Summary
Denne protokollen demonstrerer en unik museslagmodell med et mellomstort infarkt og en utmerket overlevelsesrate. Denne modellen gjør det mulig for prekliniske slagforskere å forlenge iskemiens varighet, bruke eldre mus og vurdere langsiktige funksjonelle utfall.
Abstract
I eksperimentell slagforskning er okklusjon av mellomcerebrale arterier (MCAO) med et intraluminalt filament mye brukt til å modellere iskemisk hjerneslag hos mus. Filament MCAO-modellen viser vanligvis et massivt hjerneinfarkt i C57Bl / 6-mus som noen ganger inkluderer hjernevev i territoriet levert av den bakre cerebrale arterien, noe som i stor grad skyldes en høy forekomst av bakre kommuniserende arterieatresi. Dette fenomenet regnes som en viktig bidragsyter til den høye dødeligheten observert hos C57Bl/6-mus under langvarig slaggjenoppretting etter filament MCAO. Dermed utnytter mange kroniske slagstudier distale MCAO-modeller. Imidlertid produserer disse modellene vanligvis bare infarkt i cortex-området, og følgelig kan vurderingen av nevrologiske utfall etter hjerneslag være en utfordring. Denne studien har etablert en modifisert transkranial MCAO-modell der MCA i bagasjerommet er delvis okkludert enten permanent eller forbigående via et lite kranialvindu. Siden okklusjonsstedet er relativt proksimalt for opprinnelsen til MCA, genererer denne modellen hjerneskade i både cortex og striatum. Omfattende karakterisering av denne modellen har vist en utmerket langsiktig overlevelsesrate, selv hos eldre mus, samt lett påviselige nevrologiske underskudd. Derfor representerer MCAO-musemodellen beskrevet her et verdifullt verktøy for eksperimentell hjerneslagforskning.
Introduction
Nesten 800 000 mennesker får hjerneslag i USA hvert år, og de fleste av disse slagene er iskemiske inaturen 1. Rettidig gjenoppretting av cerebral blodstrøm med vevsplasminogenaktivator (tPA) og/eller trombektomi er for tiden den mest effektive behandlingen for slagpasienter; Imidlertid er full gjenoppretting av nevrologiske funksjoner på lang sikt sjelden 2,3. Dermed er søk etter ny slagbehandling som retter seg mot funksjonell forbedring et intenst forskningsområde som krever klinisk relevante dyremodeller av hjerneslag.
Den vanligste iskemiske slagmodellen hos gnagere bruker intraluminal okklusjon av mellomcerebrale arterier (MCAO) for å indusere hjerneslag. I denne modellen, opprinnelig utviklet av Zea Longa i 1989, blir en nylonfilament introdusert i den indre halspulsåren (ICA) for å blokkere blodstrømmen til den midtre hjernearterien (MCA)4. Denne modellen har imidlertid begrensninger. For det første, når filamentet settes inn i ICA, kan blodstrømmen til den bakre cerebrale arterien (PCA) også delvis blokkeres, spesielt hos mus. Kritisk er den bakre kommunikasjonsarterien (PcomA), en liten arterie som forbinder fremre og bakre cerebrale sirkulasjon, ofte underutviklet i noen musestammer, som C57Bl / 6, stammen som hovedsakelig brukes i eksperimentell slagforskning. Denne patency av PcomA antas å bidra til variasjonen i lesjonsstørrelse hos mus etter slag5. Faktisk, når blodstrømmen til PCA faller bratt under MCAO, og PcomA ikke er i stand til å gi tilstrekkelig sikkerhetsblodstrøm, kan hjerneslaginfarkt ekspandere inn i PCAs territorium. Videre fører en lang varighet av iskemi i denne modellen til en høyere sjanse for dødelighet hos mus. Følgelig brukes en kort MCAO-varighet på 30-60 min vanligvis hos mus. Imidlertid opplever de fleste slagpasienter noen timer med iskemi før reperfusjonsbehandling. Dermed er en museslagmodell med lengre varighet av iskemi av høy klinisk relevans.
Det overordnede målet med denne prosedyren er å modellere iskemisk slag hos mus som har et mellomstort infarkt og en utmerket overlevelsesrate. Denne transkraniale MCAO-modellen adresserer kritiske egenskaper ved klinisk slag, da langvarig iskemi kan utføres, og eldre mus tolererer denne modellen godt, noe som muliggjør langsiktig vurdering av funksjonell gjenoppretting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer beskrevet i dette arbeidet utføres i samsvar med NIHs retningslinjer for stell og bruk av dyr i forskning, og protokollen ble godkjent av Duke Institute Animal Care and Use Committee (IACUC). Unge (8-10 uker gamle) og eldre (22 måneder gamle) hannmus C57Bl/6 ble brukt i denne studien. En oversikt over denne protokollen er illustrert i figur 1.
1. Kirurgisk forberedelse
- Undersøk musen for grove abnormiteter og atferdsunderskudd.
MERK: Før operasjonen er det viktig for kirurger å bruke passende PPE (beskyttende personlig utstyr), inkludert kirurgisk maske, hette, hansker og kjole. - Vei musen; programmere respiratoren (se materialfortegnelse) basert på kroppsvekt.
- Plasser musen i en 4 i x 4 i x 7 i anestesi induksjonsboks. Slå på oksygenstrømningsmåleren (se Materialfortegnelse), satt til 30, og lystgassstrømningsmåleren, satt til 70. Slå på fordamperen med 5% isofluran.
- Sett føringstråden inn i 20 G intravenøst (IV) kateter.
- Ta musen ut av induksjonsboksen når respirasjonsfrekvensen reduseres til 30-40 pust per minutt.
- Legg musen på operasjonsbenken i liggende stilling. Trekk musens tunge ut og hold den med fingrene på venstre hånd. Sett inn et laryngoskop (se materialfortegnelse) i dyrets munn for å visualisere stemmebåndet.
- Stabiliser musehaken på laryngoskopet ved hjelp av høyre langfinger. Frigjør venstre hånd for å holde 20 G IV kateteret.
- Sett ledetråden litt inn i stemmebåndet, og skyv deretter 20 G IV-kateteret sakte inn i luftrøret til vingedelen av kateteret blir jevn med nesetippen.
MERK: Hvis musen beveger seg, må du ikke sette inn ledningen. Dette kan føre til traumer i luftrøret og blødning. - Slå på ventilatoren (se materialfortegnelse), og koble den til 20 G IV kateteret intubert i musen. Reduser isofluran til 1,5 %, og sørg for at begge lungene er mekanisk ventilert.
MERK: Ikke glem å redusere isofluran konsentrasjonen. Ellers vil musen få en overdose av anestesi. - Påfør øyesalve på begge øynene og injiser 5 mg/kg karprofen subkutant.
- Hold musen i sidestilling med høyre temporale område vendt oppover. Oppretthold rektaltemperaturen på 37 °C ved hjelp av en varmepute (35 °C) og en varmelampe styrt av en temperaturregulator (se Materialfortegnelse).
- Barber overflaten mellom høyre øye og øre, og desinfiser operasjonsområdet minst tre ganger med jod og spritservietter.
2. MCAO kirurgi
- Åpne den sterile instrumentpakken for MCAO-kirurgi. Bruk sterile hansker og gjør et 1 cm hudsnitt mellom høyre øye og høyre øre ved hjelp av kirurgisk saks.
NOTAT: Overvåk hudfarge, kroppstemperatur og respons på tåklemme hvert 15. minutt. - Dissekere den underliggende fascia med tang for å avsløre temporale og masseter muskler.
MERK: Vær forsiktig så du ikke skader parotidkjertelen. - Bruk tang til å berøre den nedre delen av den temporale muskelen og oppdage plasseringen av den zygomatiske buen. Trekk forsiktig grenene i ansiktsnerven til side.
- Bruk tuppen av en høytemperatur cautery loop (se Table of Materials) for å kutte en 5 mm tverrgående snitt på temporal muskel.
- Bruk to tang for å dissekere den underliggende zygomatiske buen og eksponere leddet mellom maxilla og zygomatiske bein.
- Bruk saks til å kutte en 3 mm del av den zygomatiske buen og fjern den. Skill massetermuskelen fra skallebasen.
MERK: Vær forsiktig så du ikke bryter retro-orbital sinus og overfladisk temporal vene. - Påfør fire små retractorer plassert i forskjellige retninger for å avsløre kranialskallebasen, med trigeminusnervegrenene trukket lateralt av en retractor.
MERK: En sulcus på den ytre overflaten av kranialbasen markerer plasseringen av sidefissuren mellom frontale og temporale lober. MCA ligger her (figur 2A), og stammen og grenene er synlige gjennom den tynne, gjennomsiktige skallen (figur 2B). Forholdet mellom denne arterien og andre store cerebrale arterier er vist i figur 2A. - Påfør en dråpe på 0,9% normal saltvann på skallen over MCA-stammen og proksimalt til grenen av rhinal cortex. Bruk en elektrisk kvern for å tynne skallen til et lite brudd er synlig.
MERK: Ikke skyv kvernen mot skallen, da den kan trenge inn i skallen og skade den underliggende arterien. - Bruk spissen av tangen til å løfte den tynne skallen og fjerne den. For sham mus, stopp her, og ikke ligere arterien.
MERK: Et lite rektangulært vindu over MCA-stammen dannes. - Plasser en enkelttrådsløkke med svart flettet silke på toppen av MCA (figur 2C). Sett inn en 8-0 mikrokirurgisk nål for å løfte MCA-stammen, og knytte suturen (se materialfortegnelse) under nålen, slik at begge ender av nålen blir igjen på toppen av silketrådknuten (figur 2D).
- For forbigående MCAO, stram silketrådknuten litt under nålen for å blokkere arteriell blodstrøm (figur 2E), som representerer MCAO-utbruddet.
- Bruk tangen til å holde suturen, og fjern nålen langsomt på slutten av iskemien (f.eks. 60 minutter eller lenger).
MERK: Når nålen fjernes, glir silketrådknuten av MCA, og hjernen reperfuseres (figur 2F). - For permanent MCAO, stram silketrådsløyfen rundt arterien bestemt og fjern nålen. Klipp og fjern overflødige suturmaterialer.
- Påfør en dråpe på 0,25% bupivakain på hudsnittet, og sutur muskel og hud separat ved å bruke 6-0 nylonsuturer periodisk (se materialtabell). Påfør antibiotisk salve på overflaten av hudsnittet.
MERK: Hudsnittet kan også lukkes med sterile stifter eller lim.
3. Post-kirurgisk behandling
- Slå av isofluran for å vekke musen. Koble fra ventilatoren når spontan respirasjon gjenopprettes.
- Før musen til et restitusjonskammer (se materialfortegnelse) med kontrollert temperatur.
- Ekstuber musen når høyrerefleksen gjenopprettes, eller den begynner å bevege seg.
- Overvåk musen nøye i et temperatur- og fuktighetskontrollert kammer. Sett musen tilbake i hjemmeburet etter at den har fått full bevissthet (restitusjonsperiode ~2 timer). Administrer 5 mg/kg Carprofen subkutant daglig i 3 dager.
4. Laser speckle kontrastavbildning (LSCI)
- Seks og 24 timer etter MCAO, monter den bedøvede musen på den stereotaksiske rammen. Barber toppen av hodet, og rengjør det med tre vekslende vattpinner av jod og alkohol.
MERK: Bedøvelse ble utført som nevnt i trinn 1.3. LSCI utføres også før MCAO. - Lag et 3 cm midtlinjehudsnitt og dissekere huden fra skallen. Påfør fire små nåleretraktorer for å avsløre skalletoppen.
- Flytt laserkameraet (se Materialfortegnelse) over hodet, og juster fokuset til kameraet. Se for deg den cerebrale blodstrømmen.
5. 2,3,5-trifenyltetrazoliumklorid (TTC) farging
- Dypt bedøve musen med 5% isofluran ved slutten av forsøket, vanligvis på dag 1, 3 eller 28 etter slag. Klyp halen for å sikre at det ikke er noen smerterespons.
- Decapitate musen ved hjelp av en kirurgisk saks og høste hjernen. Inkuber hjernen i iskaldt saltvann i 20 minutter.
- Sett hjernen i en hjernekuttermatrise på is og slipp kaldt saltvann på hjernen. Skjær hjernen i 1 mm skiver ved hjelp av tynne barberblader.
- Fordyp hjerneskivene i samme retning i en tallerken med 2% TTC-løsning (se materialtabell). Hold fatet i mørket i romtemperatur i 15 min.
MERK: Normalt hjernevev blir rødt og iskemisk vev forblir hvitt. - Overfør hjerneskivene til 10% formalin for 24 timers fiksering. Se for deg hjerneskivene og mål infarktområdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med direkte utsikt under et kirurgisk mikroskop kan det visuelt bekreftes at MCA-blodstrømmen er blokkert under iskemi. Vår tidligere studie viste en >80% blodstrømsreduksjon i det iskemiske området ved bruk av en laserdopplermonitor6. For å bestemme endringer i blodstrømmen etter MCAO kan LSCI brukes til ytterligere å bekrefte iskemisk fornærmelse og reperfusjon (figur 1). Faktisk, i figur 3A, observeres det at blodtilførselen ble redusert på territoriet til høyre MCA. For forbigående MCAO, etter at suturen var fjernet, var reperfusjon av cerebral blodstrøm tydelig (figur 3B), og ble ytterligere forbedret 24 timer senere (figur 3C). Hjerneslaget kan seksjoneres etter 24 timer og farget med TTC. Dødt vev reagerte ikke med TTC og forble hvitt (figur 1). TTC-farging viste at denne modellen genererer infarktvev i både kortikale og laterale striatumområder, og at infarktstørrelsen er moderat sammenliknet med filament MCAO (figur 4). Denne modellen har blitt brukt på unge og eldre dyr, og en ubetydelig dødelighet (<5%) ble funnet over 28 dager med observasjon7.
Denne modellen forårsaker motoriske og sensoriske underskudd, hovedsakelig i venstre forpote. Våre tidligere studier viser nevrologiske underskudd hos slagmus, som det fremgår av ulike atferdstester som sylindertest, åpen felttest, tapefjerningstest, poltest og Von Frey filamenttest 6,8,9,10. Mus utsatt for 90 min transkraniell MCAO viser også kognitive underskudd sammenlignet med humbugopererte mus6. Selv om det langsiktige funksjonelle utfallet etter transkraniell MCAO ikke er systemisk undersøkt hos eldre mus, viste en lignende modell hos eldre rotter tydelig nevrologiske utfall over 28 dager etter slag7.
Figur 1: Oversikt over protokollen. Høyre MCA er forbigående eller permanent okkludert gjennom et lite skallevindu hos mus. TTC-farging og LSCI brukes til å bestemme henholdsvis infarktstørrelsen og evaluere cerebral blodstrøm etter iskemi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Trinnene ved transkranial MCAO-kirurgi . (A) Plassering av ligert MCA. (B) Eksponering av MCA-stammen og dens grener. (C) En enkelt streng av en silkesutur er plassert over MCA. (D) En 8-0 nålen brukes til å løfte MCA-stammen, og suturen bindes under nålen. (E) Suturen strammes litt for å blokkere blodstrømmen. (F) Nålen og suturen fjernes for å tillate reperfusjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kontrastbilder med laserflekker i MCAO med forsinket reperfusjon . (A) Den høyre halvkule hadde et lavt perfusjonsområde (rød pil), noe som indikerer iskemi. (B) Etter 6 timer av iskemi ble suturen fjernet for å tillate reperfusjon, og arterielle grener ble synlige. (C) Etter 24 timer ble blodstrømningsperfusjonen forbedret i disse arterielle grenene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Forskjell fra filamentet MCAO . (A) Den blekkperfuserte hjernen viser blodkarene på hjerneoverflaten. Den røde pilen peker på MCA-stammen, som er ligert i denne transkraniale MCAO-modellen. Den grønne pilen peker på MCA-opprinnelsen, som er stedet for MCA-okklusjon i filament-MCAO-modellen. Hjerneinfarkt er synlig 24 timer etter hjerneslag på TTC-fargede hjernelysbilder. Prøvene her er fra (B) 60 min filament MCAO i en ung mus, og (C) permanent transkraniell MCAO hos unge (8-10 uker gamle) og (D) i alderen C57Bl/6 mus (22 måneder gamle). Normalt vev er rødt, og infarkt vev er hvitt. Infarktstørrelsen i denne modellen er moderat, og det infarkterte området inkluderer både cortex og striatum. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den første transkraniale MCA-okklusjonsmodellen ble etablert hos rotter i 1981 11,12, og erstattet av no-craniectomy MCAO-modellen i1989 4. Den initiale transkraniale MCA-okklusjonen hadde et bredt kirurgisk felt, slik at hele den zygomatiske buen ble fjernet og musklene trukket sideveis. Lokale vev ble hovne etter operasjonen, noe som forårsaket stress og redusert matinntak for dyrene. I vår modifiserte transkraniale MCAO-modell er snittet mindre invasivt, og bare et lite segment av den zygomatiske buen fjernes. Det kirurgiske feltet eksponeres ved hjelp av fire små nåleretraktorer, og ingen blodkar eller nerver ødelegges. Et lite hodeskallevindu er tilstrekkelig fordi MCA-stammen løftes med en 8-0 kirurgisk suturnål, og hele nålen trenger ikke å gå under MCA. Det ble ikke funnet lokal vevshevelse etter operasjon6.
Denne modellen har flere fordeler. For det første produserer det et infarktområde som inkluderer både cortex- og subcortex-regioner, og dermed kan nevrologiske underskudd lett vurderes. For det andre kan både forbigående og permanent iskemisk hjerneslag induseres i denne modellen. Det er viktig at en utvidet iskemisk varighet kan brukes til å etterligne sen reperfusjon. For eksempel, i vår forrige slagstudie, ble en 6 timers MCAO vellykket utført9. For det tredje er avhengigheten av PcomA for sikkerhetsblodtilførsel og reperfusjon minimal, noe som reduserer variasjonen i slagets alvorlighetsgrad. Endelig kan nesten alle mus, selv eldre mus, overleve langsiktige funksjonelle studier. Samlet sett viser denne modellen utmerket klinisk relevans.
Merk at denne strekmodellen har begrensninger. For det første er det nødvendig med et høyt nivå av mikrokirurgisk ferdighet. En nybegynner dyr kirurg kan trenge litt tid til å perfeksjonere kraniotomi og MCA ligering under et stereomikroskop. Forsiktig utførelse av sliping, skallefjerning og suturplassering er nøkkelen til vellykket implementering av denne modellen. Videre er ligering av MCA på samme sted for hvert dyr kritisk. For det andre er hjernehinnene litt skadet av nålen i denne modellen, noe som kanskje må vurderes for studier fokusert på hjernehinnene. Til slutt, selv om en iskemisk varighet >6 timer kan utføres, må reperfusjon bekreftes ved å måle cerebral blodstrøm med laserdoppler eller laserflekkavbildning.
Oppsummert induserer denne modifiserte museslagmodellen moderat hjerneskade, gjør det mulig å utføre langsiktige overlevelseseksperimenter i eldre og slagkomorbiditetsdyr, og forventes å fremme eksperimentell slagforskning og ny medisinutvikling for å forbedre slagutfallene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere har ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne takker Kathy Gage for hennes redaksjonelle støtte. Ordningsfigurer ble opprettet med BioRender.com. Denne studien ble støttet av midler fra Institutt for anestesiologi (Duke University Medical Center) og NIH-tilskudd (NS099590, HL157354, NS117973 og NS127163).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% bupivacaine | Hospira | NDC 0409-1159-18 | |
| 0.9% sodium chloride | ICU Medical | NDC 0990-7983-03 | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC) | Sigma or any available vendor | ||
| 20 G IV catheter | BD | 381534 | 20 GA 1.6 IN |
| 30 G needle | BD | 305106 | |
| 4-0 silk suture | Look | SP116 | Black braided silk |
| 8-0 suture with needle | Ethilon | 2822G | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Anesthesia induction box | Any suitable vendor | Pexiglass make | |
| Electrical grinder | JSDA | JD 700 | |
| High temperature cautery loop tip | Bovie | AA03 | |
| Isoflurane | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| Laser doppler perfusion monitor | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | |
| Lubricant eye ointment | Bausch + Lomb | 339081 | |
| Mouse rectal probe | Physitemp | RET-3 | |
| Nitrous Oxide | Airgas | UN1070 | |
| Otoscope | Welchallyn | 728 | 2.5 mm Speculum Otoscope served as a laryngoscope to visualize vocal cords in mice |
| Oxygen | Airgas | UN1072 | |
| Povidone-iodine | CVS | 955338 | |
| Recovery box | Brinsea | TLC eco | |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | 6100701 | Injectable 50 mg/mL |
| Rodent ventilator | Kent Scientific | Rodent Jr. | |
| Temperature controller | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Triple antibioric & pain relief | CVS | NDC 59770-823-56 | |
| Vaporizer | RWD | R583S |
References
- Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2022 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 145 (8), e153 (2022).
- Nogueira, R. G., et al. Thrombectomy 6 to 24 hours after stroke with a mismatch between deficit and infarct. The New England Journal of Medicine. 378 (1), 11-21 (2018).
- Fisher, M., Savitz, S. I. Pharmacological brain cytoprotection in acute ischaemic stroke-renewed hope in the reperfusion era. Nature Reviews Neurology. 18 (4), 193-202 (2022).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Knauss, S., et al. A semiquantitative non-invasive measurement of PcomA patency in C57BL/6 mice explains variance in ischemic brain damage in filament MCAo. Frontiers in Neuroscience. 14, 576741 (2020).
- Yang, Z., et al. Post-ischemia common carotid artery occlusion worsens memory loss, but not sensorimotor deficits, in long-term survived stroke mice. Brain Research Bulletin. 183, 153-161 (2022).
- Wang, Z., et al. Increasing O-GlcNAcylation is neuroprotective in young and aged brains after ischemic stroke. Experimental Neurology. 339, 113646 (2021).
- Jiang, M., et al. XBP1 (X-box-binding protein-1)-dependent O-GlcNAcylation Is neuroprotective in ischemic stroke in young mice and its impairment in aged mice is rescued by thiamet-G. Stroke. 48 (6), 1646-1654 (2017).
- Li, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the immune cell landscape in the aged mouse brain after ischemic stroke. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 83 (2022).
- Li, X., et al. Beneficial effects of neuronal ATF6 activation in permanent ischemic stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 1016391 (2022).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 2. Regional cerebral blood flow determined by [14C]iodoantipyrine autoradiography following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1 (1), 61-69 (1981).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1 (1), 53-60 (1981).
