Summary
Detta protokoll demonstrerar en unik musslagsmodell med en medelstor infarkt och en utmärkt överlevnadsgrad. Denna modell gör det möjligt för prekliniska strokeforskare att förlänga ischemins varaktighet, använda åldrade möss och bedöma långsiktiga funktionella resultat.
Abstract
I experimentell strokeforskning används mellersta cerebral artärocklusion (MCAO) med ett intraluminalt filament i stor utsträckning för att modellera ischemisk stroke hos möss. Filament MCAO-modellen uppvisar vanligtvis en massiv hjärninfarkt hos C57Bl/6-möss som ibland inkluderar hjärnvävnad i det territorium som tillhandahålls av den bakre hjärnartären, vilket till stor del beror på en hög förekomst av bakre kommunicerande artäratresi. Detta fenomen anses vara en viktig bidragande orsak till den höga dödlighet som observerats hos C57Bl/6-möss under långvarig återhämtning efter filament MCAO. Således utnyttjar många studier av kronisk stroke distala MCAO-modeller. Dessa modeller ger dock vanligtvis bara infarkt i cortex-området, och följaktligen kan bedömningen av neurologiska brister efter stroke vara en utmaning. Denna studie har etablerat en modifierad transkraniell MCAO-modell där MCA vid bålen delvis är ockluderad antingen permanent eller tillfälligt via ett litet kranialfönster. Eftersom ocklusionsplatsen är relativt proximal till MCA:s ursprung, genererar denna modell hjärnskador i både cortex och striatum. Omfattande karakterisering av denna modell har visat en utmärkt långtidsöverlevnad, även hos åldrade möss, samt lätt detekterbara neurologiska brister. Därför representerar MCAO-musmodellen som beskrivs här ett värdefullt verktyg för experimentell strokeforskning.
Introduction
Nästan 800 000 människor drabbas av stroke i USA varje år, och de flesta av dessa stroke är ischemiskatill sin natur. Snabb återställning av det cerebrala blodflödet med vävnadsplasminogenaktivator (tPA) och/eller trombektomi är för närvarande den mest effektiva behandlingen för strokepatienter. Fullständig återhämtning av neurologiska funktioner på lång sikt är dock sällsynt 2,3. Att söka efter ny strokebehandling som syftar till funktionell förbättring är därför ett intensivt forskningsområde som kräver kliniskt relevanta djurmodeller av stroke.
Den vanligaste ischemiska strokemodellen hos gnagare använder intraluminal mellersta cerebral artärocklusion (MCAO) för att inducera stroke. I denna modell, som ursprungligen utvecklades av Zea Longa 1989, förs ett nylonfilament in i den inre halspulsådern (ICA) för att blockera blodflödet till den mellersta hjärnartären (MCA)4. Den här modellen har dock begränsningar. För det första, när filamentet sätts in i ICA, kan blodflödet till den bakre hjärnartären (PCA) också delvis blockeras, särskilt hos möss. Den bakre kommunicerande artären (PcomA), en liten artär som förbinder främre och bakre hjärncirkulationen, är ofta underutvecklad hos vissa musstammar, såsom C57Bl/6, den stam som främst används i experimentell strokeforskning. Denna patens hos PcomA tros bidra till variationen i lesionsstorlek hos möss efter stroke5. Faktum är att när blodflödet till PCA sjunker brant under MCAO, och PcomA inte kan ge tillräckligt kollateralt blodflöde, kan strokeinfarkten expandera till PCA:s territorium. Dessutom, i denna modell, leder en lång varaktighet av ischemi till en högre risk för dödlighet hos möss. Följaktligen används vanligtvis en kort MCAO-varaktighet på 30-60 minuter på möss. De flesta strokepatienter upplever dock några timmars ischemi före reperfusionsbehandling. Således är en musslagmodell med förlängd varaktighet av ischemi av hög klinisk relevans.
Det övergripande målet med denna procedur är att modellera ischemisk stroke hos möss som har en medelstor infarkt och en utmärkt överlevnadsgrad. Denna transkraniella MCAO-modell adresserar kritiska attribut för klinisk stroke, eftersom långvarig ischemi kan utföras, och åldrade möss tolererar denna modell väl, vilket möjliggör långsiktig bedömning av funktionell återhämtning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer som beskrivs i detta arbete utförs i enlighet med NIH:s riktlinjer för vård och användning av djur i forskning, och protokollet godkändes av Duke Institute Animal Care and Use Committee (IACUC). Unga (8-10 veckor gamla) och åldrade (22 månader gamla) C57Bl/6-hanmöss användes för den aktuella studien. En översikt över detta protokoll illustreras i figur 1.
1. Kirurgisk förberedelse
- Undersök musen för grova avvikelser och beteendebrister.
OBS: Före operationen är det viktigt för kirurger att bära lämplig PPE (skyddande personlig utrustning), inklusive kirurgisk mask, keps, handskar och rock. - Väg musen; programmera ventilatorn (se materialtabell) baserat på kroppsvikten.
- Placera musen i en 4 i x 4 i x 7 i anestesiinduktionslådan. Slå på syrgasflödesmätaren (se materialtabell), inställd på 30, och lustgasflödesmätaren, inställd på 70. Slå på förångaren med 5% isofluran.
- För in ledaren i 20 G intravenös (IV) kateter.
- Ta ut musen ur induktionslådan när dess andningsfrekvens har reducerats till 30-40 andetag per minut.
- Lägg musen på operationsbänken i ryggläge. Dra ut musens tunga och håll den med fingrarna på vänster hand. Sätt in ett laryngoskop (se materialförteckning) i djurets mun för att visualisera stämbanden.
- Stabilisera mushakan på laryngoskopet med höger långfinger. Frigör vänster hand för att hålla 20 G IV-katetern.
- För in ledaren något i stämbandet och tryck sedan långsamt in 20 G IV-katetern i luftstrupen tills kateterns vingdel blir jämn med nässpetsen.
OBS: Om musen rör sig, sätt inte i kabeln. Detta kan orsaka trauma på luftstrupen och blödning. - Slå på ventilatorn (se Materialförteckning) och anslut den till 20 G IV-katetern som är intuberad i musen. Minska isofluranhalten till 1,5 % och se till att båda lungorna ventileras mekaniskt.
OBS: Glöm inte att minska isoflurankoncentrationen. Annars kommer musen att få en överdos av bedövning. - Applicera ögonsalva på båda ögonen och injicera 5 mg/kg karprofen subkutant.
- Håll musen i sidoläge med det högra tidsområdet uppåt. Håll den rektala temperaturen vid 37 °C med hjälp av en värmedyna (35 °C) och en värmelampa som styrs av en temperaturregulator (se materialförteckning).
- Raka ytan mellan höger öga och öra och desinficera operationsområdet minst tre gånger med jod- och spritservetter.
2. MCAO-kirurgi
- Öppna det sterila instrumentpaketet för MCAO-kirurgi. Använd sterila handskar och gör ett 1 cm hudsnitt mellan höger öga och höger öra med en kirurgisk sax.
OBS: Övervaka hudfärg, kroppstemperatur och svar på tånyp var 15:e minut. - Dissekera den underliggande fascian med en pincett för att exponera temporal- och tuggmusklerna.
OBS: Var försiktig så att du inte skadar öronspottkörteln. - Använd en pincett för att röra vid den nedre delen av tinningmuskeln och upptäcka platsen för den zygomatiska bågen. Dra försiktigt åt sidan ansiktsnervens grenar.
- Använd spetsen på en högtemperaturhälla (se materialtabell) för att skära ett 5 mm tvärgående snitt på tinningmuskeln.
- Använd två pincetter för att dissekera den underliggande zygomatiska bågen och exponera leden mellan överkäken och zygomatiska benen.
- Använd en sax för att klippa en 3 mm del av den zygomatiska bågen och ta bort den. Separera tuggmuskeln från skallbasen.
OBS: Var försiktig så att du inte bryter den retroorbitala sinus och ytliga temporalvenen. - Applicera fyra små retraktorer placerade i olika riktningar för att exponera kranialskallens bas, med trigeminusnervgrenarna dragna i sidled av en retraktor.
OBS: En sulcus på den yttre ytan av kranialbasen markerar platsen för den laterala sprickan mellan frontalloberna och tinningloberna. MCA ligger här (Figur 2A), och dess stam och grenar är synliga genom den tunna, genomskinliga skallen (Figur 2B). Förhållandet mellan denna artär och andra större hjärnartärer visas i figur 2A. - Applicera en droppe på 0,9 % normal koksaltlösning på skallen ovanför MCA-stammen och proximalt mot grenen av rhinala cortex. Använd en elektrisk kvarn för att tunna ut skallen tills en liten fraktur är synlig.
OBS: Tryck inte kvarnen mot skallen, eftersom den kan tränga in i skallen och skada den underliggande artären. - Använd spetsen på pincetten för att lyfta den förtunnade skallen och ta bort den. För skenmöss, stanna här och ligera inte artären.
OBS: Ett litet rektangulärt fönster över MCA-stammen bildas. - Placera en slinga av svart flätat silke ovanpå MCA (Figur 2C). Sätt in en 8-0 mikrokirurgisk nål för att lyfta MCA-stammen och bind suturen (se materialtabell) under nålen, lämna båda ändarna av nålen på toppen av silkestrådsögleknuten (Figur 2D).
- För övergående MCAO, dra åt silkestrådsknuten något under nålen för att blockera arteriellt blodflöde (Figur 2E), vilket representerar MCAO-debut.
- Använd pincetten för att hålla suturen och ta långsamt bort nålen i slutet av ischemin (t.ex. 60 minuter eller längre).
OBS: När nålen tas bort glider silkestrådsknuten av MCA och hjärnan reperfunderas (Figur 2F). - För permanent MCAO, dra åt silkestrådsöglan ordentligt runt artären och ta bort nålen. Klipp och ta bort överflödigt suturmaterial.
- Applicera en droppe 0,25 % bupivakain på hudsnittet och sy ihop muskeln och huden separat med 6-0 nylonsuturer intermittent (se materialförteckning). Applicera antibiotikasalva på ytan av hudsnittet.
OBS: Hudsnittet kan också stängas med sterila häftklamrar eller lim.
3. Vård efter operationen
- Stäng av isofluran för att väcka musen. Koppla bort ventilatorn när spontanandningen är återställd.
- Överför musen till en återvinningskammare (se materialförteckning) med en kontrollerad temperatur.
- Extubera musen när dess rätande reflex är återställd eller när den börjar röra sig.
- Övervaka musen noga i en temperatur- och luftfuktighetskontrollerad kammare. Sätt tillbaka musen i hemburen efter att den har uppnått fullt medvetande (återhämtningsperiod ~2 timmar). Administrera 5 mg/kg karprofen subkutant dagligen i 3 dagar.
4. Laseravbildning av speckelkontrast (LSCI)
- Sex och 24 timmar efter MCAO, montera den bedövade musen på den stereotaktiska ramen. Raka toppen av huvudet och rengör det med tre omväxlande svabbar jod och alkohol.
OBS: Bedövning utfördes enligt beskrivningen i steg 1.3. LSCI utförs också före MCAO. - Gör ett 3 cm mittlinjesnitt och dissekera huden från skallen. Applicera fyra små nålupprullningsdon för att exponera dödskalletoppen.
- Flytta laserspeckelkameran (se materialtabell) ovanför huvudet och justera kamerans fokus. Föreställ dig det cerebrala blodflödet.
5. Färgning av 2,3,5-trifenyltetrazoliumklorid (TTC)
- Bedöva musen djupt med 5 % isofluran i slutet av experimentet, vanligtvis dag 1, 3 eller 28 efter stroke. Nyp ihop svansen för att säkerställa att det inte finns någon smärtreaktion.
- Halshugg musen med en kirurgisk sax och skörda hjärnan. Inkubera hjärnan i iskall koksaltlösning i 20 min.
- Lägg hjärnan i en hjärnskärarmatris på is och droppa kall saltlösning på hjärnan. Skär hjärnan i 1 mm tjocka skivor med tunna rakblad.
- Sänk ner hjärnskivorna i samma riktning i en skål med 2 % TTC-lösning (se materialtabell). Förvara skålen mörkt i rumstemperatur i 15 minuter.
OBS: Normal hjärnvävnad blir röd och ischemisk vävnad förblir vit. - Överför hjärnskivorna till 10 % formalin under 24 timmars fixering. Föreställ dig hjärnskivorna och mät infarktområdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med en direkt vy under ett kirurgiskt mikroskop kan det visuellt bekräftas att MCA-blodflödet blockeras under ischemi. Vår tidigare studie visade en minskning av blodflödet med >80 % i det ischemiska området med hjälp av en laserdopplermonitor6. För att bestämma förändringar i blodflödet efter MCAO kan LSCI användas för att ytterligare bekräfta den ischemiska förolämpningen och reperfusionen (Figur 1). I figur 3A observeras att blodtillförseln minskade i territoriet för rätt MCA. För övergående MCAO, efter att suturen tagits bort, var reperfusionen av det cerebrala blodflödet uppenbar (Figur 3B) och förbättrades ytterligare 24 timmar senare (Figur 3C). Strokehjärnan kan snittas efter 24 timmar och färgas med TTC. Död vävnad reagerade inte med TTC och förblev vit (Figur 1). TTC-färgning visade att denna modell genererar infarktvävnad i både kortikala och laterala striatumområden, och att infarktstorleken är måttlig jämfört med filament MCAO (Figur 4). Denna modell har tillämpats på unga och äldre djur, och en försumbar dödlighet (<5 %) hittades under 28 observationsdagar7.
Denna modell orsakar motoriska och sensoriska brister, främst i vänster framtass. Våra tidigare studier visar neurologiska brister hos strokemöss, vilket framgår av olika beteendetester som cylindertestet, öppet fälttest, tejpborttagningstest, poltest och Von Frey-filamenttest 6,8,9,10. Möss som utsatts för 90 minuters transkraniell MCAO visar också kognitiva brister jämfört med skenopererade möss6. Även om det långsiktiga funktionella utfallet efter transkraniell MCAO inte har undersökts systemiskt hos åldrade möss, visade en liknande modell på åldrade råttor tydligt neurologiska brister under 28 dagar efter stroke7.
Bild 1: Översikt över protokollet. Den högra MCA är tillfälligt eller permanent tilltäppt genom ett litet skallfönster hos möss. TTC-färgning och LSCI används för att bestämma infarktstorleken respektive utvärdera cerebralt blodflöde efter ischemi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Stegen i transkraniell MCAO-kirurgi . (A) Placering av den ligerade MCA. B) Exponering av MCA-stammen och dess grenar. (C) En enda sträng av en silkessutur placeras ovanför MCA. (D) En 8-0 nålen används för att lyfta MCA-stammen och suturen knyts under nålen. (E) Suturen är något åtdragen för att blockera blodflödet. (F) Nålen och suturen avlägsnas för att möjliggöra reperfusion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Laserspeckelkontrastbilder i MCAO med fördröjd reperfusion . (A) Den högra hjärnhalvan hade ett område med låg perfusion (röd pil), vilket indikerar ischemi. (B) Efter 6 timmars ischemi togs suturen bort för att möjliggöra reperfusion och artärgrenarna blev synliga. (C) Efter 24 timmar förbättrades blodflödesperfusionen i dessa artärgrenar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Skillnad från filamentet MCAO . (A) Den bläckperfunderade hjärnan visar blodkärlen på hjärnans yta. Den röda pilen pekar på MCA-stammen, som är ligerad i denna transkraniella MCAO-modell. Den gröna pilen pekar på MCA-ursprunget, vilket är platsen för MCA-ocklusion i filament-MCAO-modellen. Hjärninfarkten är synlig 24 timmar efter stroke på de TTC-färgade hjärnglasen. Proverna här är från (B) 60 min filament MCAO hos en ung mus, och (C) permanent transkraniell MCAO hos unga (8-10 veckor gamla) och (D) åldrade C57Bl/6-möss (22 månader gamla). Normal vävnad är röd och infarktvävnad är vit. Infarktstorleken i denna modell är måttlig, och det infarktdrabbade området inkluderar både cortex och striatum. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den första transkraniella MCA-ocklusionsmodellen etablerades hos råttor 198111,12 och ersattes av den icke-kraniektomi MCAO-modellen 19894. Den initiala transkraniella MCA-ocklusionen hade ett brett kirurgiskt fält, så att hela den zygomatiska bågen togs bort och musklerna drogs i sidled. Lokala vävnader svullnade upp efter operationen, vilket orsakade stress och minskat födointag för djuren. I vår modifierade transkraniella MCAO-modell är snittet mindre invasivt och endast ett litet segment av den zygomatiska bågen tas bort. Det kirurgiska området exponeras med hjälp av fyra små nålretraktorer, och inga blodkärl eller nerver förstörs. Ett litet skallfönster räcker eftersom MCA-stammen lyfts med en 8-0 kirurgisk suturnål, och hela nålen behöver inte gå under MCA. Ingen lokal vävnadssvullnad hittades efter operation6.
Denna modell har flera fördelar. För det första producerar det ett infarktområde som inkluderar både cortex- och subcortexregioner, och därmed kan neurologiska brister lätt bedömas. För det andra kan både övergående och permanent ischemisk stroke induceras i denna modell. Det är viktigt att en förlängd ischemisk varaktighet kan tillämpas för att efterlikna sen reperfusion. Till exempel, i vår tidigare strokestudie, utfördes en 6 timmars MCAO framgångsrikt9. För det tredje är beroendet av PcomA för kollateral blodtillförsel och reperfusion minimalt, vilket minskar variabiliteten i strokens svårighetsgrad. Slutligen kan nästan alla möss, även åldrade möss, överleva långsiktiga funktionella studier. Sammantaget uppvisar denna modell utmärkt klinisk relevans.
Observera att denna strokemodell har begränsningar. För det första krävs en hög nivå av mikrokirurgisk skicklighet. En nybörjare kan behöva lite tid för att fullända kraniotomi och MCA-ligering under ett stereomikroskop. Noggrant utförande av slipning, borttagning av skalle och suturplacering är nyckeln till att framgångsrikt implementera denna modell. Dessutom är det viktigt att ligera MCA på samma plats för varje djur. För det andra skadas hjärnhinnorna något av nålen i denna modell, vilket kan behöva övervägas för studier som fokuserar på hjärnhinnorna. Slutligen, även om en ischemisk varaktighet >6 timmar kan utföras, måste reperfusionen bekräftas genom mätning av cerebralt blodflöde med laserdoppler eller laserfläckavbildning.
Sammanfattningsvis inducerar denna modifierade musstrokemodell måttlig hjärnskada, gör det möjligt att utföra långsiktiga överlevnadsexperiment på åldrade djur och strokekomorbiditetsdjur och förväntas främja experimentell strokeforskning och utveckling av nya läkemedel för att förbättra strokeresultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av författarna har någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Författarna tackar Kathy Gage för hennes redaktionella stöd. Schemafigurer skapades med BioRender.com. Denna studie stöddes av medel från Department of Anesthesiology (Duke University Medical Center) och NIH-anslag (NS099590, HL157354, NS117973 och NS127163).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% bupivacaine | Hospira | NDC 0409-1159-18 | |
| 0.9% sodium chloride | ICU Medical | NDC 0990-7983-03 | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC) | Sigma or any available vendor | ||
| 20 G IV catheter | BD | 381534 | 20 GA 1.6 IN |
| 30 G needle | BD | 305106 | |
| 4-0 silk suture | Look | SP116 | Black braided silk |
| 8-0 suture with needle | Ethilon | 2822G | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Anesthesia induction box | Any suitable vendor | Pexiglass make | |
| Electrical grinder | JSDA | JD 700 | |
| High temperature cautery loop tip | Bovie | AA03 | |
| Isoflurane | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| Laser doppler perfusion monitor | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | |
| Lubricant eye ointment | Bausch + Lomb | 339081 | |
| Mouse rectal probe | Physitemp | RET-3 | |
| Nitrous Oxide | Airgas | UN1070 | |
| Otoscope | Welchallyn | 728 | 2.5 mm Speculum Otoscope served as a laryngoscope to visualize vocal cords in mice |
| Oxygen | Airgas | UN1072 | |
| Povidone-iodine | CVS | 955338 | |
| Recovery box | Brinsea | TLC eco | |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | 6100701 | Injectable 50 mg/mL |
| Rodent ventilator | Kent Scientific | Rodent Jr. | |
| Temperature controller | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Triple antibioric & pain relief | CVS | NDC 59770-823-56 | |
| Vaporizer | RWD | R583S |
References
- Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2022 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 145 (8), e153 (2022).
- Nogueira, R. G., et al. Thrombectomy 6 to 24 hours after stroke with a mismatch between deficit and infarct. The New England Journal of Medicine. 378 (1), 11-21 (2018).
- Fisher, M., Savitz, S. I. Pharmacological brain cytoprotection in acute ischaemic stroke-renewed hope in the reperfusion era. Nature Reviews Neurology. 18 (4), 193-202 (2022).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Knauss, S., et al. A semiquantitative non-invasive measurement of PcomA patency in C57BL/6 mice explains variance in ischemic brain damage in filament MCAo. Frontiers in Neuroscience. 14, 576741 (2020).
- Yang, Z., et al. Post-ischemia common carotid artery occlusion worsens memory loss, but not sensorimotor deficits, in long-term survived stroke mice. Brain Research Bulletin. 183, 153-161 (2022).
- Wang, Z., et al. Increasing O-GlcNAcylation is neuroprotective in young and aged brains after ischemic stroke. Experimental Neurology. 339, 113646 (2021).
- Jiang, M., et al. XBP1 (X-box-binding protein-1)-dependent O-GlcNAcylation Is neuroprotective in ischemic stroke in young mice and its impairment in aged mice is rescued by thiamet-G. Stroke. 48 (6), 1646-1654 (2017).
- Li, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the immune cell landscape in the aged mouse brain after ischemic stroke. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 83 (2022).
- Li, X., et al. Beneficial effects of neuronal ATF6 activation in permanent ischemic stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 1016391 (2022).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 2. Regional cerebral blood flow determined by [14C]iodoantipyrine autoradiography following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1 (1), 61-69 (1981).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1 (1), 53-60 (1981).
