Summary
このプロトコルは、中型の梗塞と優れた生存率を持つユニークなマウスストロークモデルを示しています。このモデルにより、脳卒中前臨床研究者は虚血期間を延長し、高齢マウスを使用し、長期的な機能的転帰を評価することができます。
Abstract
実験的脳卒中研究では、マウスの虚血性脳卒中をモデル化するために、管腔内フィラメントによる中大脳動脈閉塞(MCAO)が広く使用されています。フィラメントMCAOモデルは、通常、C57Bl/6マウスで大規模な脳梗塞を示し、後大脳動脈によって供給される領域に脳組織が含まれることがありますが、これは主に後部連絡動脈閉鎖症の発生率が高いためです。この現象は、フィラメントMCAO後の長期脳卒中回復期にC57Bl/6マウスで観察される高い死亡率の主な原因と考えられています。したがって、多くの慢性脳卒中研究は遠位MCAOモデルを利用しています。しかし、これらのモデルは通常、皮質領域にのみ梗塞を引き起こすため、脳卒中後の神経学的欠損の評価が課題となる可能性があります。この研究は、体幹のMCAが部分的に部分的に閉塞している修正経頭蓋MCAOモデルを確立しました 小さな頭蓋窓 を介して 永久的または一過性に閉塞します。閉塞位置はMCAの起点に比較的近いため、このモデルは皮質と線条体の両方に脳損傷を引き起こします。このモデルの広範な特性評価により、高齢のマウスでも優れた長期生存率と、容易に検出可能な神経学的欠損が実証されています。したがって、ここで説明するMCAOマウスモデルは、実験的な脳卒中研究のための貴重なツールを表しています。
Introduction
米国では毎年約80万人が脳卒中を患っており、そのほとんどが虚血性です1。組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)および/または血栓摘出術による脳血流のタイムリーな回復は、現在、脳卒中患者にとって最も効果的な治療法です。しかし、長期的に神経機能が完全に回復することはまれです2,3。したがって、機能改善を標的とした新しい脳卒中治療法の探索は、臨床的に関連性のある脳卒中の動物モデルを必要とする集中的な研究分野です。
げっ歯類の最も一般的な虚血性脳卒中モデルは、脳卒中を誘発するために管腔内中大脳動脈閉塞(MCAO)を使用します。1989年にZea Longa社が開発したこのモデルでは、ナイロンフィラメントを内頸動脈(ICA)に導入し、中大脳動脈(MCA)への血流を遮断します4。ただし、このモデルには制限があります。まず、フィラメントをICAに挿入すると、特にマウスでは、後大脳動脈(PCA)への血流も部分的に遮断される可能性があります。重要なことに、前大脳循環と後大脳循環をつなぐ小動脈である後部連絡動脈(PcomA)は、主に実験的脳卒中研究に使用されているC57Bl/6株など、一部のマウス系統ではしばしば未発達です。このPcomAの開存性は、脳卒中後のマウスの病変サイズの変動に寄与していると考えられている5。実際、MCAO中にPCAへの血流が急激に低下し、PcomAが十分な副血流を提供できない場合、脳卒中梗塞はPCAの領域に拡大する可能性があります。さらに、このモデルでは、虚血の期間が長いほど、マウスの死亡率が高くなります。その結果、30〜60分の短いMCAO持続時間がマウスで典型的に用いられる。しかし、ほとんどの脳卒中患者は、再灌流治療の前に数時間の虚血を経験します。したがって、虚血の期間が長いマウス脳卒中モデルは、臨床的関連性が高い。
この手順の全体的な目標は、中型の梗塞があり、生存率が優れたマウスの虚血性脳卒中をモデル化することです。この経頭蓋MCAOモデルは、長期の虚血を行うことができるため、臨床的脳卒中の重要な属性に対処し、高齢のマウスはこのモデルによく耐え、機能回復の長期的な評価を可能にします。
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Protocol
この研究に記載されているすべての手順は、研究における動物のケアと使用に関するNIHガイドラインに従って実施され、プロトコルはデューク研究所の動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。本研究では、若齢(8〜10週齢)および生後(22か月齢)の雄のC57Bl/6マウスを使用しました。このプロトコルの概要を 図1に示します。
1.手術の準備
- マウスに肉眼的な異常や行動障害がないか調べます。
注:手術前に、外科医はサージカルマスク、キャップ、手袋、ガウンなどの適切なPPE(個人用保護具)を着用することが重要です。 - マウスの重さを量ります。体重に基づいて人工呼吸器( 材料表を参照)をプログラムします。
- マウスを4インチx4インチx7インチの麻酔誘導ボックスに置きます。30に設定した酸素流量計( 材料表を参照)と70に設定した亜酸化窒素流量計をオンにします。5%イソフルランで気化器をオンにします。
- ガイドワイヤーを20Gの静脈内(IV)カテーテルに挿入します。
- マウスの呼吸数が毎分30〜40回に減少したら、マウスを誘導ボックスから取り出します。
- マウスを仰臥位で手術台に置きます。マウスの舌を引き出し、左手の指で押さえます。喉頭鏡( 資料表参照)を動物の口に挿入して、声帯を視覚化します。
- 右手中指を使って喉頭鏡の上でマウスの顎を安定させます。左手を離して、20 G IVカテーテルを保持します。
- ガイドワイヤーを声帯に少し挿入し、カテーテルの翼部分が鼻先と平らになるまで、20G IVカテーテルをゆっくりと気管に押し込みます。
メモ: マウスが動いている場合は、ワイヤーを挿入しないでください。気管に外傷や出血を起こすことがある。 - 人工呼吸器( 材料表を参照)をオンにし、マウスに挿管された20 G IVカテーテルに接続します。イソフルランを1.5%に減らし、両方の肺が機械的に換気されていることを確認します。.
注:イソフルラン濃度を下げることを忘れないでください。そうでなければ、マウスは麻酔の過剰摂取を受けます。 - 眼軟膏を両眼に塗布し、5 mg / kgのカルプロフェンを皮下に注射します。
- マウスを横方向に保ち、右側の側頭領域を上に向けています。加熱パッド(35°C)と温度調節器によって制御されるヒートランプを使用して、直腸温度を37°Cに維持します( 材料表を参照)。
- 右目と耳の間の表面積を剃り、ヨウ素とアルコール綿棒で手術部位を少なくとも3回消毒します。
2.MCAO手術
- MCAO手術用の滅菌器具パッケージを開きます。滅菌手袋を着用し、手術用ハサミを使用して右目と右耳の間に1cmの皮膚切開を行います。
注意: 肌の色、体温、つま先をつまんだときの反応を15分ごとに監視します。 - 鉗子で下にある筋膜を解剖し、側頭筋と咬筋を露出させます。
注意: 耳下腺を傷つけないように注意してください。 - 鉗子を使用して側頭筋の下部に触れ、頬骨弓の位置を検出します。顔面神経の枝を慎重に脇に引き寄せます。
- 高温焼灼ループ( 材料表参照)の先端を使用して、側頭筋を5mmの横切開します。
- 2つの鉗子を使用して、下にある頬骨弓を解剖し、上顎骨と頬骨の間の関節を露出させます。
- はさみを使用して頬骨弓の3mmの部分を切り取り、それを取り除きます。咬筋を頭蓋底から分離します。
注:眼窩後洞と表在性側頭静脈を骨折しないように注意してください。 - 異なる方向に配置された4つの小さなリトラクターを適用して頭蓋骨の基部を露出させ、三叉神経枝を1つのリトラクターで横方向に引っ張ります。
注:頭蓋底の外面にある溝は、前頭葉と側頭葉の間の側方亀裂の位置を示します。MCAはここにあり(図2A)、その幹と枝は薄くて透明な頭蓋骨を通して見えます(図2B)。この動脈と他の主要な脳動脈との関係を 図2Aに示す。 - MCA幹の上の頭蓋骨と鼻皮質の枝の近位に0.9%生理食塩水を滴下します。電気グラインダーを使用して、小さな骨折が見えるまで頭蓋骨を薄くします。
注意: グラインダーを頭蓋骨に押し付けると、頭蓋骨が貫通して下にある動脈が損傷する可能性があるため、押さないでください。 - 鉗子の先端を使用して、薄くなった頭蓋骨を持ち上げて取り外します。偽マウスの場合は、ここで停止し、動脈を結紮しないでください。
メモ: MCA トランクを横切る小さな長方形のウィンドウが形成されています。 - MCAの上に黒い編組シルクの一本鎖ループを置きます(図2C)。8-0 を挿入するマイクロサージェリー針でMCAトランクを持ち上げ、針の下に縫合糸( 材料表を参照)を結び、針の両端を絹糸のループ結び目の上部に残します(図2D)。
- 一過性MCAOの場合、針の下の絹糸の結び目をわずかに締めて動脈血流を遮断します(図2E)。
- 鉗子を使用して縫合糸を保持し、虚血の終わりにゆっくりと針を抜きます(例:60分以上)。
注:針を抜くと、絹糸の結び目がMCAから滑り落ち、脳が再灌流されます(図2F)。 - 永久MCAOの場合は、動脈の周りの絹糸ループをしっかりと締め、針を取り外します。余分な縫合糸材料を切って取り除きます。
- 皮膚切開部に0.25%ブピバカインを滴下し、6-0ナイロン縫合糸を使用して筋肉と皮膚を別々に断続的に縫合します( 材料表を参照)。皮膚切開部の表面に抗生物質軟膏を塗ります。
注意: 皮膚の切開は、滅菌ステープルまたは接着剤で閉じることもできます。
3.術後のケア
- イソフルランをオフにして、マウスを目覚めさせます。自発呼吸が回復したら、人工呼吸器を外してください。
- マウスを温度管理された回収チャンバー( 材料表を参照)に移します。
- マウスの直立反射が回復したとき、またはマウスが動き始めたら、マウスを抜管します。
- 温度と湿度が制御されたチャンバーでマウスを注意深く監視します。マウスが完全に意識を取り戻した後、マウスをホームケージに戻します(回復期間~2時間)。5 mg / kgのカルプロフェンを毎日3日間皮下投与します。.
4. レーザースペックルコントラストイメージング(LSCI)
- MCAOの6時間後と24時間後に、麻酔マウスを脳定位固定装置フレームに取り付けます。頭のてっぺんを剃り、ヨウ素とアルコールを交互に3本綿棒で拭きます。
注:麻酔は、ステップ1.3で述べたように行われました。LSCIはMCAOの前にも実行されます。 - 3cmの正中線の皮膚切開を行い、頭蓋骨から皮膚を解剖します。4つの小さなニードルリトラクターを適用して、頭蓋骨の上部を露出させます。
- レーザースペックルカメラ( 材料表を参照)を頭の上に移動させ、カメラの焦点を調整します。脳の血流をイメージします。
5. 2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)染色
- 実験の最後に、通常は脳卒中後1日目、3日目、または28日目に、5%イソフルランでマウスに深く麻酔をかけます。尻尾をつまんで、痛みの反応がないことを確認します。
- 外科用ハサミでネズミの首を切り落とし、脳を採取する。脳を氷冷生理食塩水で20分間インキュベートします。
- 氷の上で脳スライサーマトリックスに脳を入れ、冷たい生理食塩水を脳に垂らします。薄いカミソリの刃を使って脳を1mmのスライスに切ります。
- 脳スライスを同じ向きで2%TTC溶液の皿に浸します( 材料表を参照)。皿を室温で15分間暗所に置いておきます。
注:正常な脳組織は赤くなり、虚血組織は白いままです。 - 脳スライスを10%ホルマリンに移し、24時間固定します。脳のスライスを画像化し、梗塞領域を測定します。
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Representative Results
手術用顕微鏡で直接見ることで、虚血時にMCAの血流が遮断されていることを視覚的に確認することができます。私たちの以前の研究では、レーザードップラーモニター6を使用して虚血領域の血流が>80%減少することが示されました。MCAO後の血流変化を決定するために、LSCIを使用して虚血性侮辱と再灌流をさらに確認することができます(図1)。実際、図3Aでは、右MCAの領域で血液供給が減少していることが観察されています。一過性MCAOでは、抜糸後、脳血流の再灌流が明らかであり(図3B)、24時間後にはさらに改善されました(図3C)。脳卒中の脳は24時間後に切片化し、TTCで染色することができます。死んだ組織はTTCと反応せず、白色のままでした(図1)。TTC染色により、このモデルでは皮質と外側線条体の両方の領域に梗塞組織が生成され、梗塞のサイズはフィラメントMCAOと比較して中程度であることが示されました(図4)。このモデルは若齢動物と高齢動物に適用されており、28日間の観察で死亡率(<5%)は無視できる程度であった7。
このモデルは、主に左前足に運動障害と感覚障害を引き起こします。これまでの研究で、脳卒中マウスの神経学的欠損は、シリンダーテスト、オープンフィールドテスト、テープ除去テスト、ポールテスト、フォンフレイフィラメントテストなどのさまざまな行動テストによって証明されています6,8,9,10。経頭蓋MCAOを90分間投与されたマウスも、偽手術マウスと比較して認知障害を示す6。経頭蓋MCAO後の長期的な機能的転帰は、高齢マウスでは体系的に調べられていないが、高齢ラットの同様のモデルでは、脳卒中後28日間にわたって神経学的欠損が明確に示された7。
図1:プロトコルの概要 右MCAは、マウスの小さな頭蓋骨窓から一時的または永久に閉塞しています。TTC染色とLSCIは、それぞれ梗塞のサイズを決定し、虚血後の脳血流を評価するために使用されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:経頭蓋MCAO手術の手順 。 (A)結紮されたMCAの位置。(B)MCA幹とその枝の露出。(C)絹縫合糸の1本のストランドをMCAの上に配置します。(D) 8-0針を使用してMCAトランクを持ち上げ、縫合糸を針の下に結びます。(E)縫合糸をわずかに締めて血流を遮断します。(F)針と縫合糸を抜去し、再灌流を行う。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:遅延再灌流を伴うMCAOのレーザースペックルコントラスト画像 。 (A)右半球は灌流領域が低く(赤矢印)、虚血を示していた。(B)虚血の6時間後、再灌流を可能にするために縫合糸を抜去し、動脈枝が見えるようになった。(C)24時間後、これらの動脈枝の血流灌流が改善した。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:フィラメントMCAOとの違い 。 (A)インク灌流された脳は、脳表面の血管を示しています。赤い矢印は、この経頭蓋MCAOモデルで結紮されているMCAトランクを指しています。緑色の矢印は、フィラメントMCAOモデルにおけるMCA閉塞部位であるMCA原点を指しています。脳梗塞は、脳卒中後24時間でTTC染色された脳スライドで見ることができます。ここでのサンプルは、(B)若齢マウスの60分間のフィラメントMCAO、(C)若齢(8〜10週齢)の永久経頭蓋MCAO、および(D)老齢のC57Bl/6マウス(22か月齢)からのものです。正常組織は赤く、梗塞組織は白色です。このモデルにおける梗塞の大きさは中等度であり、梗塞領域には皮質と線条体の両方が含まれます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
最初の経頭蓋MCA閉塞モデルは、1981年にラットで確立され11,12、1989年に頭蓋切除術なしのMCAOモデルに置き換えられました4。最初の経頭蓋MCA閉塞術は、頬骨弓全体が切除され、筋肉が横方向に引っ張られるように、広い手術野を持っていました。手術後に局所組織が腫れ上がり、ストレスがかかり、動物の餌摂取量が減少しました。私たちの修正経頭蓋MCAOモデルでは、切開は侵襲性が低く、頬骨弓のごく一部のみが除去されます。4つの小さな針リトラクターを使用して術野を露出し、血管や神経を破壊することはありません。MCAトランクは8-0を使用して持ち上げられるため、小さな頭蓋骨の窓で十分です外科用縫合針で、針全体をMCAの下に入れる必要はありません。手術後に局所組織の腫脹は認められなかった6.
このモデルにはいくつかの利点があります。まず、皮質領域と皮質下領域の両方を含む梗塞領域を生成するため、神経学的欠損を容易に評価できます。第二に、このモデルでは、一過性および永久的な虚血性脳卒中の両方が誘発される可能性があります。重要なことは、後期再灌流を模倣するために、虚血期間を延長することができることである。例えば、以前の脳卒中研究では、6時間のMCAOが成功裏に実施されました9。第三に、副次的な血液供給と再灌流のためのPcomAへの依存は最小限であり、脳卒中重症度のばらつきが減少する。最後に、ほとんどすべてのマウスは、高齢のマウスであっても、長期的な機能研究を生き延びることができます。まとめると、このモデルは優れた臨床的関連性を示します。
注目すべきは、このストロークモデルには制限があることです。まず、高度なマイクロサージェリー技術が必要です。初心者の動物外科医は、実体顕微鏡下で開頭術とMCA結紮を完了するのに時間がかかる場合があります。研削、頭蓋骨の除去、縫合糸の留置を慎重に行うことが、このモデルの実装を成功させるための鍵となります。さらに、各動物の同じ場所でMCAを結紮することが重要です。第二に、このモデルでは髄膜が針によってわずかに損傷しており、髄膜に焦点を当てた研究では考慮する必要があるかもしれません。最後に、虚血期間>6時間を行うこともできますが、再灌流はレーザードップラーまたはレーザースペックルイメージングで脳血流を測定することによって確認する必要があります。
以上をまとめると、この改変マウス脳卒中モデルは、中等度の脳損傷を誘発し、高齢動物や脳卒中併存疾患動物における長期生存実験を可能にし、脳卒中の転帰を改善するための実験的脳卒中研究や新薬開発の進展が期待されます。
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Disclosures
すべての著者に利益相反はありません。
Acknowledgments
著者は、編集サポートしてくれたキャシー・ゲージに感謝します。スキームの数字は BioRender.com で作成されました。この研究は、デューク大学医療センター麻酔科からの資金とNIHの助成金(NS099590、HL157354、NS117973、およびNS127163)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% bupivacaine | Hospira | NDC 0409-1159-18 | |
| 0.9% sodium chloride | ICU Medical | NDC 0990-7983-03 | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC) | Sigma or any available vendor | ||
| 20 G IV catheter | BD | 381534 | 20 GA 1.6 IN |
| 30 G needle | BD | 305106 | |
| 4-0 silk suture | Look | SP116 | Black braided silk |
| 8-0 suture with needle | Ethilon | 2822G | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Anesthesia induction box | Any suitable vendor | Pexiglass make | |
| Electrical grinder | JSDA | JD 700 | |
| High temperature cautery loop tip | Bovie | AA03 | |
| Isoflurane | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| Laser doppler perfusion monitor | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | |
| Lubricant eye ointment | Bausch + Lomb | 339081 | |
| Mouse rectal probe | Physitemp | RET-3 | |
| Nitrous Oxide | Airgas | UN1070 | |
| Otoscope | Welchallyn | 728 | 2.5 mm Speculum Otoscope served as a laryngoscope to visualize vocal cords in mice |
| Oxygen | Airgas | UN1072 | |
| Povidone-iodine | CVS | 955338 | |
| Recovery box | Brinsea | TLC eco | |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | 6100701 | Injectable 50 mg/mL |
| Rodent ventilator | Kent Scientific | Rodent Jr. | |
| Temperature controller | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Triple antibioric & pain relief | CVS | NDC 59770-823-56 | |
| Vaporizer | RWD | R583S |
References
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