En modificeret transkraniel midterste cerebral arterieokklusionsmodel til undersøgelse af slagtilfælderesultater hos ældre mus

Summary

Denne protokol demonstrerer en unik museslagmodel med et mellemstort infarkt og en fremragende overlevelsesrate. Denne model gør det muligt for prækliniske slagtilfældeforskere at forlænge iskæmiens varighed, bruge ældre mus og vurdere langsigtede funktionelle resultater.

Abstract

I eksperimentel slagtilfældeforskning anvendes midterste cerebral arterieokklusion (MCAO) med et intraluminalt filament i vid udstrækning til at modellere iskæmisk slagtilfælde hos mus. MCAO-filamentmodellen udviser typisk et massivt cerebralt infarkt i C57Bl/6-mus, der undertiden inkluderer hjernevæv i det område, der leveres af den bageste cerebrale arterie, hvilket i vid udstrækning skyldes en høj forekomst af posterior kommunikerende arterieatresi. Dette fænomen anses for at være en væsentlig bidragyder til den høje dødelighed, der observeres hos C57Bl/6-mus under langvarig slagtilfælde efter filament MCAO. Således udnytter mange kroniske slagtilfældeundersøgelser distale MCAO-modeller. Imidlertid producerer disse modeller normalt kun infarkt i cortexområdet, og derfor kan vurderingen af neurologiske underskud efter slagtilfælde være en udfordring. Denne undersøgelse har etableret en modificeret transkraniel MCAO-model, hvor MCA ved bagagerummet er delvist lukket enten permanent eller forbigående via et lille kranievindue. Da okklusionsstedet er relativt proksimalt til MCA's oprindelse, genererer denne model hjerneskade i både cortex og striatum. Omfattende karakterisering af denne model har vist en fremragende langsigtet overlevelsesrate, selv hos ældre mus, såvel som let påviselige neurologiske underskud. Derfor repræsenterer MCAO-musemodellen, der er beskrevet her, et værdifuldt værktøj til eksperimentel slagtilfældeforskning.

Introduction

Næsten 800.000 mennesker lider af et slagtilfælde i USA hvert år, og de fleste af disse slagtilfælde er iskæmiske i naturen¹. Tidlig genopretning af cerebral blodgennemstrømning med vævsplasminogenaktivator (tPA) og / eller trombektomi er i øjeblikket den mest effektive behandling for slagtilfældepatienter; Imidlertid er fuld genopretning af neurologiske funktioner på lang sigt sjælden ^2,3. Således er søgning efter ny slagtilfældebehandling, der er målrettet mod funktionel forbedring, et intenst forskningsområde, der kræver klinisk relevante dyremodeller for slagtilfælde.

Den mest almindelige iskæmiske slagtilfælde model hos gnavere bruger intraluminal midterste cerebral arterieokklusion (MCAO) til at inducere slagtilfælde. I denne model, oprindeligt udviklet af Zea Longa i 1989, indføres en nylonfilament i den indre halspulsåre (ICA) for at blokere blodgennemstrømningen til den midterste hjernearterie (MCA)⁴. Denne model har dog begrænsninger. For det første, når filamentet indsættes i ICA, kan blodgennemstrømningen til den bageste cerebrale arterie (PCA) også delvist blokeres, især hos mus. Kritisk er den bageste kommunikerende arterie (PcomA), en lille arterie, der forbinder forreste og bageste cerebrale kredsløb, ofte underudviklet i nogle musestammer, såsom C57Bl / 6, stammen overvejende anvendt i eksperimentel slagtilfældeforskning. Denne patency af PcomA menes at bidrage til variabiliteten i læsionsstørrelse hos mus efter slagtilfælde⁵. Når blodgennemstrømningen til PCA falder brat under MCAO, og PcomA ikke er i stand til at tilvejebringe tilstrækkelig sikkerhedsstillelse blodgennemstrømning, kan slagtilfældeinfarkt ekspandere ind i PCA's område. Desuden fører en lang varighed af iskæmi i denne model til en højere chance for dødelighed hos mus. Derfor bruges en kort MCAO-varighed på 30-60 min typisk til mus. Imidlertid oplever de fleste slagtilfældepatienter et par timers iskæmi før reperfusionsbehandling. Således er en museslagmodel med en forlænget varighed af iskæmi af høj klinisk relevans.

Det overordnede mål med denne procedure er at modellere iskæmisk slagtilfælde hos mus, der har et mellemstort infarkt og en fremragende overlevelsesrate. Denne transkranielle MCAO-model adresserer kritiske egenskaber ved klinisk slagtilfælde, da langvarig iskæmi kan udføres, og ældre mus tolererer denne model godt, hvilket muliggør den langsigtede vurdering af funktionel genopretning.

Protocol

Alle procedurer beskrevet i dette arbejde udføres i overensstemmelse med NIH-retningslinjerne for pleje og brug af dyr i forskning, og protokollen blev godkendt af Duke Institute Animal Care and Use Committee (IACUC). Unge (8-10 uger gamle) og ældre (22 måneder gamle) C57Bl/6 hanmus blev anvendt til dette studie. En oversigt over denne protokol er illustreret i figur 1.

1. Kirurgisk forberedelse

1. Undersøg musen for grove abnormiteter og adfærdsmæssige underskud.
   BEMÆRK: Før operationen er det vigtigt for kirurger at bære passende PPE (beskyttende personligt udstyr), herunder kirurgisk maske, hætte, handsker og kjole.
2. Vej musen; programmere ventilatoren (se materialetabel) baseret på kropsvægten.
3. Placer musen i en 4 i x 4 i x 7 i anæstesiinduktionsboks. Tænd for iltflowmåleren (se materialetabellen), der er indstillet til 30, og lattergasflowmåleren, der er indstillet til 70. Tænd fordamperen med 5% isofluran.
4. Styretråden sættes ind i det intravenøse (IV) kateter på 20 G.
5. Tag musen ud af induktionsboksen, når respirationsfrekvensen reduceres til 30-40 vejrtrækninger pr. Minut.
6. Læg musen på den kirurgiske bænk i liggende stilling. Træk musens tunge ud og hold den med fingrene på venstre hånd. Indsæt et laryngoskop (se Materialetabel) i dyrets mund for at visualisere stemmebåndet.
7. Stabiliser musehagen på laryngoskopet ved hjælp af højre langfinger. Frigør venstre hånd for at holde 20 G IV-kateteret.
8. Indsæt styretråden lidt i stemmebåndet, og skub derefter langsomt 20 G IV-kateteret ind i luftrøret, indtil kateterets vingedel bliver jævn med næsespidsen.
   BEMÆRK: Hvis musen bevæger sig, må du ikke indsætte ledningen. Dette kan forårsage traumer i luftrøret og blødning.
9. Tænd for ventilatoren (se materialetabellen), og tilslut den til det 20 G IV-kateter, der er intuberet i musen. Isofluran reduceres til 1,5 %, og det sikres, at begge lunger ventileres mekanisk.
   BEMÆRK: Glem ikke at reducere isoflurankoncentrationen. Ellers vil musen modtage en overdosis anæstesi.
10. Påfør øjensalve på begge øjne og injicer 5 mg/kg carprofen subkutant.
11. Hold musen i en lateral position med det højre tidsmæssige område opad. Rektaltemperaturen holdes på 37 °C ved hjælp af en varmepude (35 °C) og en varmelampe, der styres af en temperaturregulator (se materialetabellen).
12. Barber overfladearealet mellem højre øje og øre, og desinficer det kirurgiske område mindst tre gange med jod- og alkoholservietter.

2. MCAO-kirurgi

1. Åbn den sterile instrumentpakke til MCAO-kirurgi. Brug sterile handsker og lav et 1 cm hudsnit mellem højre øje og højre øre ved hjælp af kirurgisk saks.
   BEMÆRK: Overvåg hudfarve, kropstemperatur og reaktion på tåklemme hvert 15. minut.
2. Disseker den underliggende fascia med tang for at udsætte de temporale og masseter muskler.
   BEMÆRK: Pas på ikke at beskadige parotidkirtlen.
3. Brug tang til at røre den nedre del af den tidlige muskel og detektere placeringen af den zygomatiske bue. Træk forsigtigt ansigtsnervens grene til side.
4. Brug spidsen af en højtemperatur-kauteriløkke (se materialetabel) til at skære et 5 mm tværgående snit på tindingemusklen.
5. Brug to tang til at dissekere den underliggende zygomatiske bue og udsætte leddet mellem maxilla og zygomatiske knogler.
6. Brug en saks til at skære en 3 mm del af den zygomatiske bue og fjerne den. Adskil tyggemuskelen fra kraniebasen.
   BEMÆRK: Pas på ikke at bryde retro-orbital sinus og overfladisk temporale vene.
7. Påfør fire små retraktorer placeret i forskellige retninger for at udsætte kraniekraniebasen, med trigeminusnervegrenene trukket sideværts af en retraktor.
   BEMÆRK: En sulcus på ydersiden af kraniebasen markerer placeringen af den laterale sprække mellem frontallapperne og temporallapperne. MCA ligger her (figur 2A), og dens stamme og grene er synlige gennem det tynde, gennemsigtige kranium (figur 2B). Forholdet mellem denne arterie og andre større cerebrale arterier er vist i figur 2A.
8. Påfør en dråbe på 0,9% normalt saltvand på kraniet over MCA-stammen og proksimalt på grenen af rhinal cortex. Brug en elektrisk kværn til at tynde kraniet, indtil en lille brud er synlig.
   BEMÆRK: Skub ikke kværnen mod kraniet, da den kan trænge ind i kraniet og skade den underliggende arterie.
9. Brug spidsen af tangen til at løfte det tynde kranium og fjerne det. For falske mus skal du stoppe her og ikke ligere arterien.
   BEMÆRK: Der dannes et lille rektangulært vindue på tværs af MCA-stammen.
10. Placer en enkeltstrenget løkke af sort flettet silke oven på MCA (figur 2C). Indsæt en 8-0 mikrokirurgisk nål til at løfte MCA-stammen og binde suturen (se materialetabel) under nålen, så begge ender af nålen efterlades på toppen af silketrådssløjfeknuden (figur 2D).
11. For forbigående MCAO strammes silketrådknuden lidt under nålen for at blokere arteriel blodgennemstrømning (figur 2E), der repræsenterer MCAO-debut.
12. Brug pincetten til at holde suturen, og fjern langsomt nålen for enden af iskæmien (f.eks. 60 min eller længere).
    BEMÆRK: Når nålen fjernes, glider silketrådknuden af MCA'en, og hjernen reperfuseres (figur 2F).
13. For permanent MCAO skal du stramme silketrådsløjfen rundt om arterien og fjerne nålen. Skær og fjern overskydende suturmaterialer.
14. Påfør en dråbe 0,25% bupivacain på hudsnittet, og sutur muskel og hud separat ved hjælp af 6-0 nylonsuturer intermitterende (se materialetabel). Påfør antibiotisk salve på overfladen af hudsnittet.
    BEMÆRK: Hudsnittet kan også lukkes med sterile hæfteklammer eller lim.

3. Postkirurgisk pleje

1. Sluk for isofluran for at vække musen. Afbryd ventilatoren, når spontan åndedræt genoprettes.
2. Overfør musen til et genoprettelseskammer (se materialetabellen) med en kontrolleret temperatur.
3. Ekstubér musen, når dens oprettende refleks gendannes, eller den begynder at bevæge sig.
4. Overvåg musen nøje i et temperatur- og fugtighedskontrolleret kammer. Sæt musen tilbage i hjemmeburet, når den får fuld bevidsthed (restitutionsperiode ~ 2 timer). Carprofen administreres subkutant dagligt i 3 dage.

4. Laser speckle kontrast billeddannelse (LSCI)

1. Seks og 24 timer efter MCAO monteres den bedøvede mus på den stereotaksiske ramme. Barber toppen af hovedet, og rengør det med tre skiftevis vatpinde jod og alkohol.
   BEMÆRK: Anæstetisering blev udført som nævnt i trin 1.3. LSCI udføres også før MCAO.
2. Lav et 3 cm midterlinje hudsnit og dissekere huden fra kraniet. Påfør fire små nåleretraktorer for at afsløre kranietop.
3. Flyt laserpletkameraet (se Materialetabel) over hovedet, og juster kameraets fokus. Forestil dig cerebral blodgennemstrømning.

5. 2,3,5-triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) farvning

1. Bedøvelse af musen dybt med 5% isofluran i slutningen af eksperimentet, typisk på dag 1, 3 eller 28 efter slagtilfælde. Klem halen for at sikre, at der ikke er noget smerterespons.
2. Halshug musen ved hjælp af en kirurgisk saks og høst hjernen. Inkuber hjernen i iskold saltvand i 20 min.
3. Sæt hjernen i en hjerneskærermatrix på is og slip koldt saltvand på hjernen. Skær hjernen i 1 mm skiver ved hjælp af tynde barberblade.
4. Dyp hjerneskiverne i samme retning i en skål med 2% TTC-opløsning (se materialetabel). Opbevar fadet i mørke ved stuetemperatur i 15 min.
   BEMÆRK: Normalt hjernevæv bliver rødt og iskæmisk væv forbliver hvidt.
5. Overfør hjerneskiverne til 10% formalin i 24 timers fiksering. Billede hjerneskiverne og mål infarktområdet.

Representative Results

Med et direkte billede under et kirurgisk mikroskop kan det visuelt bekræftes, at MCA-blodgennemstrømningen er blokeret under iskæmi. Vores tidligere undersøgelse viste en >80% reduktion af blodgennemstrømningen i det iskæmiske område ved hjælp af en laser Doppler-skærm⁶. For at bestemme ændringer i blodgennemstrømningen efter MCAO kan LSCI bruges til yderligere at bekræfte den iskæmiske fornærmelse og reperfusion (figur 1). Faktisk observeres det i figur 3A, at blodforsyningen blev reduceret på territoriet af den højre MCA. For forbigående MCAO, efter suturen blev fjernet, var reperfusion af cerebral blodgennemstrømning tydelig (figur 3B) og blev yderligere forbedret 24 timer senere (figur 3C). Slagtilfældehjernen kan sektioneres efter 24 timer og farves med TTC. Dødt væv reagerede ikke med TTC og forblev hvidt (figur 1). TTC-farvning viste, at denne model genererer infarktvæv i både kortikale og laterale striatumområder, og at infarktstørrelsen er moderat sammenlignet med filament MCAO (figur 4). Denne model er blevet anvendt på unge og ældre dyr, og en ubetydelig dødelighed (<5%) blev fundet over 28 dages observation⁷.

Denne model forårsager motoriske og sensoriske underskud, overvejende i venstre forpote. Vores tidligere undersøgelser viser neurologiske underskud hos slagtilfældemus, som det fremgår af forskellige adfærdstest såsom cylindertest, åben felttest, båndfjernelsestest, poltest og Von Frey-filamenttest 6,8,9,10. Mus, der udsættes for 90 minutters transkraniel MCAO, udviser også kognitive underskud sammenlignet med falske mus⁶. Selvom det langsigtede funktionelle resultat efter transkraniel MCAO ikke er blevet systematisk undersøgt i ældre mus, viste en lignende model hos ældre rotter tydeligt neurologiske underskud over 28 dage efter slagtilfælde⁷.

Figur 1: Oversigt over protokollen. Den højre MCA er forbigående eller permanent lukket gennem et lille kranievindue hos mus. TTC-farvning og LSCI bruges til at bestemme infarktstørrelsen og evaluere henholdsvis post-iskæmi cerebral blodgennemstrømning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Trinene i transkraniel MCAO-kirurgi . (A) Placeringen af det ligerede MCA. (B) Eksponering af MCA-stammen og dens grene. (C) En enkelt streng af en silkesutur er anbragt over MCA. (D) En 8-0 nål bruges til at løfte MCA-bagagerummet, og suturen er bundet under nålen. (E) Suturen strammes lidt for at blokere blodgennemstrømningen. (F) Kanylen og suturen fjernes for at tillade reperfusion. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Laserspeckle kontrastbilleder i MCAO med forsinket reperfusion . (A) Den højre halvkugle havde et lavt perfusionsområde (rød pil), hvilket indikerer iskæmi. (B) Efter 6 timers iskæmi blev suturen fjernet for at tillade reperfusion, og arteriegrenene blev synlige. (C) Efter 24 timer blev blodgennemstrømningsperfusionen forbedret i disse arterielle grene. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Forskel fra filamentet MCAO . (A) Den blækperfunderede hjerne viser blodkarrene på hjerneoverfladen. Den røde pil peger på MCA-stammen, som er ligeret i denne transkranielle MCAO-model. Den grønne pil peger på MCA-oprindelsen, som er stedet for MCA-okklusion i filament MCAO-modellen. Hjerneinfarkt er synligt 24 timer efter slagtilfælde på de TTC-farvede hjerneskinner. Prøverne her er fra (B) 60 min filament MCAO i en ung mus og (C) permanent transkraniel MCAO hos unge (8-10 uger gamle) og (D) alderen C57Bl/6 mus (22 måneder gamle). Normalt væv er rødt, og infarkt væv er hvidt. Infarktstørrelsen i denne model er moderat, og det infarkte område omfatter både cortex og striatum. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Den første transkranielle MCA-okklusionsmodel blev etableret hos rotter i 1981 ^11,12 og erstattet af MCAO-modellen uden kranikomi i^{1989 4}. Den oprindelige transkranielle MCA-okklusion havde et bredt kirurgisk felt, således at hele den zygomatiske bue blev fjernet, og musklerne trukket sideværts. Lokale væv var hævede efter operationen, hvilket forårsagede stress og nedsat fødeindtagelse for dyrene. I vores modificerede transkranielle MCAO-model er snittet mindre invasivt, og kun et lille segment af den zygomatiske bue fjernes. Det kirurgiske felt eksponeres ved hjælp af fire små nåleretraktorer, og ingen blodkar eller nerver ødelægges. Et lille kranievindue er tilstrækkeligt, fordi MCA-stammen løftes ved hjælp af en 8-0 kirurgisk suturnål, og hele nålen behøver ikke at gå under MCA. Der blev ikke fundet lokal vævshævelse efter operationen⁶.

Denne model har flere fordele. For det første producerer det et infarktområde, der omfatter både cortex og sub-cortex regioner, og dermed kan neurologiske underskud let vurderes. For det andet kan både forbigående og permanent iskæmisk slagtilfælde induceres i denne model. Det er vigtigt, at en forlænget iskæmisk varighed kan anvendes til at efterligne sen reperfusion. For eksempel blev en 6 timers MCAO i vores tidligere slagtilfælde udført med succes⁹. For det tredje er afhængigheden af PcomA for sikkerhedsstillelse blodforsyning og reperfusion minimal, hvilket reducerer variabiliteten af slagtilfælde. Endelig kan næsten alle mus, selv ældre mus, overleve langsigtede funktionelle undersøgelser. Samlet set udviser denne model fremragende klinisk relevans.

Bemærk, at denne stregmodel har begrænsninger. For det første kræves et højt niveau af mikrokirurgisk færdighed. En nybegynder dyrekirurg kan have brug for lidt tid til at perfektionere kraniotomi og MCA-ligering under et stereomikroskop. Omhyggelig udførelse af slibning, kraniefjernelse og suturplacering er nøglen til en vellykket implementering af denne model. Desuden er det afgørende at ligere MCA på samme sted for hvert dyr. For det andet er meninges lidt beskadiget af nålen i denne model, hvilket muligvis skal overvejes for undersøgelser med fokus på meninges. Endelig, selvom en iskæmisk varighed >6 timer kan udføres, skal reperfusion bekræftes ved at måle cerebral blodgennemstrømning med laser Doppler eller laser speckle billeddannelse.

Sammenfattende inducerer denne modificerede museslagmodel moderat hjerneskade, gør det muligt at udføre langsigtede overlevelseseksperimenter hos ældre og slagtilfælde comorbiditetsdyr og forventes at fremme eksperimentel slagtilfældeforskning og udvikling af nye lægemidler for at forbedre slagtilfælderesultaterne.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% bupivacaine	Hospira	NDC 0409-1159-18
0.9% sodium chloride	ICU Medical	NDC 0990-7983-03
2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC)	Sigma or any available vendor
20 G IV catheter	BD	381534	20 GA 1.6 IN
30 G needle	BD	305106
4-0 silk suture	Look	SP116	Black braided silk
8-0 suture with needle	Ethilon	2822G
Alcohol swabs	BD	326895
Anesthesia induction box	Any suitable vendor		Pexiglass make
Electrical grinder	JSDA	JD 700
High temperature cautery loop tip	Bovie	AA03
Isoflurane	Covetrus	NDC 11695-6777-2
Laser doppler perfusion monitor	Moor Instruments	moorVMS-LDF1
Lubricant eye ointment	Bausch + Lomb	339081
Mouse rectal probe	Physitemp	RET-3
Nitrous Oxide	Airgas	UN1070
Otoscope	Welchallyn	728	2.5 mm Speculum Otoscope served as a laryngoscope to visualize vocal cords in mice
Oxygen	Airgas	UN1072
Povidone-iodine	CVS	955338
Recovery box	Brinsea	TLC eco
Rimadyl (carprofen)	Zoetis	6100701	Injectable 50 mg/mL
Rodent ventilator	Kent Scientific	Rodent Jr.
Temperature controller	Physitemp	TCAT-2DF
Triple antibioric & pain relief	CVS	NDC 59770-823-56
Vaporizer	RWD	R583S