Summary
该方案提供了一种使用悬浮培养条件从诱导多能干细胞（iPSC）生产肾脏类器官的全面有效的方法。本研究的主要重点在于确定初始细胞密度和 WNT 激动剂浓度，从而使对肾脏类器官研究感兴趣的研究人员受益。
Abstract
肾脏类器官可以通过多种方法从诱导多能干细胞 （iPSC） 中产生。这些类器官在疾病建模、药物筛选和潜在的治疗应用方面具有巨大的前景。本文介绍了从 iPSC 创建肾脏类器官的分步过程，从后原始条纹 （PS） 到中间中胚层 （IM）。该方法依赖于 APEL 2 培养基，这是一种确定的、不含动物成分的培养基。它补充高浓度的 WNT 激动剂 （CHIR99021），持续 4 天，然后补充成纤维细胞生长因子 9 （FGF9）/肝素和低浓度的 CHIR99021，持续 3 天。在此过程中，重点是在 iPSC 开始时选择最佳细胞密度和CHIR99021浓度，因为这些因素对于成功生成肾脏类器官至关重要。该协议的一个重要方面是在低贴壁板中悬浮培养，允许 IM 逐渐发育成肾单位结构，包括肾小球、近端肾小管和远端肾小管结构，所有这些都以视觉上可理解的形式呈现。总体而言，该详细方案提供了一种有效且特定的技术，可从不同的iPSC中生产肾脏类器官，从而确保成功和一致的结果。
Introduction
肾脏在维持生理稳态方面起着关键作用，具体取决于其功能单位。排泄废物的肾单位可以调节体液的成分。由遗传突变或其他高危因素引起的慢性肾脏病 （CKD） 最终会发展为终末期肾病 （ESKD）1,2。ESKD显然是由于肾单位的再生能力有限。因此，需要肾脏替代疗法。人类 iPSC 的定向分化能够在体外生成患者特异性 3D 肾脏类器官，可用于研究肾脏发育、模拟患者特定疾病和进行肾毒性药物筛选 3,4。
在胚胎发育过程中，肾脏起源于中间中胚层 （IM），这与原始条纹 （PS） 不同。经典的 WNT 信号通路可能在 FGF （FGF9， FGF20） 和 BMP （通过 JNK 的 Bmp7 信号转导）的协调参与下诱导 IM 的额外分化5,6,7。它们产生肾祖细胞 （NPC） 的两个重要细胞群：输尿管芽 （UB） 和肾间充质 （MM），分别形成集合管和肾单位 8,9。每个肾单位由肾小球和肾小管段组成，例如近端和远端小管，以及 Henle10,11 的环。根据上述理论，目前发表的方案模拟信号级联和生长因子刺激以诱导肾脏类器官5,12。
在过去的几年中，已经开发了许多方案来将人类 iPSC 区分为肾脏类器官 5,6,7,12。Takasato 等 7 优化了 FGF9 替代前 CHIR（WNT 激动剂）治疗的持续时间。根据他们的方案，CHIR 暴露 4 天，然后 FGF9 暴露 3 天，是诱导 iPSC IM 的最有效方法。Transwell过滤器在其程序中用作培养形式;但是，这种方法对于初学者来说很困难。因此，Kumar et al.13 试图改变文化形式，选择暂停文化。他们在第 7 天解离贴壁细胞，以接种在低贴壁板中，以帮助它们组装成含有肾单位样结构的胚状体 （EB）。然而，这些方法的批量效应是显而易见的，尤其是在不同的iPSC中。此外，不同的文献报道了 CHIR 的浓度从 7 μM 到 12 μM 不等 5,13,14。
我们推测细胞密度和CHIR的浓度可能会影响不同iPSC中类器官的产生，这在我们的实验中已经得到了多次验证。本方案略微修改了Kumar等人的研究方法13 ，并为用户提供了分步程序。该方法的时间表和示意图如图 1所示。
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Protocol
用于本研究的 iPSC 是从商业来源获得的。将细胞用 mTeSR 培养基维持在市售的基底膜基质包被板上（参见 材料表）。 表1 包含研究中使用的所有培养基组合物。
1. 接种 iPSC 以分化和诱导后原始条纹 （PS）
- 用 2 mL DPBS 在膜基质包被的 6 孔板上洗涤 iPSC。使用移液器吸出DPBS。
- 加入1mL市售的细胞分离溶液（参见 材料表）以分离iPSCs，并在37°C下孵育5分钟。
- 向 iPSC 中加入 1 mL mTeSR，并确保细胞已从塑料表面抬起。
- 在室温（RT）下以400× g 离心细胞3分钟。重悬细胞沉淀并使用血细胞计数器计数细胞数。
- 将一系列细胞密度接种到涂有膜基质的 24 孔或 6 孔板上，并用补充有 10 μM Rho 激酶抑制剂 （Y-27632） 的 mTeSR 培养（参见 材料表）。将它们在37°C CO2 培养箱中培养过夜。
注：为了诱导 PS，CHIR99021的最佳浓度和合适的细胞密度因不同的 iPSC 细胞系而异。接种密度范围（例如，每平方厘米0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.4 * 10 3个单细胞 ）和7μM-12μM的CHIR99021浓度范围。 在同一天开始每种密度和每种CHIR的分化。在 24 孔板中找到最佳浓度的 CHIR99021 和合适的细胞密度，然后在 6 孔板中扩增培养物。在这里，我们提供了一个基于6孔板的方案。 - 第二天，吸出 mTeSR 并用 2 mL DPBS 洗涤细胞。
- 加入 2 mL I 期培养基（含有 8-12 μM CHIR99021 的干细胞分化培养基）（表 1），称为第 0 天。
- 将它们在37°C培养箱中培养4天，每两天更新一次I期培养基。
2. 诱导肾源性中间体中胚层（IM）
- 在第 4 天，取出 I 期培养基并用 2 mL DPBS 洗涤。
- 向细胞中加入2mL II期培养基（含有200ng / mL FGF9,1μg/ mL肝素和1μM CHIR99021的干细胞分化培养基）（表1）。
- 将它们在37°C培养箱中培养，并每2天更新一次培养基，直到第7天。
3. 在悬浮培养中产生肾脏类器官
注意：在第 0 天到第 7 天的观察期间，细胞的状态至关重要。如果细胞表现出成功的扩增并堆积而没有明显的细胞碎片，则表明中间中胚层 （IM） 的成功衍生，表明已准备好进入下一阶段。然而，如果细胞出现初始凋亡的迹象，随后出现坏死或破损，则可能表明CHIR99021浓度或细胞密度不合适。
- 在第 7 天，取出 II 期培养基并用 2 mL DPBS 洗涤细胞。
- 向每个孔中加入1mL细胞分离溶液，并在37°C下孵育5分钟，直到细胞在相衬下折射。
- 将 1 mL II 期培养基移液到细胞中，混合并确保细胞已从表面抬起。
- 将细胞悬液收集在 15 mL 试管中，并在室温下以 400 x g 离心 3 分钟。
- 除去上清液，将细胞沉淀重悬于补充有10μMRho激酶抑制剂（Y-27632）的2mL III期培养基（含有200ng/mL FGF9,1μg/ mL肝素和1μM CHIR99021 0.1%甲基纤维素（MC），0.1%聚乙烯醇（PVA）的干细胞分化培养基）（参见 材料表）。轻轻混合。
- 将细胞悬液和种子以 1：3 的比例混合到 6 孔低粘附板中。将板放在37°C和5%CO 2的培养箱中的轨道振荡器（耐CO2，以60rpm旋转）上。
- 24小时后，除去Rho激酶抑制剂（Y-27632）并加入III期培养基（补充含有200ng / mL FGF9,1μg/ mL肝素，1μM CHIR99021,0.1%MC，0.1%PVA的干细胞分化培养基）。培养 2 天。按照以下步骤更改悬浮培养物中的培养基：
- 用无菌剪刀剪掉 1 mL 移液器的尖端。
- 轻轻摇晃 6 孔板，将类器官排列在板的中间。
- 用准备好的移液器将类器官吸入 15 mL 管中，并让它们静置 5 分钟。
- 吸出上清液并将类器官留在管底部。
- 加入新鲜培养基以重悬类器官，然后重新铺板至 6 孔低粘附板中。
- 继续在培养箱中以 60 rpm 的速度摇动低附着力板。每两天更换一次III期培养基，直到第12天。
- 在第 12 天，将培养基更改为 IV 期培养基（含有 0.1% MC 和 0.1% PVA 的干细胞分化培养基）。
- 每两天更换一次培养基，直到第 25 天。类器官可以从第 12-25 天逐渐发育成成熟的肾单位结构。
4.肾脏类器官的免疫荧光染色
- 将肾脏类器官收集到 15 mL 试管中，并用 2 mL PBS 洗涤。
- 在使其凝固5-10分钟后，将肾脏类器官在新鲜制备的2%PFA中在4°C下固定20分钟。
- 除去PFA，用含有0.3%Triton X-100（0.3%PBST）的1mL PBS洗涤类器官，在振荡器（转速不超过60rpm）上均匀摇动8分钟，静置5分钟，然后除去上清液。重复三次。
注意：类器官可以在 4°C 下储存在 0.3% PBST 中 2-4 周。 - 将固定类器官与10%驴血清在PBST（封闭缓冲液）（参见 材料表）中在4°C下孵育过夜。
- 在封闭缓冲液中以 1：300 的比例稀释一抗（在 材料表中列出）。
- 将类器官与一抗在4°C下搅拌孵育过夜。
注意：确保肾小球和肾小管可以同时在一个类器官上染色。 - 用 1 mL 0.3% PBST 洗涤类器官，在振荡器（转速不超过 60 rpm）上均匀摇动 8 分钟，静置 5 分钟，然后除去上清液。重复三次。
- 将类器官与二抗（列在 材料表中）和DAPI在4°C下搅拌孵育过夜。然后重复步骤 4.7。
注：二抗和DAPI均在封闭液，二抗（1：400）和DAPI（1：1000）中稀释。 - 染色后，用甲醇（25%、50%、75% 和 100% 各 5 分钟）脱水类器官，然后用苯甲醇和苯甲酸苄酯（BABB，1：2 比例）（参见 材料表）渗透 5 分钟。
- 在玻璃底培养皿上清除清除的类器官（参见 材料表），并通过共聚焦显微镜检查它们。
注意：成像时，选择玻璃盘底部的培养皿，渗透时，将BABB直接放入培养皿中，以保持培养皿底部湿润。
5. 体外 葡聚糖摄取试验
- 在第25天，将类器官与100μg/ mL荧光标记的葡聚糖（参见 材料表）在37°C和5%CO2的培养箱中孵育4小时。
- 4小时后，切换到新鲜培养基并使用宽视场荧光显微镜捕获活细胞培养图像。
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Representative Results
IM 的产生是通过使用 GSK3 抑制剂 CHIR99021 激活经典 WNT 信号转导，然后使用 FGF9/肝素来实现的。从第 0 天到第 4 天，iPSC 迅速扩增并呈现菱形或三角形。汇合度达到 90%-100%，并均匀积累至第 7 天。悬浮培养后，聚集体在第 7 天解离后自发形成肾单位结构。通过悬浮培养产生的肾脏类器官显示出管状结构，并且在聚集 18 天后很容易在明场图像中观察到（图 2 和 图 3）。
通常，从 24 孔 iPSC 板的孔开始的一次检测可产生 200-300 个类器官。其中，80%-90%含有肾单位样结构（图2）。对于 hiPSC-B1 iPSC 细胞系，生成肾脏类器官的最佳条件是培养 1.8-2.0 x 104 个细胞，该孔板的孔中含有 8 μM CHIR99021（图 2、图 3 和图 4）。通过每 2-3 天更换一次 IV 期培养基，这些肾脏类器官可以在第 25 天后维持长达 1-2 周。
对整个类器官进行免疫荧光分析，发现存在肾单位片段，包括NPHS1-、突触足蛋白（SYNAPO-）和WT1标记的足细胞、MEIS1/2/3标记的间质细胞、Lotus Tetragonolobus 凝集素（LTL-）标记的近端小管、E-钙粘蛋白（ECAD-）标记的远端小管和GATA3标记的集合管。此外，该方案诱导显示CD31阳性染色的内皮细胞（图5）。
最后， 体外 葡聚糖摄取测定表明肾脏类器官的生理相关功能。将肾脏类器官（第7 + 18天）与100μg/ mL荧光标记的葡聚糖孵育4小时后，观察到右旋糖酐在明场图像中被带入近端小管（图5L 和 图6）。
图 1：实验时间表和协议概述。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：使用不同浓度的CHIR99021从第 0 天到第 7 天生成肾脏类器官。 比例尺：100 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：使用不同浓度的CHIR99021从第 8 天到第 21 天生成肾脏类器官。 比例尺：100 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：第 7 天拍摄的不同细胞密度从 1.5 x 10 4 到 2.2 x 104 个细胞/孔的图像。 比例尺：100 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：肾脏类器官的代表性共聚焦免疫荧光图像。 （A，B） D7+11 肾类器官肾单位祖细胞（SALL1，蓝色）、肾小管前聚集体（PAX8，品红色）、足细胞（NPHS1，蓝色）标志物的免疫荧光分析。（C-K）类器官中分段模式的免疫荧光分析显示存在足细胞（NPHS1、NPHS2、SYNAPO和WT1，红色;MAFB，绿色）、近端小管（LTL，白色;LRP2，蓝色;CUBN，红色）、远端小管（ECAD，绿色）、集合管（GATA3，粉红色）、系膜细胞（PDGFR，红色）、间质细胞（MEIS1/2/3，绿色）、整合素β1（TIGB1，绿色）和内皮细胞（CD31，绿色）。比例尺：100 μm （A、C、E-J）、50 μm （B） 和 10 μm （D，K）。（L） 葡聚糖更新试验后肾类器官的免疫荧光分析。比例尺：10μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：第 25 天肾脏类器官的体外功能验证。 （A-D）与 10 kDa 的荧光标记葡聚糖一起孵育的肾脏类器官的实时图像。比例尺：100 μm （A，B）;10微米（C，D）。请点击这里查看此图的较大版本.
| 试剂 | 库存成分 | 工作条件 |
阶段  中等 |
||
| 阿佩尔 | 不适用 | 不适用 |
| CHIR 99021型 | 10微米 | 4-12微米 |
阶段  中等 |
||
| 阿佩尔 | 不适用 | 不适用 |
| FGF9型 | 100纳克/微升 | 200纳克/毫升 |
| rHSA（rHSA） | 0.2 克/毫升 | 1微克/毫升 |
| 肝素 | 2毫克/毫升 | 1微克/毫升 |
| CHIR 99021型 | 10微米 | 1微米 |
阶段  中等 |
||
| 阿佩尔 | 不适用 | 不适用 |
| FGF9型 | 100纳克/微升 | 200纳克/毫升 |
| rHSA（rHSA） | 0.2 克/毫升 | 1微克/毫升 |
| 肝素 | 2毫克/毫升 | 1微克/毫升 |
| CHIR 99021型 | 10微米 | 1微米 |
| 聚氯乙烯 | 1% | 0.10% |
| 司仪 | 1% | 0.10% |
阶段  中等 |
||
| 阿佩尔 | 不适用 | 不适用 |
| 聚氯乙烯 | 1% | 0.10% |
| 司仪 | 1% | 0.10% |
表1：研究中使用的培养基组合物。
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Discussion
已经描述了从 iPSC 生成肾脏类器官的详细方案，包括对基础培养基、初始细胞密度和CHIR99021浓度的微小修改。在各种实验中，发现成功产生肾脏类器官的关键因素是中间中胚层 （IM） 的初始分化和第 7 天的细胞状态。此外，不同的iPSC细胞系表现出细胞增殖和分化潜力的变化，导致不同的最佳细胞密度和CHIR99021浓度5,13,14。因此，确定每个 iPSC 细胞系的理想条件对于从患者特异性 iPSC 中产生大量肾脏类器官至关重要。
为了确定最佳条件，建议使用 24 孔板进行初步实验，然后再将培养物放大到 6 孔板以进行更大规模的生产。此步骤允许研究人员根据细胞形态和数量评估诱导的成功。此外，类器官可以在固定后在其完整结构中保存 2-4 周，增强了该方法的可行性和实用性。
使用该方案生成的肾脏类器官通常测量约为50-300μm，并且在明场显微镜下观察时表现出管状结构。免疫荧光分析证实了肾单位的可靠形成，例如用 NPHS1 和 WT1 标记的足细胞，用 LTL、LRP2 和 CUBN 标记的近端小管，用 ECAD 标记的远端小管，用 GATA3 标记的集合管和用 MEIS1/2/3 标记的间质细胞13。此外，该方案诱导用CD31染色的内皮细胞的存在，表明肾脏类器官内有血管化的可能性。
体外 葡聚糖摄取测定可证明肾脏类器官的生理相关功能，例如初步过滤和重吸收。这使得它们非常适合疾病建模和研究功能障碍的机制。然而，需要注意的是，这些肾脏类器官的成熟度类似于孕早期的人肾，并且在 体外 培养物中它们缺乏脉管系统13。需要进一步的研究来阐明潜在的机制。
总之，所描述的方案提供了一种从iPSCs生成肾脏类器官的有前途的方法，为进一步的研究和研究提供了途径。
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Disclosures
作者报告没有潜在的利益冲突。
Acknowledgments
我们非常感谢所有毛和胡实验室成员，无论是过去还是现在，都对这个项目进行了有趣的讨论和巨大贡献。我们感谢国家儿童健康临床研究中心的大力支持。本研究由国家自然科学基金（U20A20351建华毛，82200784立单胡）、浙江省自然科学基金（No.LQ22C070004力丹胡）和江苏省自然科学基金（批准号）BK20210150给王刚）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #07920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
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