer de verzamelde hoeveelheid in mm.
- Droog de strip met een standaard, schone frameverwarming totdat de vloeistof volledig droog is.
NOTITIE: Overmatige verhitting die het filterpapier mogelijk zou kunnen verkolen, moet worden vermeden. - Plaats elke gedroogde Schirmer-strip in een gelabelde cryobuis en bewaar deze bij voorkeur op een koele, droge plaats in het donker tot verdere verwerking.
2. Bereiding van chemicaliën en reagentia
- Lysisbuffer (5% SDS, 50 mM TEAB, pH 7,5), 20 ml
- Pipetteer 1 ml 1 M TEAB en 80 μl 12% fosforzuur. Draai en sonicaat kort om luchtbellen te verwijderen. Vul tot 20 ml aan met gedeïoniseerd water.
- Weeg 1 g SDS af en voeg oscillerend toe aan de oplossing tot het is opgelost.
- Eiwitneerslagbuffer (90% methanol, 100 mM TEAB, pH 7,1), 10 ml
- Voeg 893 μL 1 M TEAB en 92 μL gedeïoniseerd water toe.
- Voeg 15 μl fosforzuur van 85 gew.% fosforzuur en 9 ml methanol toe aan de oplossing en draai kort.
- Spijsverteringsbuffer (50 mM TEAB), 1 ml
- Voeg 50 μL 1 M TEAB toe en vul aan tot 1 ml met gedeïoniseerd water.
- 200 mM dithiothreitol (DTT) oplossing, 500 μL
- Weeg 15 mg DTT af en los op in 500 μL gedeïoniseerd water; vortex kort.
NOTITIE: Voorbereiden voor gebruik.
- Weeg 15 mg DTT af en los op in 500 μL gedeïoniseerd water; vortex kort.
- 400 mM jodoacetamide (IAZ) oplossing, 200 μL
- Weeg 15 mg IAZ af en los op in 200 μL gedeïoniseerd water; vortex kort. NOTITIE: Bereid voor gebruik voor en vermijd licht.
- 0,2% mierenzuur, 50% acetonitril, 10 ml
- Bereid 10 ml 50% acetonitril in gedeïoniseerd water.
- Voeg 20 μL mierenzuur toe en draai kort.
- 0,2% mierenzuuroplossing, 10 ml
- Voeg 20 μL mierenzuur toe aan 10 ml gedeïoniseerd water en draai kort.
- 0,1% mierenzuuroplossing, 10 ml
- Voeg 10 μL mierenzuur toe aan 10 ml gedeïoniseerd water; vortex kort.
3. Eiwitextractie in Schirmerband
- Knip en gooi het voorste uiteinde voorbij de 0 mm-markering van de strip weg om mogelijke verontreiniging door het contact van conjunctivale weefsels met een schone roestvrijstalen schaar te verwijderen.
- Snijd de strip in tussenpozen van 1 mm in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml (figuur 3).
- Voeg 100 μL lysisbuffer toe aan de microcentrifugebuis en draai bij 1.000 tpm, kamertemperatuur gedurende 1 uur in een thermomixer.
- Centrifugeer kort en breng het supernatans over in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Verplaats de strips met een schone pincet in pipetpunten van 200 μl. Plaats de tips in hetzelfde buisje uit stap 3.4 met houder en centrifugeer bij kamertemperatuur bij 4.000 × g gedurende 1 minuut verder voor maximale opvang van het resterende monster op de strip.
- Meet de eiwitconcentratie met behulp van bicinchoninezuur (BCA) of een compatibele eiwittest.
4. Monstervoorbereiding met suspensie-vanger
- Normaliseer monsters tot 50 μg eiwit op basis van het resultaat van de eiwittest.
- Voeg 200 mM DTT in een verhouding van 1:10 (v/v, DTT: monster) toe tot een eindconcentratie van 20 mM DTT en incubeer gedurende 10 minuten bij 95 °C.
- Koel de eiwitoplossing af tot kamertemperatuur.
- Voeg 400 mM IAZ toe in een verhouding van 1:10 (v/v, IAZ: monster) tot een eindconcentratie van 40 mM IAZ en incubeer gedurende 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
- Voeg 12% waterig fosforzuur toe in een verhouding van 1:10 (v/v, zuur: monster) tot een eindconcentratie van 1,2% fosforzuur en draai kort.
- Voeg eiwitbindende buffer toe in een verhouding van 1:6 (v/v, monster: buffer) en draai kort.
OPMERKING: In deze stap moet colloïdaal eiwitdeeltje worden gevormd en zal de oplossing doorschijnend lijken als de hoeveelheid eiwit voldoende is. - Maak de dop van de Suspension Trapping Micro Spin Column los en monteer de spinkolom op een microcentrifugebuis van 2 ml om de doorstroming op te vangen.
- Voeg maximaal 200 μL aangezuurd eiwitlysaatmengsel toe aan de kolom.
- Centrifugeer de kolom bij 4.000 × g gedurende 20 s. Eiwitdeeltjes werden opgesloten; Herhaal dit totdat de monsters in de kolom zijn geladen.
- Voeg 150 μL eiwitbindingsbuffer toe en centrifugeer gedurende 20 s bij 4.000 × g om het gesuspendeerde eiwit te wassen. Herhaal 3x.
- Monteer de Suspension Trapping Micro Column op een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Voeg 20 μL 50mM TEAB-digestiebuffer met protease in een verhouding van 1:25 (m/g, trypsine: eiwit) toe aan het filter in de spinkolom, vermijd luchtbellen en luchtspleet tussen het filter en de digestieoplossing.
- Sluit de Suspension Trapping Micro Spin Column af om verdamping te voorkomen. Incubeer bij 47 °C gedurende 1 uur in een thermomixer; Niet schudden of wervelen tijdens de spijsvertering.
- Elute peptiden met 40 μL 50 mM TEAB door middelpuntvliedende kracht bij 4.000 × g gedurende 20 s.
- Voeg 40 μl 0,2% FA toe en centrifugeer gedurende 20 s bij 4.000 × g .
- Voeg 35 μl 0,2% FA, 50% acetonitril toe en centrifugeer gedurende 20 s bij 4.000 × g .
- Pool drie eluates en droog met een vacuümcentrifuge.
- Bewaren bij -80 °C ultra-lage temperatuur vriezer tot verdere analyse. OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
5. Reconstitueer peptiden voor massaspectrometrie-analyse
- Reconstitueer het monster met 12 μL 0,1% FA, vortex en centrifugeer kort.
- Meet de peptideconcentratie met een Peptide Assay Kit.
- Normaliseer de peptideconcentratie tot 0,5 μg/μL in 0,1% FA.
- Breng het peptidemengsel over in een autosampler-flacon en klaar voor massaspectrometrie-analyse.
6. Monsterverwerving door vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie
- Laad 3 μg van het peptide met isocratische laadbuffer (0,1% FA, 5% ACN) in een valkolom (C18, 5 μm, 100 μm, 20 mm) met een stroomsnelheid van 2 μL/min gedurende 15 min.
- Fractioneer de peptiden met behulp van een omgekeerde fase nano-analytische kolom (C18, 5 μm, 100 μm, 300 mm) met een stroomsnelheid van 350 nL/min in een scheidingsgradiënt van 155 minuten. Gebruik mobiele fase A bestaande uit een mengsel van 0,1% mierenzuur (v/v), 5% ACN (v/v) in water en mobiele fase B met 0,1% FA (v/v), 98% ACN (v/v) in water. Gebruik de volgende gradiënt: 0-0,5 min: 5% B, 0,5-90 min: 10% B, 90-120 min: 20% B, 120-130 min: 28% B, 130-135 min: 45% B, 135-141 min: 80% B, 141-155 min: 5% B.
- Voer data-afhankelijke acquisitie (DDA) uit met een TOF-MS-scanbereik tussen 350 en 1800 m/z met een accumulatietijd van 250 ms en een dynamische doeluitsluitingstijd van 18 s. Voer vervolgens een MS/MS-scan uit met een snelheid van 100 tot 1.800 m/z in de modus met hoge gevoeligheid met een accumulatietijd van 50 ms voor de top 50 precursoren per cyclus met een drempel van 125 cps voor MS/MS-signaal met een laadtoestand van +2 tot +4.
- Analyseer ruwe gegevens met de software waarnaar wordt verwezen of andere compatibele engines met een referentiedatabase in FASTA uit de openbaar toegankelijke UniProt-database.
Representative Results
Dit protocol maakt het mogelijk om traanmonsters te verzamelen met Schirmer-strips die droog bij kamertemperatuur worden bewaard voordat het monster vervolgens wordt voorbereid voor massaspectrometrie-analyse. Filterondersteunde monstervoorbereiding (FASP)-workflow met microkolom voor suspensie-opvang maakte een snelle monstervoorbereiding binnen enkele uren mogelijk, vergeleken met algemeen aanvaarde in-solution digestieprocedures op dagen die een nacht incubatie vereisen. Het rendement van de peptideterugwinning was significant hoger (p < 0,001) dan het standaard verteringsprotocol in de oplossing en met een goede reproduceerbaarheid bij een variatiecoëfficiënt (%CV) < 7%. Een pool van traanmonsters werd herhaald in zes technische replicaten met 74,2 ± 5,0% peptideherstel en 52,8 ± 1,6% peptideherstel in monsters bereid met in-solution procedures. Een gepoold traanmonster met een eiwithoeveelheid van 36,3 μg werd op de Schirmer-strip geprikt en geëxtraheerd zoals eerder beschreven, de extractie-efficiëntie van eiwit was 81% (29,5 ± 6,8 μg, gemiddelde ± SD).
Beide workflows laadden 3 μg peptiden op de MS, en de DDA-zoekopdracht leverde in totaal 1.183 ± 118 eiwitten (5.757 ± 537 verschillende peptiden) en 874 ± 70 eiwitten (4.400 ± 328 peptiden) op bij 1% FDR in respectievelijk de suspensievanggroep en de groep in oplossing. Analyse van genontologie (GO) met behulp van het PANTHER-classificatiesysteem onthulde zeer vergelijkbare proteomen voor beide benaderingen, waarbij binding, katalytische activiteit en moleculaire functieregulatie hun belangrijkste moleculaire functies waren (Figuur 4).
Afbeelding 1: Buig de bovenkant van de Schirmer-strip bij de 0 mm-markering voordat u deze aanbrengt. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Positie van de Schirmer-strip tijdens het verzamelen van scheuren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Illustratie van de behandeling van Schirmer-strips vóór eiwitextractie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Cirkeldiagram ter illustratie van de genontologieanalyse voor de proteomen die zijn geïdentificeerd met behulp van de workflow in de oplossing en de workflow voor het vangen van suspensie, met behulp van het PANTHER-classificatiesysteem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Om nauwkeurige resultaten te bereiken met deze methode, moeten bij alle procedures vanaf het afnemen van traanmonsters stroomvrije wegwerphandschoenen worden gedragen om monsterbesmetting te voorkomen. Het is belangrijk om luchtbellen en luchtspleten tussen het filter en de monsteroplossing in elke stap te vermijden door gebruik te maken van microdraaiende kolommen. Als het monstervolume groter is dan de capaciteit van de kolommen, wordt aanbevolen om het proces te herhalen. Dit protocol heeft bewezen efficiënter te zijn dan het traditionele protocol in de oplossing in termen van bereidingstijd, eiwitherstel en totale eiwitidentificatie. Dit komt grotendeels omdat de monsters de meeste vereiste procedures op dezelfde kolom ondergaan, in tegenstelling tot de methode in oplossing waarbij meerdere overdrachtsstappen betrokken zijn, zoals acetonprecipitatie, vertering en opruiming (ontzouten), wat de kans op variaties in de resulterende gegevens vergroot.
Naast de traanmonsters die zijn verzameld met de microcapillaire methode16,17, biedt deze FASP-workflow met suspensie-vangende microkolom een alternatieve monstervoorbereidingsmethode die een snelle en robuuste traanmonstervoorbereiding mogelijk maakt die is verzameld met behulp van Schirmer-strips, met minimale materiaalvoorbereiding en gebruiksvriendelijke stappen die moeten worden gevolgd. Dit maakt reproduceerbare traanmonstervoorbereiding mogelijk voor grote cohortstudies bij meerdere oogziekten of aandoeningen met verbeterd peptideherstel en eiwitidentificatie door MS ten opzichte van procedures in oplossing. Dit betrouwbare proces kan regelmatig worden gebruikt bij de voorbereiding van traanbiomarkermonsters voor onderzoek en andere klinische doeleinden. Het belangrijkste is dat het minimale training van het personeel vereist voor het verzamelen ter plaatse en dat het niet nodig is om monsters in een vriezer op te slaan. Monsters worden ter plaatse gedroogd om autolyse en afbraak van eiwitten tot een minimum te beperken. Dit maakt dus gemakkelijke verzending per post mogelijk om stroomafwaartse analyse te vergemakkelijken, in tegenstelling tot het gebruik van microcapillaire buizen.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het InnoHK-initiatief en de regering van de Speciale Administratieve Regio Hongkong; Onderzoekscentrum voor SHARP Vision; en het Research Centre for Chinese Medicine Innovation (RCMI) van de Hong Kong Polytechnic University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9 mm Plastic Screw Thread Vials | Thermo Scientific | C4000-11 | |
| Acetonitrile, LCMS Grade | Anaqua | AC-1026 | |
| Centrifuge MiniSpin plus | Eppendorf | 5453000097 | |
| DL-dithiothreitol (DTT), BioUltra | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Formic acid, ACS reagent, ≥96% | Sigma-Aldrich | 695076 | |
| Frame Heater OPTIMONSUN Electronic | Breitfeld & Schliekert GmbH | 1203166 | |
| Iodoacetamide (IAA), BioUltra | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol, HPLC Grade | Anaqua | MA-1292 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes, 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 368632 | |
| Phosphoric acid, 85 wt.% in H2O | Sigma-Aldrich | 345245 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry | Sciex | TripleTOF 6600 | |
| Schirmer Ophthalmic Strips | Entod Research Cell UK Ltd | I-DEW Tearstrips | |
| S-Trap Micro Column | Protifi | C02-micro-80 | |
| SureSTART 9 mm Screw Caps | Thermo Scientific | CHSC9-40 | |
| Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M | Sigma-Aldrich | 18597 | |
| Ultra-performance Liquid Chromatography | Eksigent | NanoLC 400 | |
| UltraPure Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 |
References
- Ma, J. Y. W., Sze, Y. H., Bian, J. F., Lam, T. C. Critical role of mass spectrometry proteomics in tear biomarker discovery for multifactorial ocular diseases (Review). International Journal of Molecular Medicine. 47 (5), 83 (2021).
- Tse, J. S. H., et al. Integrating clinical data and tear proteomics to assess efficacy, ocular surface status, and biomarker response after orthokeratology lens wear. Translational Vision Science & Technology. 10 (11), 18 (2021).
- Cheung, J. K., et al. Human tear proteome dataset in response to daily wear of water gradient contact lens using SWATH-MS approach. Data in Brief. 36, 107120 (2021).
- Tse, J. S., et al. Data on assessment of safety and tear proteome change in response to orthokeratology lens - Insight from integrating clinical data and next generation proteomics. Data in Brief. 29, 105186 (2020).
- Zhan, X., Li, J., Guo, Y., Golubnitschaja, O. Mass spectrometry analysis of human tear fluid biomarkers specific for ocular and systemic diseases in the context of 3P medicine. The EPMA Journal. 12 (4), 449-475 (2021).
- Ponzini, E., et al. Mass spectrometry-based tear proteomics for noninvasive biomarker discovery. Mass Spectrometry Reviews. 41 (5), 842-860 (2022).
- HaileMariam, M., et al. S-Trap, an ultrafast sample-preparation approach for shotgun proteomics. Journal of Proteome Research. 17 (9), 2917-2924 (2018).
- Ding, H., et al. Urine proteomics: evaluation of different sample preparation workflows for quantitative, reproducible, and improved depth of analysis. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1857-1862 (2020).
- Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
- Sze, Y. H., et al. High-pH reversed-phase fractionated neural retina proteome of normal growing C57BL/6 mouse. Scientific Data. 8 (1), 27 (2021).
- Marchione, D. M., et al. HYPERsol: High-quality data from archival FFPE tissue for clinical proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (2), 973-983 (2020).
- Chhuon, C., et al. A sensitive S-Trap-based approach to the analysis of T cell lipid raft proteome. Journal of Lipid Research. 61 (11), 1512-1523 (2020).
- Hayoun, K., et al. Evaluation of sample preparation methods for fast proteotyping of microorganisms by tandem mass spectrometry. Frontiers in Microbiology. 10, 1985 (2019).
- Templeton, E. M., et al. Comparison of SPEED, S-Trap, and in-solution-based sample preparation methods for mass spectrometry in kidney tissue and plasma. International Journal of Molecular Sciences. 24 (7), 6290 (2023).
- Ding, Z., Wang, N., Ji, N., Chen, Z. S. Proteomics technologies for cancer liquid biopsies. Molecular Cancer. 21 (1), 53 (2022).
- Nättinen, J., Aapola, U., Jylhä, A., Vaajanen, A., Uusitalo, H. Comparison of capillary and Schirmer strip tear fluid sampling methods using SWATH-MS proteomics approach. Translational Vision Science & Technology. 9 (3), 16 (2020).
- Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: from sampling to preanalytical processing. Scientific Reports. 11 (1), 10064 (2021).
