Summary
Этот протокол представляет собой комплексный и эффективный метод получения почечных органоидов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с использованием условий суспензионного культивирования. Основной акцент в этом исследовании делается на определении начальной плотности клеток и концентрации агонистов WNT, что приносит пользу исследователям, заинтересованным в исследовании органоидов почек.
Abstract
Органоиды почек могут быть получены из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с помощью различных подходов. Эти органоиды имеют большие перспективы для моделирования заболеваний, скрининга лекарств и потенциального терапевтического применения. В данной статье представлена пошаговая процедура создания почечных органоидов из ИПСК, начиная от задней примитивной полосы (ПС) до промежуточной мезодермы (ИМ). Этот подход основан на среде APEL 2, которая представляет собой определенную среду, не содержащую компонентов животного происхождения. Он дополняется высокой концентрацией агониста WNT (CHIR99021) в течение 4 дней, затем фактором роста фибробластов 9 (FGF9)/гепарином и низкой концентрацией CHIR99021 в течение дополнительных 3 дней. Во время этого процесса особое внимание уделяется выбору оптимальной плотности клеток и концентрации CHIR99021 в начале ИПСК, поскольку эти факторы имеют решающее значение для успешной генерации органоидов почек. Важным аспектом этого протокола является суспензионная культура в низкоадгезивной пластине, позволяющая ИМ постепенно развиваться в нефроновые структуры, охватывающие клубочковые, проксимальные канальцевые и дистальные канальцевые структуры, представленные в визуально понятном формате. В целом, этот подробный протокол предлагает эффективную и специфическую технику получения почечных органоидов из различных ИПСК, обеспечивая успешные и стабильные результаты.
Introduction
Почка играет важнейшую роль в поддержании физиологического гомеостаза в зависимости от ее функциональной единицы. Нефроны, которые выводят продукты жизнедеятельности, могут регулировать состав жидкостей организма. Хроническая болезнь почек (ХБП), вызванная наследственными мутациями или другими факторами высокого риска, в конечном итоге прогрессирует до терминальной стадии заболевания почек (ЭСКД)1,2. ЕСКД, по-видимому, обусловлен ограниченной способностью нефронов к регенерации. Таким образом, требуется заместительная почечная терапия. Направленная дифференцировка ИПСК человека позволяет генерировать in vitro специфические для пациента 3D-органоиды почек, которые могут быть использованы для изучения развития почек, моделирования специфических для пациента заболеваний и проведения скрининга нефротоксических препаратов 3,4.
Во время эмбрионального развития почки берут начало из промежуточной мезодермы (ИМ), которая дифференцируется от примитивной полосы (ПВ). Классический сигнальный путь WNT может индуцировать дополнительную дифференцировку ИМ при скоординированном участии FGF (FGF9, FGF20) и BMP (Bmp7 через JNK)5,6,7. Они продуцируют две важные клеточные популяции нефрических клеток-предшественников (NPC): почки мочеточника (UB) и метанефрическую мезенхиму (MM), образуя собирательные протоки и нефрон, соответственно 8,9. Каждый нефрон состоит из клубочковых и трубчатых сегментов, таких как проксимальные и дистальные канальцы, а также петли Генле10,11. Согласно вышеупомянутой теории, опубликованные в настоящее время протоколы имитируют сигнальные каскады и стимуляцию факторов роста для индуцирования почечных органоидов 5,12.
За последние несколько лет было разработано множество протоколов для дифференциации ИПСК человека в почечные органоиды 5,6,7,12. Takasato et al.7 оптимизировали продолжительность лечения CHIR (агонистом WNT) перед заменой на FGF9. Согласно их протоколу, воздействие CHIR в течение 4 дней с последующим введением FGF9 в течение 3 дней является наиболее эффективным способом индуцирования внутримышечного введения из ИПСК. В качестве культурального формата в их процедуре использовались фильтры Transwell; Однако этот способ сложен для новичков. Поэтому Kumar et al.13 попытались изменить формат культуры и решили приостановить ее действие. Они диссоциировали адгезивные клетки на 7-й день для посева в низкие адгезивные пластины, чтобы помочь им собраться в эмбриоидные тела (ЭБ), которые содержат нефроноподобные структуры. Тем не менее, пакетный эффект этих методов был очевиден, особенно в различных ИПСК. Кроме того, в различных литературных источниках сообщалось, что концентрация CHIR варьировала от 7 мкМ до 12 мкМ 5,13,14.
Мы предположили, что концентрация клеточной плотности и CHIR могут влиять на генерацию органоидов в различных ИПСК, и это было проверено много раз в наших экспериментах. Настоящий протокол несколько модифицировал метод исследования Kumar et al.13 и предоставил пользователям пошаговую процедуру. График и схема подхода представлены на рисунке 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ИПСК, использованные в настоящем исследовании, были получены из коммерческого источника. Клетки поддерживали средой mTeSR на коммерчески доступных пластинах с матричным покрытием базальной мембраны (см. таблицу материалов). В таблице 1 приведены все составы сред, использованные в исследовании.
1. Покрытие ИПСК для дифференцировки и индуцирования задней примитивной полосы (ПС)
- Промыть ИПСК на 6-луночном планшете с мембранным матричным покрытием 2 мл DPBS. Аспирируйте DPBS с помощью пипетки.
- Добавьте 1 мл коммерчески доступного раствора для отделения клеток (см. таблицу материалов) для отделения ИПСК и инкубируйте при 37 °C в течение 5 мин.
- Добавьте 1 мл mTeSR к ИПСК и убедитесь, что клетки оторвались от пластиковой поверхности.
- Центрифугируйте клетки при 400 x g в течение 3 мин при комнатной температуре (RT). Ресуспендируйте клеточную гранулу и подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра.
- Высевают клетки различной плотности на 24- или 6-луночный планшет, покрытый мембранным матриксом, и культуру с mTeSR, дополненным ингибитором 10 мкМ ро-киназы (Y-27632) (см. таблицу материалов). Культивируйте их в течение ночи в инкубаторе CO2 с температурой 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для индуцирования ФС оптимальная концентрация CHIR99021 и подходящая плотность клеток варьируются от разных линий ИПСК. Засейте в диапазоне плотностей (например, 0,6, 0,9, 1,2, 1,5, 1,8, 2,4 * 10,3 одиночные клетки на квадратный сантиметр) и диапазоне концентрации CHIR99021 от 7 мкМ до 12 мкМ. Инициируйте дифференциацию каждой плотности и каждого CHIR в один и тот же день. Найдите оптимальную концентрацию CHIR99021 и подходящую плотность клеток в 24-луночном планшете, а затем разведите культуру в 6-луночном планшете. Здесь мы приводим протокол, основанный на 6-луночном планшете. - На следующий день аспирируйте mTeSR и промойте клетки 2 мл DPBS.
- Добавьте 2 мл среды I стадии (среда дифференцировки стволовых клеток, содержащая 8-12 мкМ CHIR99021) (Таблица 1), см. День 0.
- Культивируйте их в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 4 дней, обновляйте среду I стадии каждые два дня.
2. Индуцирование нефрогенной промежуточной мезодермы (ИМ)
- На 4-й день удалите среднюю стадию I и умойтесь 2 мл DPBS.
- Добавьте в клетки 2 мл среды II стадии (среда дифференцировки стволовых клеток, содержащая 200 нг/мл FGF9, 1 мкг/мл гепарина и 1 мкМ CHIR99021) (табл. 1).
- Культивируйте их в инкубаторе при температуре 37 °C и обновляйте среду каждые 2 дня до 7-го дня.
3. Получение почечных органоидов в суспензионной культуре
ПРИМЕЧАНИЕ: В период наблюдения с 0-го по 7-й день состояние клеток критическое. Если клетки демонстрируют успешную экспансию и накапливаются без значительного клеточного мусора, это свидетельствует об успешном образовании промежуточной мезодермы (ИМ), что указывает на готовность перейти к следующему этапу. Однако, если клетки демонстрируют признаки начального апоптоза, за которым следует некроз или поломка, это может свидетельствовать о неподходящей концентрации CHIR99021 или плотности клеток.
- На 7-й день удалите среду II стадии и промойте клетки 2 мл DPBS.
- Добавьте 1 мл раствора для отслоения клеток в каждую лунку и инкубируйте при 37 °C в течение 5 мин до преломления клеток при фазовом контрасте.
- Пипеткой 1 мл среды II стадии для клеток, перемешайте и убедитесь, что клетки оторвались от поверхности.
- Соберите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при концентрации 400 x g в течение 3 мин при комнатной температуре.
- Удалить надосадочную жидкость и ресуспендировать клеточную гранулу в 2 мл среды III стадии (среда дифференцировки стволовых клеток, содержащая 200 нг/мл FGF9, 1 мкг/мл гепарина и 1 мкМ CHIR99021 в 0,1% метилцеллюлозы (MC), 0,1% поливинилового спирта (PVA)) с добавлением ингибитора 10 мкМ ро-киназы (Y-27632) (см. таблицу материалов). Аккуратно перемешайте.
- Смешайте клеточную суспензию и семена в 6-луночную пластину с низкой адгезией в пропорции 1:3. Поместите пластину на орбитальный шейкер (устойчивый к СО2, вращающийся со скоростью 60 об/мин) в инкубатор при температуре 37 °C и 5%СО2.
- Через 24 ч удаляют ингибитор Rho киназы (Y-27632) и добавляют среду III стадии (добавка среды для дифференцировки стволовых клеток с 200 нг/мл FGF9, 1 мкг/мл гепарина, 1 мкМ CHIR99021, 0,1% MC, 0,1% PVA). Культура в течение 2 дней. Измените среду в культуре суспензии, выполнив следующие действия:
- Отрежьте кончик пипетки объемом 1 мл асептическими ножницами.
- Осторожно встряхните 6-луночную тарелку, чтобы расположить органоиды в середине тарелки.
- Аспирируйте органоиды подготовленными пипетками в пробирку объемом 15 мл и дайте им постоять 5 минут.
- Отсасывайте надосадочную жидкость и оставьте органоиды на дне пробирки.
- Добавьте свежую среду, чтобы ресуспендировать органоиды, и переложите обратно в 6-луночную пластину с низкой адгезией.
- Продолжайте встряхивать пластину с низкой адгезией при 60 об/мин в инкубаторе. Меняйте среду III стадии каждые два дня до 12-го дня.
- На 12-й день смените среду на среду IV стадии (среда дифференцировки стволовых клеток, содержащая 0,1% MC и 0,1% PVA).
- Меняйте средство каждые два дня до 25-го дня. Органоиды могут постепенно развиваться в зрелые структуры нефрона с 12-го по 25-й день.
4. Иммунофлуоресцентное окрашивание органоидов почек
- Соберите органоиды почек в пробирку объемом 15 мл и промойте 2 мл PBS.
- Дав ему застыть в течение 5-10 минут, зафиксируйте почечные органоиды в свежеприготовленном 2% PFA в течение 20 мин при 4 °C.
- Удалить PFA и промыть органоиды 1 мл PBS, содержащим 0,3% Triton X-100 (0,3% PBST), равномерно встряхнуть на шейкере (со скоростью вращения не более 60 об/мин) в течение 8 мин, дать постоять 5 мин, а затем удалить надосадочную жидкость. Повторите три раза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды можно хранить в 0,3% PBST при 4°C в течение 2-4 недель. - Инкубируют фиксированные органоиды с 10% ослиной сывороткой в PBST (блокирующий буфер) (см. таблицу материалов) в течение ночи при 4 °C.
- Первичные антитела (перечисленные в таблице материалов) разводят в блокирующем буфере в соотношении 1:300.
- Инкубируют органоиды с первичными антителами в течение ночи при 4 °C при перемешивании.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что клубочки и канальцы могут быть окрашены одновременно на одном органоиде. - Органоиды промыть 1 мл 0,3% ПБСТ, равномерно встряхнуть на шейкере (со скоростью вращения не более 60 об/мин) в течение 8 мин, дать постоять 5 мин, а затем удалить надосадочную жидкость. Повторите три раза.
- Органоиды инкубируют со вторичными антителами (перечисленными в таблице материалов) и DAPI в течение ночи при 4 °C при перемешивании. Затем повторите шаг 4.7.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как вторичные антитела, так и DAPI разбавляются в блокирующем растворе, вторичные антитела (1:400) и DAPI (1:1000). - После окрашивания обезвоживают органоиды метанолом (25%, 50%, 75% и 100% в течение 5 мин каждый), затем пермеат бензиловым спиртом и бензилбензоатом (БАББ, соотношение 1:2) (см. таблицу материалов) в течение 5 мин.
- Очищенные органоиды выложите на чашку со стеклянным дном (см. Таблицу материалов) и исследуйте их с помощью конфокальной микроскопии.
ПРИМЕЧАНИЕ: При визуализации выбирайте чашку Петри на дне стеклянной чашки, а при проникновении помещайте BABB непосредственно в чашку Петри, чтобы дно чашки оставалось влажным.
5. Анализ поглощения декстрана in vitro
- На 25-й день инкубируют органоиды со 100 мкг/мл флуоресцентно меченого декстрана (см. таблицу материалов) в течение 4 ч в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2.
- Через 4 часа переключитесь на свежую среду и сделайте живые изображения клеточных культур с помощью широкопольного флуоресцентного микроскопа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Выработка IM достигается активацией канонической сигнализации WNT с помощью ингибитора GSK3 CHIR99021 с последующим FGF9/гепарином. С 0-го по 4-й день ИПСК быстро расширяются и приобретают ромбовидную или треугольную форму. Слияние достигает 90%-100% и накапливается равномерно до 7-го дня. При суспензионной культуре агрегаты спонтанно образуют нефронные структуры после диссоциации на 7-й день. Почечные органоиды, полученные с помощью суспензионной культуры, имеют трубчатые структуры и легко наблюдаются на ярких полевых изображениях после 18 дней агрегации (рис. 2 и рис. 3).
Как правило, один анализ, начинающийся с лунки 24-луночного планшета с ИПСК, дает 200-300 органоидов. Из них 80%-90% содержат нефроноподобные структуры (рис. 2). Для линии hiPSC-B1 iPSC наилучшие условия для получения почечных органоидов предполагают культивирование 1,8-2,0 x10 4 клеток лунки 24-луночного планшета с CHIR99021 8 мкМ (рис. 2, рис. 3 и рис. 4). Эти почечные органоиды могут поддерживаться в течение 1-2 недель после 25-го дня, меняя среду IV стадии каждые 2-3 дня.
Иммунофлуоресцентный анализ целых органоидов выявляет наличие сегментов нефрона, в том числе NPHS1-, синаптоподинов (SYNAPO-) и WT1-меченых подоцитов, интерстициальных клеток, меченных MEIS1/2/3, проксимальных канальцев, меченных Lotus Tetragonolobus Lectin (LTL-), дистальных канальцев, меченных E-кадгерином (ECAD-), и GATA3-меченных собирательных протоков. Кроме того, этот протокол индуцирует эндотелиальные клетки, которые демонстрируют положительное окрашивание CD31 (рис. 5).
Наконец, анализы поглощения декстрана in vitro указывают на физиологически значимые функции почечных органоидов. После инкубации почечных органоидов (7-й + 18-й день) со 100 мкг/мл флуоресцентно меченого декстрана в течение 4 ч наблюдается попадание декстрана в проксимальные канальцы на изображениях с яркими полями (рис. 5L и рис. 6).
Рисунок 1: График экспериментов и обзор протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Генерация почечных органоидов с 0-го по 7-й день с использованием различных концентраций CHIR99021. Масштабные линейки: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Генерация почечных органоидов с 8-го по 21-й день с использованием различных концентраций CHIR99021. Масштабные линейки: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Изображения, полученные на 7-й день с различной плотностью клеток от 1,5 x 104 до 2,2 x 104 клеток на лунку. Масштабные линейки: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Репрезентативные конфокальные иммунофлуоресцентные изображения почечных органоидов. (A,B) Иммунофлуоресцентный анализ на маркеры нефрон-предшественника (SALL1, синий), преканальцевого агрегата (PAX8, пурпурный), подоцита (NPHS1, синий) почечных органоидов D7+11. (К-К) Иммунофлуоресцентный анализ сегментовидных структур в органоидах показывает наличие подоцитов (NPHS1, NPHS2, SYNAPO и WT1, красный; MAFB, зеленый), проксимальные канальцы (LTL, белый; LRP2, синий; CUBN, красный), дистальные канальцы (ECAD, зеленый), собирающие протоки (GATA3, розовый), мезангиальные клетки (PDGFR, красный), интерстициальные клетки (MEIS1/2/3, зеленый), интегрин бета-1 (TIGB1, зеленый) и эндотелиальные клетки (CD31, зеленый). Масштабные линейки: 100 мкм (A, C, E-J), 50 мкм (B) и 10 мкм (D, K). (L) иммунофлуоресцентный анализ органоидов почек после анализа на обновление декстрана. Масштабная линейка: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Функциональная валидация in vitro органоидов почек на 25-й день. (А-Д) Живые изображения почечных органоидов, инкубированных флуоресцентно-меченым декстраном 10 кДа. Масштабные линейки: 100 мкм (A,B); 10 мкм (C,D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Реагент | Сток конц. | Рабочий конц. |
Сцена  Терпимая |
||
| АПЕЛ | н/д | н/д |
| ХИР 99021 | 10 мкМ | 4-12 мкМ |
Сцена  Терпимая |
||
| АПЕЛ | н/д | н/д |
| ФГФ9 | 100 нг/мкл | 200 нг/мл |
| rHSA | 0,2 г/мл | 1 мкг/мл |
| Гепарин | 2 мг/мл | 1 мкг/мл |
| ХИР 99021 | 10 мкМ | 1 мкМ |
Сцена  Терпимая |
||
| АПЕЛ | н/д | н/д |
| ФГФ9 | 100 нг/мкл | 200 нг/мл |
| rHSA | 0,2 г/мл | 1 мкг/мл |
| Гепарин | 2 мг/мл | 1 мкг/мл |
| ХИР 99021 | 10 мкМ | 1 мкМ |
| ПВА | 1% | 0.10% |
| МГЦ | 1% | 0.10% |
Сцена  Терпимая |
||
| АПЕЛ | н/д | н/д |
| ПВА | 1% | 0.10% |
| МГЦ | 1% | 0.10% |
Таблица 1: Составы сред, использованные в исследовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Был описан подробный протокол получения почечных органоидов из ИПСК, включающий незначительные модификации базальной среды, исходной плотности клеток и концентрации CHIR99021. В различных экспериментах было установлено, что критическими факторами для успешной генерации почечных органоидов являются начальная дифференцировка промежуточной мезодермы (ИМ) и состояние клеток на 7-е сутки. Кроме того, различные линии ИПСК демонстрировали различия в потенциале пролиферации и дифференцировки клеток, что приводило к различным оптимальным плотностям клеток и концентрациям CHIR99021 5,13,14. Следовательно, определение идеальных условий для каждой линии ИПСК имеет важное значение для производства значительного количества почечных органоидов из ИПСК, специфичных для конкретного пациента.
Для выявления оптимальных условий рекомендуется провести предварительные эксперименты с использованием 24-луночных планшетов перед масштабированием культуры до 6-луночных планшетов для более крупносерийного производства. Этот шаг позволяет исследователям оценить успешность индукции на основе морфологии и количества клеток. Кроме того, органоиды могут сохраняться в своей полной структуре в течение 2-4 недель после фиксации, что повышает осуществимость и полезность этого метода.
Органоиды почек, полученные с использованием этого протокола, обычно имеют размер около 50-300 мкм и демонстрируют трубчатые структуры при наблюдении под яркой полевой микроскопией. Иммунофлуоресцентный анализ подтверждает надежное формирование почечных нефронов, таких как подоциты, меченные NPHS1 и WT1, проксимальные канальцы, меченные LTL, LRP2 и CUBN, дистальные канальцы, меченные ECAD, собирательные протоки, меченные GATA3, и интерстициальные клетки, меченные MEIS1/2/313. Кроме того, этот протокол индуцирует присутствие эндотелиальных клеток, окрашенных CD31, что предполагает возможность васкуляризации в органоидах почек.
Анализы поглощения декстрана in vitro демонстрируют физиологически значимые функции органоидов почек, такие как предварительная фильтрация и реабсорбция. Это делает их очень подходящими для моделирования заболеваний и изучения механизмов дисфункции. Тем не менее, важно отметить, что зрелость этих почечных органоидов напоминает почки человека в первом триместре, и у них отсутствует сосудистая сеть в культуре in vitro 13. Необходимы дальнейшие исследования для выяснения лежащих в их основе механизмов.
В заключение, описанный протокол предлагает многообещающий метод получения почечных органоидов из ИПСК, открывая возможности для дальнейших исследований и изучения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы сообщили об отсутствии потенциального конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы чрезвычайно благодарны всем членам Лаборатории Мао и Ху, бывшим и нынешним, за интересные дискуссии и большой вклад в проект. Благодарим Национальный клинический исследовательский центр детского здоровья за большую поддержку. Это исследование было проведено при финансовой поддержке Национального фонда естественных наук Китая (U20A20351 Цзяньхуа Мао, 82200784 Лидань Ху), Фонда естественных наук провинции Чжэцзян Китая (No. LQ22C070004 Лидань Ху) и Фонд естественных наук провинции Цзянсу (гранты No 1). BK20210150 Ган Вану).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #07920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
References
- Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
- Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease - a systematic review and meta-analysis. PLOS ONE. 11 (7), 0158765 (2016).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Morizane, R., Lam, A. Q., Freedman, B. S., Kishi, S., Valerius, M. T., Bonventre, J. V. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6 (1), 8715 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Mugford, J. W., Sipilä, P., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney. Developmental biology. 324 (1), 88-98 (2008).
- SaxOn, L., Sariola, H.
- Kobayashi, A., et al. Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development. Cell Stem Cell. 3 (2), 169-181 (2008).
- Boyle, S., et al. Fate mapping using Cited1-CreERT2 mice demonstrates that the cap mesenchyme contains self-renewing progenitor cells and gives rise exclusively to nephronic epithelia. Developmental Biology. 313 (1), 234-245 (2008).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15 (10), 613-624 (2019).
- Kumar, S. V., et al. Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells. Development. 146 (5), 172361 (2019).
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
