Questo protocollo presenta un metodo completo ed efficiente per la produzione di organoidi renali da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) utilizzando condizioni di coltura in sospensione. L'enfasi principale di questo studio risiede nella determinazione della densità cellulare iniziale e della concentrazione dell'agonista WNT, avvantaggiando così i ricercatori interessati alla ricerca sugli organoidi renali.
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Articolo metodologico
Generazione di organoidi renali in sospensione da cellule staminali pluripotenti indotte
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli organoidi renali possono essere generati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) attraverso vari approcci. Questi organoidi sono molto promettenti per la modellazione delle malattie, lo screening dei farmaci e le potenziali applicazioni terapeutiche. Questo articolo presenta una procedura passo-passo per creare organoidi renali da iPSC, a partire dalla striscia primitiva posteriore (PS) fino al mesoderma intermedio (IM). L'approccio si basa sul terreno APEL 2, che è un mezzo definito, privo di componenti animali. È integrato con un'alta concentrazione di agonista WNT (CHIR99021) per una durata di 4 giorni, seguita da fattore di crescita dei fibroblasti 9 (FGF9)/eparina e una bassa concentrazione di CHIR99021 per altri 3 giorni. Durante questo processo, viene data enfasi alla selezione della densità cellulare ottimale e della concentrazione di CHIR99021 all'inizio delle iPSC, poiché questi fattori sono fondamentali per il successo della generazione di organoidi renali. Un aspetto importante di questo protocollo è la coltura in sospensione in una placca a bassa aderenza, che consente all'IM di svilupparsi gradualmente in strutture nefroniche, comprendenti strutture tubulari glomerulari, tubolari prossimali e distali, tutte presentate in un formato visivamente comprensibile. Nel complesso, questo protocollo dettagliato offre una tecnica efficiente e specifica per produrre organoidi renali da diverse iPSC, garantendo risultati positivi e coerenti.
Introduzione
Il rene svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'omeostasi fisiologica, a seconda della sua unità funzionale. I nefroni, che espellono i prodotti di scarto, possono regolare la composizione dei fluidi corporei. La malattia renale cronica (CKD), causata da mutazioni ereditarie o da altri fattori ad alto rischio, progredisce fino alla malattia renale allo stadio terminale (ESKD)1,2. L'ESKD è apparentemente dovuta alla limitata capacità di rigenerazione dei nefroni. Pertanto, è necessaria una terapia sostitutiva renale. La differenziazione diretta delle iPSC umane consente la generazione in vitro
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Protocollo
Le iPSC utilizzate per il presente studio sono state ottenute da una fonte commerciale. Le cellule sono state mantenute con terreno mTeSR su piastre rivestite a matrice di membrana basale disponibili in commercio (vedi Tabella dei materiali). La Tabella 1 contiene tutte le composizioni dei mezzi utilizzati nello studio.
1. Placcatura di iPSC per la differenziazione e l'induzione di striature primitive posteriori (PS)
- Lavare le iPSC sulla piastra a 6 pozzetti rivestita con matrice di membrana con 2 mL di DPBS. Aspirare il DPBS con una pipetta.
- Aggiungere 1 mL della soluzi....
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Risultati
La produzione di IM si ottiene attivando la segnalazione canonica WNT utilizzando l'inibitore GSK3 CHIR99021, seguito da FGF9/eparina. Dal giorno 0 al giorno 4, le iPSC si espandono rapidamente e assumono forme romboidali o triangolari. La confluenza raggiunge il 90%-100% e si accumula uniformemente fino al giorno 7. Al momento della coltura in sospensione, gli aggregati formano spontaneamente strutture nefroniche dopo essersi dissociati il giorno 7. Gli organoidi renali creati attraverso la coltura in sospensione mostra.......
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Discussione
È stato descritto un protocollo dettagliato per la generazione di organoidi renali da iPSC, che comporta piccole modifiche al mezzo basale, alla densità cellulare iniziale e alla concentrazione di CHIR99021. In vari esperimenti, i fattori critici per il successo della generazione di organoidi renali sono risultati essere la differenziazione iniziale del mesoderma intermedio (IM) e lo stato cellulare il giorno 7. Inoltre, diverse linee di iPSC hanno mostrato variazioni nella proliferazione cellulare e nel potenziale di di.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno segnalato alcun potenziale conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Siamo estremamente grati a tutti i membri di Mao e Hu Lab, passati e presenti, per le interessanti discussioni e i grandi contributi al progetto. Ringraziamo il Centro Nazionale di Ricerca Clinica per la Salute del Bambino per il grande supporto. Questo studio è stato sostenuto finanziariamente dalla National Natural Science Foundation of China (U20A20351 a Jianhua Mao, 82200784 a Lidan Hu), dalla Natural Science Foundation of Zhejiang Province of China (No. LQ22C070004 a Lidan Hu), e la Fondazione per le Scienze Naturali della Provincia di Jiangsu (Sovvenzioni n. BK20210150 a Gang Wang).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra per colture cellulari a 96 pozzetti, | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #07920 | |
| Anticorpi | |||
| Alcool benzilico | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzil benzoato | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Armadio di sicurezza biologica | Haier | Cat #HR40  A2 | |
| Biotina anti-umana LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Cellule mononucleate del sangue hiPS-B1 (iPSc, femmina) | N/A | N/A | |
| Agitatore di livello di anidride carbonica | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Sostanze chimiche, peptidi e proteine | |||
| CHIR99021 (attivatore della via Wnt) | STEMCELL Tecnologie | Cat #72054 | |
| Costar Piastra per coltura cellulare multipla a 6 pozzetti | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Piastra a 6 pozzetti con attacco ultrabasso | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| Soluzione colorante DAPI | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 senza HEPES | Servicebio | Gatto #G4610 | |
| asino Anti-pecora IgG H& L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Siero d'asino stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (senza calcio, magnesio, rosso fenolo) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-IgG anti-coniglio di capra (1:400)IgG anti-coniglio | #E032220 | capra | |
| 549-IgG anti-topo di capra (1:400)IgG anti-coniglio | #E032310 88 | ||
| Dylight 549 - IgG anti-coniglio di capra (1:400) | IgG | ||
| Dylight 649 (1:400)IgG | gatto Earthox | #E032620 | |
| sperimentali: Linee cellulari | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubatore | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Piatti di coltura con fondo in vetro | NEST | Cat #801002 | |
| Capra anti-umana CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Soluzione di eparina (Integratore per colture cellulari) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| FGF-9 ricombinante umano | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Microscopio invertito | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Microscopio confocale a scansione laser | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl Cellulosa | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro centrifuga | HENGNUO | Gatto #2-4B | |
| Topo anti-umano CD31 (1:300) | BD Biosciences | Gatto #555444 | |
| Topo anti-umano ECAD (1:300) | BD Biosciences | Gatto #610182 | |
| Topo anti-umano Integrina beta 1 (1:300) | Abcam | Gatto #ab30394 | |
| Topo anti-umano MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 ( Polivinilalcool 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplemento | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Fiale | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Altri | |||
| Coniglio anti-umano GATA3 (1:300) | Tecnologia di segnalazione cellulare | Gatto #5852S | |
| Coniglio anti-umano LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Coniglio anti-umano Sinaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Coniglio anti-umano WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Coniglio anti-topo PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Albumina sierica umana ricombinante (rHSA) | YEASEN | Gatto #20901ES03 | |
| Pecora anti-umano NPHS1 (1:300) | R& D | Systems Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dicloridrato) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
Riferimenti
- Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
- Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease - a systematic review and meta-analysis. PLOS ONE.
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Ristampe e permessi
