Summary
该协议展示了一种独特的小鼠卒中模型，具有中等大小的梗死和出色的生存率。该模型允许临床前卒中研究人员延长缺血持续时间，使用老年小鼠，并评估长期功能结果。
Abstract
在实验性卒中研究中，带有腔内细丝的大脑中动脉闭塞 （MCAO） 被广泛用于模拟小鼠缺血性卒中。细丝MCAO模型通常在C57Bl / 6小鼠中表现出巨大的脑梗死，有时包括大脑后动脉供应区域的脑组织，这主要是由于后交通动脉闭锁的高发生率。这种现象被认为是在细丝MCAO后长期卒中恢复期间在C57Bl / 6小鼠中观察到的高死亡率的主要原因。因此，许多慢性卒中研究都利用了远端MCAO模型。然而，这些模型通常只在皮层区域产生梗死，因此，中风后神经功能缺损的评估可能是一个挑战。本研究建立了一种改良的经颅 MCAO 模型，其中躯干处的 MCA 通过 一个小颅窗永久或短暂地部分闭塞。由于闭塞位置相对靠近 MCA 的起源，因此该模型会在皮层和纹状体中产生脑损伤。该模型的广泛表征表明，即使在老年小鼠中也具有出色的长期存活率，并且易于检测到神经功能缺损。因此，这里描述的MCAO小鼠模型代表了实验性中风研究的宝贵工具。
Introduction
在美国，每年有近 800,000 人患有中风，其中大多数是缺血性的1。及时使用组织纤溶酶原激活剂（tPA）和/或血栓切除术恢复脑血流是目前对脑卒中患者最有效的治疗方法;然而，从长远来看，神经功能的完全恢复是罕见的2,3。因此，寻找以功能改善为目标的新型卒中疗法是一个紧张的研究领域，需要临床相关的卒中动物模型。
啮齿动物中最常见的缺血性卒中模型使用腔内大脑中动脉闭塞 （MCAO） 来诱发卒中。在这个模型中，最初由 Zea Longa 于 1989 年开发，将尼龙丝引入颈内动脉 （ICA） 以阻止流向大脑中动脉 （MCA）4。但是，这种模式有局限性。首先，当细丝插入ICA时，流向大脑后动脉（PCA）的血流也可能被部分阻塞，特别是在小鼠中。至关重要的是，后交通动脉 （PcomA） 是连接大脑前循环和后脑循环的小动脉，在某些小鼠品系中经常发育不全，例如 C57Bl/6，该菌株主要用于实验性卒中研究。PcomA 的这种通畅性被认为有助于卒中后小鼠病变大小的变异性5.事实上，当 MCAO 期间流向 PCA 的血流量急剧下降，并且 PcomA 无法提供足够的侧支血流时，中风梗死可以扩展到 PCA 的领域。此外，在该模型中，长时间的缺血导致小鼠死亡的几率更高。因此，通常在小鼠中使用30-60分钟的短MCAO持续时间。然而，大多数卒中患者在再灌注治疗前会经历几个小时的缺血。因此，具有较长缺血持续时间的小鼠卒中模型具有高度的临床相关性。
该程序的总体目标是模拟具有中等大小梗死和出色存活率的小鼠的缺血性中风。这种经颅MCAO模型解决了临床中风的关键属性，因为可以进行长时间的缺血，并且老年小鼠对这种模型的耐受性很好，可以对功能恢复进行长期评估。
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Protocol
这项工作中描述的所有程序均按照美国国立卫生研究院关于研究动物护理和使用指南进行，该协议已获得杜克研究所动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。本研究使用年轻（8-10周龄）和年龄（22个月大）雄性C57Bl/6小鼠。该协议的概述如图 1所示。
1. 手术准备
- 检查小鼠的严重异常和行为缺陷。
注意：手术前，外科医生必须穿戴适当的 PPE（个人防护设备），包括外科口罩、帽子、手套和防护服。 - 称量鼠标;根据体重对呼吸机进行编程（参见 材料表）。
- 将鼠标放入 4 英寸 x 4 英寸 x 7 英寸的麻醉诱导盒中。打开设置为 30 的氧气流量计（参见 材料表）和设置为 70 的一氧化二氮流量计。用 5% 异氟烷打开蒸发器。
- 将导丝插入 20 G 静脉内 （IV） 导管。
- 当鼠标的呼吸频率降低到每分钟 30-40 次呼吸时，将鼠标从感应箱中取出。
- 将鼠标以仰卧位放在手术台上。将鼠标的舌头拉出并用左手的手指握住它。将喉镜（见 材料表）插入动物的嘴里，以观察声带。
- 用右手中指稳定喉镜上的鼠标下巴。释放左手握住 20 G IV 导管。
- 将导丝轻轻插入声带，然后将 20 G IV 导管缓慢推入气管，直到导管的翼部与鼻尖齐平。
注意： 如果鼠标正在移动，请勿插入电线。这可能会导致气管创伤和出血。 - 打开呼吸机（见 材料表），并将其与插入鼠标的 20 G IV 导管连接。将异氟醚降至1.5%，并确保双肺机械通气。
注意：不要忘记降低异氟烷浓度。否则，小鼠将接受过量的麻醉。 - 将眼膏涂抹在双眼上，皮下注射 5 mg/kg 卡洛芬。
- 将鼠标保持在横向位置，右侧颞区朝上。使用加热垫（35°C）和由温度调节器控制的加热灯将直肠温度保持在37°C（参见 材料表）。
- 剃掉右眼和耳朵之间的表面积，并用碘和酒精棉签对手术区域进行至少三次消毒。
2. MCAO手术
- 打开用于MCAO手术的无菌器械包。戴上无菌手套，用手术剪刀在右眼和右耳之间做一个1厘米的皮肤切口。
注意： 每 15 分钟监测一次肤色、体温和对脚趾捏的反应。 - 用镊子解剖下面的筋膜，露出颞肌和咬肌。
注意：注意不要损坏腮腺。 - 用镊子触摸颞肌下部，检测颧弓的位置。小心地拉开面神经的分支。
- 使用高温烧灼环的尖端（参见 材料表）在颞肌上切开 5 毫米的横向切口。
- 使用两把镊子解剖下面的颧弓，露出上颌骨和颧骨之间的关节。
- 用剪刀剪下颧弓的 3 毫米部分并将其移除。将咬肌与颅底分开。
注意：注意不要使眶后窦和颞浅静脉骨折。 - 应用四个位于不同方向的小牵开器，露出颅骨底部，三叉神经分支由一个牵开器横向拉动。
注意：颅底外表面的沟标志着额叶和颞叶之间侧裂的位置。MCA位于此处（图2A），通过薄而透明的头骨可以看到其躯干和树枝（图2B）。该动脉与其他主要脑动脉的关系如图 2A所示。 - 在MCA躯干上方和鼻皮质分支近端的头骨上滴0.9%生理盐水。使用电动研磨机使颅骨变薄，直到可见小骨折。
注意： 请勿将研磨机推到颅骨上，因为它可能会穿透颅骨并伤害下面的动脉。 - 使用镊子的尖端提起变薄的头骨并将其取出。对于假老鼠，请停在这里，不要结扎动脉。
注意： 在 MCA 干线上形成一个小矩形窗口。 - 在MCA顶部放置一圈黑色编织丝的单股环（图2C）。插入 8-0显微手术针提起MCA躯干，并在针头下方系紧缝线（见 材料表），将针头的两端留在丝线环结的顶部（图2D）。
- 对于短暂的MCAO，将针头下方的丝线结稍微收紧以阻断动脉血流（图2E），代表MCAO发作。
- 使用镊子固定缝合线，并在缺血结束时（例如，60 分钟或更长时间）慢慢取出针头。
注意：当针头被移除时，丝线结从MCA上滑落，大脑被重新灌注（图2F）。 - 对于永久性 MCAO，用力拧紧动脉周围的丝线环，然后取出针头。切割并去除多余的缝合材料。
- 在皮肤切口处滴一滴0.25%布比卡因，间歇性地使用6-0尼龙缝合线将肌肉和皮肤分开缝合（见 材料表）。将抗生素软膏涂抹在皮肤切口表面。
注意：皮肤切口也可以用无菌订书钉或胶水闭合。
3. 术后护理
- 关闭异氟醚以唤醒鼠标。恢复自主呼吸后断开呼吸机。
- 将鼠标转移到温度受控的恢复室（参见 材料表）。
- 当鼠标的矫正反射恢复或开始移动时拔管。
- 在温度和湿度受控的室中密切监视鼠标。在小鼠获得完全意识后（恢复期~2小时），将小鼠放回家笼中。每天皮下注射 5 mg/kg 卡洛芬，持续 3 天。
4. 激光散斑对比成像（LSCI）
- MCAO后6小时和24小时，将麻醉的小鼠安装在立体定位框架上。剃掉头顶，并用三支交替的碘和酒精棉签清洁。
注意：麻醉是按照步骤1.3所述进行的。LSCI 也在 MCAO 之前进行。 - 做一个 3 厘米的中线皮肤切口，并从颅骨上解剖皮肤。使用四个小针牵开器暴露颅骨顶部。
- 将激光散斑相机（参见 材料表）移动到头顶上方，然后调整相机的焦距。对脑血流进行成像。
5. 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色
- 在实验结束时用5%异氟醚深度麻醉小鼠，通常在中风后第1天，第3天或第28天。捏住尾巴以确保没有疼痛反应。
- 用手术剪刀将小鼠斩首并收获大脑。将大脑在冰冷的盐水中孵育20分钟。
- 将大脑放入冰上的脑切片机基质中，然后将冷盐水滴在大脑上。使用薄剃须刀片将大脑切成 1 毫米的薄片。
- 将相同方向的脑切片浸入2%TTC溶液的培养皿中（参见 材料表）。将盘子在室温下避光15分钟。
注意：正常脑组织变红，缺血组织保持白色。 - 将脑切片转移到10%福尔马林中固定24小时。对脑切片进行成像并测量梗死区域。
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Representative Results
在手术显微镜下直接观察，可以目视确认缺血期间MCA血流受阻。我们之前的研究表明，使用激光多普勒监测仪 6 >缺血区域的血流量减少了80%。为了确定MCAO后血流变化，LSCI可用于进一步确认缺血性损伤和再灌注（图1）。事实上，在图3A中，观察到右侧MCA区域的血液供应减少。对于瞬时MCAO，拆线后，脑血流的再灌注很明显（图3B），并在24小时后进一步改善（图3C）。中风脑可在24小时后切片并用TTC染色。坏死组织不与TTC反应，保持白色（图1）。TTC染色表明，该模型在皮质和外侧纹状体区域均产生梗死组织，并且与细丝MCAO相比，梗死大小适中（图4）。该模型已应用于年轻和老年动物，在28天的观察中发现死亡率（<5%）可以忽略不计7。
该模型导致运动和感觉障碍，主要发生在左前爪。我们之前的研究表明，中风小鼠存在神经功能缺损，如各种行为测试所证明，例如圆柱体测试、旷场测试、胶带去除测试、杆测试和 Von Frey 灯丝测试6、8、9、10。与假手术小鼠相比，接受 90 分钟经颅 MCAO 的小鼠也表现出认知缺陷6。尽管尚未在老年小鼠中系统检查经颅MCAO后的长期功能结果，但在老年大鼠中进行的类似模型清楚地显示了中风后28天内的神经功能缺损7。
图 1：协议概述。 在小鼠中，右侧MCA通过一个小颅骨窗口短暂或永久闭塞。TTC染色和LSCI分别用于确定梗死面积和评估缺血后脑血流量。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：经颅 MCAO 手术的步骤 。 （A） 结扎的 MCA 的位置。（B） MCA躯干及其分支的暴露。（C） 将单股丝线缝合线放置在 MCA 上方。（D） 安 8-0用针抬起MCA躯干，缝合线绑在针下。（E） 缝合线稍微收紧以阻断血流。（F） 移除针头和缝合线以允许再灌注。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：MCAO 中延迟再灌注的激光散斑对比图像 。 （A）右半球灌注区较低（红色箭头），提示缺血。（B）缺血6 h后，拆线允许再灌注，动脉分支可见。（C）24 h后，这些动脉分支的血流灌注得到改善。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：与灯丝 MCAO 的区别 。 （A）灌注墨水的大脑显示大脑表面的血管。红色箭头指向 MCA 躯干，该躯干在这种经颅 MCAO 模型中被结扎。绿色箭头指向 MCA 原点，即灯丝 MCAO 模型中 MCA 闭塞的部位。脑梗死在卒中后 24 小时在 TTC 染色的脑载玻片上可见。这里的样品来自（B）年轻小鼠的60分钟细丝MCAO，以及（C）年轻（8-10周龄）的永久性经颅MCAO，以及（D）年龄的C57Bl / 6小鼠（22个月大）。正常组织为红色，梗死组织为白色。该模型中的梗死面积适中，梗死区域包括皮质和纹状体。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
1981 年在大鼠中建立了第一个经颅 MCA 闭塞模型11,12，并于 1989 年被无颅切除术 MCAO 模型取代4.最初的经颅 MCA 闭塞具有较宽的手术区域，因此整个颧弓被切除，肌肉被横向拉扯。手术后局部组织肿胀，导致动物压力和食物摄入量减少。在我们改良的经颅MCAO模型中，切口的侵入性较小，并且只切除了一小部分颧弓。使用四个小针牵开器暴露手术区域，没有血管或神经被破坏。一个小的颅骨窗口就足够了，因为使用 8-0 抬起 MCA 躯干手术缝合针，整个针不需要在MCA下。手术后未发现局部组织肿胀6。
这种模式有几个优点。首先，它会产生一个包括皮层和皮层下区域的梗死区域，因此，可以很容易地评估神经功能缺损。其次，在该模型中可以诱发短暂性和永久性缺血性卒中。重要的是，可以延长缺血持续时间来模拟晚期再灌注。例如，在我们之前的卒中研究中，成功进行了 6 小时的 MCAO9。第三，对 PcomA 的侧支血液供应和再灌注的依赖性最小，这降低了卒中严重程度的变异性。最后，几乎所有的小鼠，甚至是老年小鼠，都可以在长期的功能研究中存活下来。综上所述，该模型具有出色的临床相关性。
值得注意的是，这种笔画模型有局限性。首先，需要高水平的显微外科技能。新手动物外科医生可能需要一些时间在立体显微镜下完善开颅手术和 MCA 结扎术。仔细执行研磨、颅骨移除和缝合放置是成功实施该模型的关键。此外，在每只动物的同一位置结扎 MCA 至关重要。其次，在该模型中，脑膜被针头轻微损伤，在针对脑膜的研究中可能需要考虑这一点。最后，尽管可以进行缺血持续时间 >6 小时，但必须通过用激光多普勒或激光散斑成像测量脑血流量来确认再灌注。
总之，这种改良的小鼠卒中模型诱导中度脑损伤，能够在老年和卒中合并症的动物中进行长期生存实验，并有望推进实验性卒中研究和新药开发，以改善卒中结果。
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Disclosures
所有作者均无利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢 Kathy Gage 的编辑支持。方案数字是用 BioRender.com 创建的。这项研究得到了麻醉学系（杜克大学医学中心）和 NIH 资助（NS099590、HL157354、NS117973 和 NS127163）的资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% bupivacaine | Hospira | NDC 0409-1159-18 | |
| 0.9% sodium chloride | ICU Medical | NDC 0990-7983-03 | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC) | Sigma or any available vendor | ||
| 20 G IV catheter | BD | 381534 | 20 GA 1.6 IN |
| 30 G needle | BD | 305106 | |
| 4-0 silk suture | Look | SP116 | Black braided silk |
| 8-0 suture with needle | Ethilon | 2822G | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Anesthesia induction box | Any suitable vendor | Pexiglass make | |
| Electrical grinder | JSDA | JD 700 | |
| High temperature cautery loop tip | Bovie | AA03 | |
| Isoflurane | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| Laser doppler perfusion monitor | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | |
| Lubricant eye ointment | Bausch + Lomb | 339081 | |
| Mouse rectal probe | Physitemp | RET-3 | |
| Nitrous Oxide | Airgas | UN1070 | |
| Otoscope | Welchallyn | 728 | 2.5 mm Speculum Otoscope served as a laryngoscope to visualize vocal cords in mice |
| Oxygen | Airgas | UN1072 | |
| Povidone-iodine | CVS | 955338 | |
| Recovery box | Brinsea | TLC eco | |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | 6100701 | Injectable 50 mg/mL |
| Rodent ventilator | Kent Scientific | Rodent Jr. | |
| Temperature controller | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Triple antibioric & pain relief | CVS | NDC 59770-823-56 | |
| Vaporizer | RWD | R583S |
References
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