Summary
Denne protokol præsenterer en omfattende og effektiv metode til fremstilling af nyreorganoider fra inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) under anvendelse af suspensionskulturbetingelser. Den primære vægt i denne undersøgelse ligger i bestemmelsen af den indledende celletæthed og WNT-agonistkoncentrationen, hvilket gavner forskere, der er interesseret i nyreorganoidforskning.
Abstract
Nyreorganoider kan genereres fra inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) gennem forskellige tilgange. Disse organoider har et stort løfte om sygdomsmodellering, lægemiddelscreening og potentielle terapeutiske anvendelser. Denne artikel præsenterer en trinvis procedure til oprettelse af nyreorganoider fra iPSC'er, startende fra den bageste primitive stribe (PS) til den mellemliggende mesoderm (IM). Tilgangen er afhængig af APEL 2-mediet, som er et defineret, animalsk komponentfrit medium. Det suppleres med en høj koncentration af WNT-agonist (CHIR99021) i en varighed på 4 dage efterfulgt af fibroblastvækstfaktor 9 (FGF9)/heparin og en lav koncentration af CHIR99021 i yderligere 3 dage. Under denne proces lægges der vægt på at vælge den optimale celletæthed og CHIR99021 koncentration i starten af iPSC'er, da disse faktorer er kritiske for vellykket generering af nyreorganoider. Et vigtigt aspekt af denne protokol er suspensionskulturen i en plade med lav klæbeevne, hvilket gør det muligt for IM gradvist at udvikle sig til nefronstrukturer, der omfatter glomerulære, proksimale rørformede og distale rørformede strukturer, alle præsenteret i et visuelt forståeligt format. Samlet set tilbyder denne detaljerede protokol en effektiv og specifik teknik til fremstilling af nyreorganoider fra forskellige iPSC'er, hvilket sikrer vellykkede og konsistente resultater.
Introduction
Nyren spiller en kritisk rolle i opretholdelsen af fysiologisk homeostase, afhængigt af dens funktionelle enhed. Nefroner, der udskiller affaldsprodukter, kan regulere sammensætningen af kropsvæsker. Kronisk nyresygdom (CKD), forårsaget af arvelige mutationer eller andre højrisikofaktorer, vil i sidste ende udvikle sig til nyresygdom i slutstadiet (ESKD)1,2. ESKD skyldes tilsyneladende nefroners begrænsede regenereringskapacitet. Således kræves nyreerstatningsterapi. Rettet differentiering af humane iPSC'er muliggør in vitro-generering af patientspecifikke 3D-nyreorganoider, som kan bruges til at studere nyreudvikling, modellere patientspecifikke sygdomme og udføre screening af nefrotoksiske lægemidler 3,4.
Under embryonal udvikling stammer nyrerne fra den mellemliggende mesoderm (IM), som adskiller sig fra den primitive stribe (PS). Den klassiske WNT-signalvej kan fremkalde yderligere differentiering af IM med koordineret deltagelse af FGF (FGF9, FGF20) og BMP (Bmp7-signalering gennem JNK)5,6,7. De producerer to vigtige cellepopulationer af nefriske stamceller (NPC): ureteralknoppen (UB) og det metanephriske mesenchym (MM), der danner opsamlingskanalerne og nefronen, henholdsvis 8,9. Hver nephron består af glomerulære og rørformede segmenter, såsom de proksimale og distale tubuli og sløjfen af Henle10,11. Ifølge ovennævnte teori efterligner aktuelt offentliggjorte protokoller signalkaskaderne og vækstfaktorstimuleringen for at inducere nyreorganoider 5,12.
I løbet af de sidste mange år er der udviklet mange protokoller til at differentiere humane iPSC'er til nyreorganoider 5,6,7,12. Takasato et al.7 optimerede varigheden af CHIR (WNT-agonist) behandling før udskiftning med FGF9. Ifølge deres protokol er CHIR-eksponering i 4 dage efterfulgt af FGF9 i 3 dage den mest effektive måde at inducere IM fra iPSC'er på. Transwell-filtre blev brugt som kulturformat i deres procedure; Denne metode er dog vanskelig for begyndere. Derfor forsøgte Kumar et al.13 at ændre kulturformatet og valgte at suspendere kulturen. De dissocierede de klæbende celler på dag 7 til såning i lave klæbende plader for at hjælpe dem med at samle sig i embryoide kroppe (EB'er), der indeholder nefronlignende strukturer. Batcheffekten af disse metoder var imidlertid tydelig, især i forskellige iPSC'er. Derudover rapporterede forskellig litteratur, at koncentrationen af CHIR varierede fra 7 μM til 12 μM 5,13,14.
Vi spekulerede på, at koncentrationen af celletæthed og CHIR kan påvirke dannelsen af organoider i forskellige iPSC'er, og dette er blevet verificeret adskillige gange i vores eksperimenter. Den nuværende protokol har ændret undersøgelsesmetoden for Kumar et al.13 lidt og givet brugerne en trinvis procedure. Tidsplanen og skemaet for fremgangsmåden er vist i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De iPSC'er, der blev anvendt til denne undersøgelse, blev indhentet fra en kommerciel kilde. Cellerne blev vedligeholdt med mTeSR-medium på kommercielt tilgængelige kældermembranmatrixbelagte plader (se materialetabel). Tabel 1 indeholder alle de mediesammensætninger, der er anvendt i undersøgelsen.
1. Plating iPSC'er til differentiering og inducering af posterior primitiv stribe (PS)
- Vask iPSC'er på membranmatrixbelagt 6-brønds plade med 2 ml DPBS. Opsug DPBS ved hjælp af en pipette.
- Der tilsættes 1 ml af den kommercielt tilgængelige celleløsrivelsesopløsning (se materialetabellen) for at løsne iPSC'er og inkubere ved 37 °C i 5 minutter.
- Tilføj 1 ml mTeSR til iPSC'er, og sørg for, at cellerne er løftet af plastoverfladen.
- Centrifuger cellerne ved 400 x g i 3 minutter ved stuetemperatur (RT). Resuspender cellepillen og tæl cellenummeret ved hjælp af et hæmocytometer.
- Frø en række celletætheder på en 24-brønds eller 6-brønds plade belagt med membranmatrix og kultur med mTeSR suppleret med 10 μM Rho-kinasehæmmer (Y-27632) (se materialetabel). Dyrk dem natten over i en 37 °C CO2 inkubator.
BEMÆRK: For at inducere PS varierer den optimale koncentration af CHIR99021 og de passende celletætheder fra forskellige iPSC-linjer. Frø en række tætheder (fx 0,6, 0,9, 1,2, 1,5, 1,8, 2,4 * 103 enkeltceller pr. Kvadratcentimeter) og et koncentrationsområde på CHIR99021 fra 7 μM-12 μM. Start differentieringen af hver densitet og hver CHIR på samme dag. Find den optimale koncentration af CHIR99021 og de passende celletætheder i en 24-brønds plade, og udvid derefter kulturen i 6-brøndplader. Her leverer vi en protokol baseret på en 6-brønds plade. - Næste dag aspireres mTeSR og vaskes cellerne med 2 ml DPBS.
- Der tilsættes 2 ml trin I-medium (stamcelledifferentieringsmedium indeholdende 8-12 μM CHIR99021) (tabel 1), benævnes dag 0.
- Dyrk dem i en 37 ° C inkubator i 4 dage, genopfrisk fase I medium hver anden dag.
2. Inducering af nefrogen mellemliggende mesoderm (IM)
- På dag 4 fjernes trin I-mediet og vaskes med 2 ml DPBS.
- Der tilsættes 2 ml trin II-substrat til cellerne (stamcelledifferentieringsmedium indeholdende 200 ng/ml FGF9, 1 μg/ml heparin og 1 μM CHIR99021) (tabel 1).
- Dyrk dem i en 37 °C inkubator, og opfrisk mediet hver 2. dag indtil dag 7.
3. Generering af nyreorganoider i suspensionskultur
BEMÆRK: I observationsperioden fra dag 0 til dag 7 er cellernes tilstand kritisk. Hvis cellerne udviser vellykket ekspansion og dynger op uden signifikant celleaffald, demonstrerer det den vellykkede afledning af den mellemliggende mesoderm (IM), hvilket indikerer beredskabet til at gå videre til næste trin. Men hvis cellerne viser tegn på indledende apoptose efterfulgt af nekrose eller brud, kan det være tegn på uhensigtsmæssige koncentrationer af CHIR99021 eller celletætheder.
- På dag 7 fjernes trin II-mediet, og cellerne vaskes med 2 ml DPBS.
- Der tilsættes 1 ml celleløsrivelsesopløsning til hvert hul og inkuberes ved 37 °C i 5 minutter, indtil cellerne brydes under fasekontrast.
- Afpipette 1 ml trin II-medium til celler, bland og sørg for, at cellerne er løftet fra overfladen.
- Opsaml cellesuspensionen i et 15 ml glas og centrifuger ved 400 x g i 3 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten fjernes og cellepellet resuspenderes i 2 ml trin III-substrat (stamcelledifferentieringsmedium indeholdende 200 ng/ml FGF9, 1 μg/ml heparin og 1 μM CHIR99021 i 0,1 % methylcellulose (MC), 0,1 % polyvinylalkohol (PVA)) suppleret med 10 μM Rho-kinasehæmmer (Y-27632) (se materialetabel). Bland det forsigtigt.
- Bland cellesuspensionen og frøet i en 6-brønds plade med lav vedhæftning i et forhold på 1: 3. Pladen anbringes på en orbitalryster (CO 2 resistent, roterende ved 60 o / min) i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- 24 timer senere fjernes Rho-kinasehæmmer (Y-27632) og tilsættes trin III-medier (stamcelledifferentieringsmediumtilskud med 200 ng / ml FGF9, 1 μg / ml heparin, 1 μM CHIR99021, 0,1% MC, 0,1% PVA). Kultur i 2 dage. Skift mediet i suspensionskulturen ved at følge nedenstående trin:
- Skær spidsen af 1 ml pipetten af med en saks.
- Ryst forsigtigt 6-brøndpladen for at arrangere organoiderne midt på pladen.
- Opsug organoiderne med de forberedte pipetter i et 15 ml rør og lad dem stå i 5 minutter.
- Opsug supernatanten og lad organoiderne sidde i bunden af røret.
- Tilsæt det friske medium for at resuspendere organoiderne og omplade tilbage til en 6-brønds lavvedhæftningsplade.
- Fortsæt med at ryste lavvedhæftningspladen ved 60 o / min i inkubatoren. Skift trin III-medium hver anden dag indtil dag 12.
- På dag 12 ændres mediet til trin IV-mediet (stamcelledifferentieringsmedium indeholdende 0,1% MC og 0,1% PVA).
- Skift mediet hver anden dag indtil dag 25. Organoiderne kan gradvist udvikle sig til modne nefronstrukturer fra dag 12-25.
4. Immunofluorescensfarvning af nyreorganoider
- Saml nyreorganoider i et 15 ml rør og vask med 2 ml PBS.
- Efter at have ladet det sætte sig i 5-10 minutter, fikseres nyreorganoiderne i frisklavet 2% PFA i 20 minutter ved 4 °C.
- PFA'en fjernes og organoiderne vaskes med 1 ml PBS indeholdende 0,3% Triton X-100 (0,3% PBST), rystes jævnt på en ryster (med en rotationshastighed på højst 60 omdr./min.) i 8 minutter, lad den stå i 5 min., og fjern derefter supernatanten. Gentag tre gange.
BEMÆRK: Organoiderne kan opbevares i 0,3% PBST ved 4 ° C i 2-4 uger. - De faste organoider inkuberes med 10% æselserum i PBST (blokerende buffer) (se materialetabel) natten over ved 4 °C.
- Fortynd de primære antistoffer (angivet i materialetabellen) i en blokerende buffer med et forhold på 1:300.
- Organoiderne inkuberes med primære antistoffer natten over ved 4 °C med omrystning.
BEMÆRK: Sørg for, at glomeruli og tubuli kan farves samtidigt på en organoid. - Organoiderne vaskes med 1 ml 0,3% PBST, rystes jævnt på en ryster (med en rotationshastighed på højst 60 omdr./min.) i 8 min., Lad dem stå i 5 min., og fjern derefter supernatanten. Gentag tre gange.
- Organoiderne inkuberes med sekundære antistoffer (anført i materialetabellen) og DAPI natten over ved 4 °C med omrystning. Gentag derefter trin 4.7.
BEMÆRK: Både sekundært antistof og DAPI fortyndes i blokerende opløsning, sekundært antistof (1:400) og DAPI (1:1000). - Efter farvningen dehydreres organoiderne med methanol (25%, 50%, 75% og 100% i 5 minutter hver), og gennemsyre derefter med benzylalkohol og benzylbenzoat (BABB, forholdet 1: 2) (se materialetabel) i 5 minutter.
- De rensede organoider anbringes på en skål med glasbund (se materialetabellen) og undersøges ved konfokalmikroskopi.
BEMÆRK: Ved billeddannelse skal du vælge petriskålen i bunden af glasskålen, og når du gennemsyrer, skal du lægge BABB direkte i petriskålen for at holde bunden af fadet fugtig.
5. In vitro dextran optagelsesassay
- På dag 25 inkuberes organoiderne med 100 μg/ml fluorescensmærket dextran (se materialetabel) i 4 timer i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2.
- 4 timer senere skal du skifte til et nyt medium og tage levende cellekulturbilleder ved hjælp af et vidvinkelfluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Produktionen af IM opnås ved at aktivere kanonisk WNT-signalering ved hjælp af GSK3-hæmmeren CHIR99021 efterfulgt af FGF9/heparin. Fra dag 0 til dag 4 udvides iPSC'er hurtigt og antager rombeformede eller trekantede former. Sammenløbet når 90% -100% og akkumuleres jævnt indtil dag 7. Ved suspensionskultur danner aggregaterne spontant nefronstrukturer efter dissociering på dag 7. Nyreorganoiderne skabt gennem suspensionskultur viser rørformede strukturer og observeres let i lyse feltbilleder efter 18 dages aggregering (figur 2 og figur 3).
Typisk giver et assay, der starter fra en brønd i en 24-brøndplade af iPSC'er, 200-300 organoider. Blandt disse indeholder 80% -90% nefronlignende strukturer (figur 2). For hiPSC-B1 iPSC-linjen involverer de bedste betingelser for generering af nyreorganoider dyrkning af 1,8-2,0 x 10 4 celler i en brønd i en 24-brøndplade med 8 μM CHIR99021 (figur 2, figur 3 og figur 4). Disse nyreorganoider kan opretholdes i op til 1-2 uger efter dag 25 ved at ændre fase IV-mediet hver 2-3 dage.
Immunofluorescensanalyse af hele organoiderne afslører tilstedeværelsen af nefronsegmenter, herunder NPHS1-, Synaptopodin (SYNAPO-) og WT1-mærkede podocytter, MEIS1/2/3-mærkede interstitielle celler, Lotus Tetragonolobus Lectin (LTL-) mærket proksimale tubuli, E-Cadherin (ECAD-) mærkede distale tubuli og GATA3-mærkede opsamlingskanaler. Desuden inducerer denne protokol endotelceller, der viser positiv farvning med CD31 (figur 5).
Endelig indikerer in vitro dextran optagelsesassays de fysiologisk relevante funktioner af nyreorganoider. Efter inkubation af nyreorganoiderne (dag 7 + 18) med 100 μg/ml fluorescensmærket dextran i 4 timer, observeres dextranen at blive taget ind i de proksimale tubuli i lyse feltbilleder (figur 5L og figur 6).
Figur 1: Den eksperimentelle tidsplan og oversigten over protokollen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Dannelse af nyreorganoider fra dag 0 til dag 7 ved anvendelse af forskellige koncentrationer af CHIR99021. Skalabjælker: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Generering af nyreorganoider fra dag 8 til dag 21 ved anvendelse af forskellige koncentrationer af CHIR99021. Skalabjælker: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Billeder taget på dag 7 af de forskellige celletætheder fra 1,5 x 10 4 til 2,2 x 104 celler / brønd. Skalabjælker: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Repræsentative konfokale immunfluorescensbilleder af nyreorganoider. (A,B) Immunofluorescensanalyse for markører for nefronstamfader (SALL1, blå), prætubulært aggregat (PAX8, magenta), podocyt (NPHS1, blå) af D7+11 nyreorganoider. (C-K) Immunofluorescensanalyse af segmenteret mønster i organoider viser tilstedeværelsen af podocytter (NPHS1, NPHS2, SYNAPO og WT1, rød; MAFB, grøn), proksimal tubuli (LTL, hvid; LRP2, blå; CUBN, rød), distale tubuli (ECAD, grøn), opsamlingskanaler (GATA3, pink), mesangialceller (PDGFR, rød), interstitielle celler (MEIS1/2/3, grøn), Integrin beta 1 (TIGB1, grøn) og endotelceller (CD31, grøn). Skalastænger: 100 μm (A, C, E-J), 50 μm (B) og 10 μm (D, K). L) immunofluorescensanalyse af nyreorganoider efter dextranopdateringsassayet. Skalabjælke: 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: In vitro funktionel validering af dag 25 nyreorganoider. (A-D) Levende billeder af nyreorganoider inkuberet med fluorescensmærket dextran på 10 kDa. Skalastænger: 100 μm (A, B); 10 μm (C,D). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Reagens | Lager conc. | Arbejdskonc. |
Stadie  Medium |
||
| APEL | Nielsen | Nielsen |
| CHIR 99021 | 10 μM | 4-12 μM |
Stadie  Medium |
||
| APEL | Nielsen | Nielsen |
| FGF9 | 100 ng/μL | 200 ng/ml |
| rHSA | 0,2 g/ml | 1 μg/ml |
| Heparin | 2 mg/ml | 1 μg/ml |
| CHIR 99021 | 10 μM | 1 μM |
Stadie  Medium |
||
| APEL | Nielsen | Nielsen |
| FGF9 | 100 ng/μL | 200 ng/ml |
| rHSA | 0,2 g/ml | 1 μg/ml |
| Heparin | 2 mg/ml | 1 μg/ml |
| CHIR 99021 | 10 μM | 1 μM |
| PVA | 1% | 0.10% |
| MC | 1% | 0.10% |
Stadie  Medium |
||
| APEL | Nielsen | Nielsen |
| PVA | 1% | 0.10% |
| MC | 1% | 0.10% |
Tabel 1: De anvendte mediesammensætninger i undersøgelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En detaljeret protokol er blevet beskrevet for generering af nyreorganoider fra iPSC'er, der involverer mindre ændringer i basalmediet, indledende celletæthed og koncentration af CHIR99021. I forskellige eksperimenter viste det sig, at de kritiske faktorer for vellykket generering af nyreorganoider var den indledende differentiering af den mellemliggende mesoderm (IM) og celletilstanden på dag 7. Desuden udviste forskellige iPSC-linjer variationer i celleproliferation og differentieringspotentiale, hvilket resulterede i varierende optimale celletætheder og CHIR99021 koncentrationer 5,13,14. Derfor er det vigtigt at bestemme de ideelle betingelser for hver iPSC-linje for at producere et betydeligt antal nyreorganoider fra patientspecifikke iPSC'er.
For at identificere de optimale forhold anbefales det at udføre foreløbige eksperimenter med 24-brøndplader, inden kulturen opskaleres til 6-brøndplader til større produktion. Dette trin giver forskere mulighed for at vurdere succesen med induktion baseret på cellemorfologi og mængde. Desuden kan organoiderne bevares i deres komplette struktur i 2-4 uger efter fiksering, hvilket forbedrer gennemførligheden og anvendeligheden af denne metode.
De nyreorganoider, der genereres ved hjælp af denne protokol, måler typisk ca. 50-300 μm og udviser rørformede strukturer, når de observeres under lys feltmikroskopi. Immunofluorescerende analyse bekræfter den pålidelige dannelse af nyrenefroner, såsom podocytter mærket med NPHS1 og WT1, proksimale tubuli mærket med LTL, LRP2 og CUBN, distale tubuli mærket med ECAD, opsamlingskanaler mærket med GATA3 og interstitielle celler mærket med MEIS1/2/313. Derudover inducerer denne protokol tilstedeværelsen af endotelceller farvet med CD31, hvilket tyder på potentialet for vaskularisering i nyreorganoiderne.
In vitro dextran optagelsesassays viser fysiologisk relevante funktioner af nyreorganoiderne, såsom foreløbig filtrering og reabsorption. Dette gør dem meget velegnede til sygdomsmodellering og undersøgelse af dysfunktionsmekanismerne. Det er dog vigtigt at bemærke, at modenheden af disse nyreorganoider ligner menneskelige nyrer i første trimester, og de mangler vaskulatur i in vitro-kulturen 13. Yderligere forskning er nødvendig for at belyse de underliggende mekanismer.
Afslutningsvis tilbyder den beskrevne protokol en lovende metode til generering af nyreorganoider fra iPSC'er, hvilket giver mulighed for yderligere forskning og undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterede ingen potentiel interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi er meget taknemmelige for alle Mao og Hu Lab-medlemmer, tidligere og nuværende, for de interessante diskussioner og store bidrag til projektet. Vi takker National Clinical Research Center for Child Health for den store støtte. Denne undersøgelse blev økonomisk støttet af National Natural Science Foundation of China (U20A20351 til Jianhua Mao, 82200784 til Lidan Hu), Natural Science Foundation of Zhejiang-provinsen i Kina (nr. LQ22C070004 til Lidan Hu) og Natural Science Foundation of Jiangsu-provinsen (tilskud nr. BK20210150 til Gang Wang).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #07920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
References
- Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
- Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease - a systematic review and meta-analysis. PLOS ONE. 11 (7), 0158765 (2016).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Morizane, R., Lam, A. Q., Freedman, B. S., Kishi, S., Valerius, M. T., Bonventre, J. V. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6 (1), 8715 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Mugford, J. W., Sipilä, P., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney. Developmental biology. 324 (1), 88-98 (2008).
- SaxOn, L., Sariola, H.
- Kobayashi, A., et al. Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development. Cell Stem Cell. 3 (2), 169-181 (2008).
- Boyle, S., et al. Fate mapping using Cited1-CreERT2 mice demonstrates that the cap mesenchyme contains self-renewing progenitor cells and gives rise exclusively to nephronic epithelia. Developmental Biology. 313 (1), 234-245 (2008).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15 (10), 613-624 (2019).
- Kumar, S. V., et al. Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells. Development. 146 (5), 172361 (2019).
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
