Summary
Ce protocole présente une méthode complète et efficace pour produire des organoïdes rénaux à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) en utilisant des conditions de culture en suspension. L’objectif principal de cette étude réside dans la détermination de la densité cellulaire initiale et de la concentration d’agonistes WNT, ce qui profite aux chercheurs intéressés par la recherche sur les organoïdes rénaux.
Abstract
Les organoïdes rénaux peuvent être générés à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) par diverses approches. Ces organoïdes sont très prometteurs pour la modélisation des maladies, le dépistage des médicaments et les applications thérapeutiques potentielles. Cet article présente une procédure étape par étape pour créer des organoïdes rénaux à partir de cellules iPS, en commençant par la strie primitive postérieure (PS) jusqu’au mésoderme intermédiaire (IM). L’approche s’appuie sur le milieu APEL 2, qui est un milieu défini, sans composant animal. Il est complété par une forte concentration d’agoniste WNT (CHIR99021) pendant une durée de 4 jours, suivie d’un facteur de croissance des fibroblastes 9 (FGF9)/héparine et d’une faible concentration de CHIR99021 pendant 3 jours supplémentaires. Au cours de ce processus, l’accent est mis sur la sélection de la densité cellulaire et de la concentration de CHIR99021 optimales au début des CSPi, car ces facteurs sont essentiels à la réussite de la génération d’organoïdes rénaux. Un aspect important de ce protocole est la culture en suspension dans une plaque peu adhérente, permettant à l’IM de se développer progressivement en structures néphroniques, englobant des structures tubulaires glomérulaires, tubulaires proximales et distales, le tout présenté dans un format visuellement compréhensible. Dans l’ensemble, ce protocole détaillé offre une technique efficace et spécifique pour produire des organoïdes rénaux à partir de diverses cellules iPS, garantissant des résultats réussis et cohérents.
Introduction
Le rein joue un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie physiologique, en fonction de son unité fonctionnelle. Les néphrons, qui excrètent les déchets, peuvent réguler la composition des fluides corporels. L’insuffisance rénale chronique (IRC), causée par des mutations héréditaires ou d’autres facteurs de risque élevés, évoluera éventuellement vers une insuffisance rénale terminale (ESKD)1,2. L’ESKD est apparemment due à la capacité de régénération limitée des néphrons. Ainsi, un traitement de remplacement rénal est nécessaire. La différenciation dirigée des cellules iPS humaines permet la génération in vitro d’organoïdes rénaux 3D spécifiques au patient, qui peuvent être utilisés pour étudier le développement des reins, modéliser des maladies spécifiques au patient et effectuer un criblage de médicaments néphrotoxiques 3,4.
Au cours du développement embryonnaire, les reins proviennent du mésoderme intermédiaire (IM), qui se différencie de la strie primitive (PS). La voie de signalisation WNT classique peut induire une différenciation supplémentaire de l’IM avec la participation coordonnée de FGF (FGF9, FGF20) et BMP (signalisation Bmp7 via JNK)5,6,7. Ils produisent deux populations cellulaires importantes de cellules progénitrices néphriques (NPC) : le bourgeon urétéral (UB) et le mésenchyme métanéphrique (MM), formant respectivement les canaux collecteurs et le néphron. Chaque néphron est constitué de segments glomérulaires et tubulaires, tels que les tubules proximaux et distals, et l’anse de Henle10,11. Selon la théorie mentionnée ci-dessus, les protocoles actuellement publiés imitent les cascades de signaux et la stimulation du facteur de croissance pour induire des organoïdes rénaux 5,12.
Au cours des dernières années, de nombreux protocoles ont été mis au point pour différencier les cellules iPS humaines en organoïdes rénaux 5,6,7,12. Takasato et al.7 ont optimisé la durée du traitement par CHIR (agoniste WNT) avant son remplacement par FGF9. Selon leur protocole, l’exposition au CHIR pendant 4 jours, suivie du FGF9 pendant 3 jours, est le moyen le plus efficace d’induire la MI à partir des cellules iPS. Les filtres Transwell ont été utilisés comme format de culture dans leur procédure ; Cependant, cette méthode est difficile pour les débutants. Par conséquent, Kumar et al.13 ont essayé de changer le format de la culture et ont choisi de suspendre la culture. Ils ont dissocié les cellules adhérentes au jour 7 pour les ensemencer dans des plaques peu adhérentes afin de les aider à s’assembler en corps embryoïdes (EB) contenant des structures ressemblant à des néphrons. Cependant, l’effet batch de ces méthodes était évident, en particulier dans différentes cellules iPS. De plus, différentes publications ont rapporté que la concentration de CHIR variait de 7 μM à 12 μM 5,13,14.
Nous avons émis l’hypothèse que la concentration de la densité cellulaire et du CHIR pourrait affecter la génération d’organoïdes dans différentes cellules iPS, ce qui a été vérifié à de nombreuses reprises dans nos expériences. Le présent protocole a légèrement modifié la méthode d’étude de Kumar et al.13 et a fourni aux utilisateurs une procédure étape par étape. L’échéancier et le schéma de l’approche sont présentés à la figure 1.
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Protocol
Les cellules iPS utilisées dans le cadre de la présente étude ont été obtenues auprès d’une source commerciale. Les cellules ont été maintenues avec du milieu mTeSR sur des plaques revêtues d’une matrice de membrane basale disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux). Le tableau 1 contient toutes les compositions de milieux utilisées dans l’étude.
1. Placage des cellules iPS pour la différenciation et l’induction d’une strie primitive postérieure (PS)
- Laver les cellules iPS sur la plaque à 6 puits revêtue d’une matrice membranaire avec 2 mL de DPBS. Aspirez le DPBS à l’aide d’une pipette.
- Ajouter 1 mL de la solution de décollement cellulaire disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) pour détacher les cellules iPS et incuber à 37 °C pendant 5 min.
- Ajouter 1 mL de mTeSR aux cellules iPS et s’assurer que les cellules se sont soulevées de la surface en plastique.
- Centrifuger les cellules à 400 x g pendant 3 min à température ambiante (RT). Remettez la pastille de cellules en suspension et comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Ensemencer une gamme de densités cellulaires sur une plaque de 24 ou 6 puits recouverte d’une matrice membranaire et cultiver avec mTeSR complété par un inhibiteur de la kinase Rho de 10 μM (Y-27632) (voir le tableau des matériaux). Cultivez-les pendant une nuit dans un incubateur de CO2 à 37 °C.
REMARQUE : Pour induire la PS, la concentration optimale de CHIR99021 et les densités cellulaires appropriées varient d’une lignée à l’autre de la CSPi. Ensemencer une gamme de densités (p. ex., 0,6, 0,9, 1,2, 1,5, 1,8, 2,4 * 103 cellules individuelles par centimètre carré) et une plage de concentration de CHIR99021 de 7 μM à 12 μM. Initier la différenciation de chaque densité et de chaque CHIR le même jour. Trouvez la concentration optimale de CHIR99021 et les densités cellulaires appropriées dans une plaque à 24 puits, puis étendez la culture dans des plaques à 6 puits. Nous fournissons ici un protocole basé sur une plaque à 6 puits. - Le lendemain, aspirez le mTeSR et lavez les cellules avec 2 mL de DPBS.
- Ajouter 2 mL de milieu de stade I (milieu de différenciation de cellules souches contenant de 8 à 12 μM CHIR99021) (tableau 1), voir jour 0.
- Cultivez-les dans un incubateur à 37 °C pendant 4 jours, rafraîchissez le milieu de stade I tous les deux jours.
2. Induire un mésoderme intermédiaire néphrogénique (IM)
- Le jour 4, retirez le milieu de stade I et lavez avec 2 ml de DPBS.
- Ajouter 2 mL de milieu de stade II aux cellules (milieu de différenciation des cellules souches contenant 200 ng/mL de FGF9, 1 μg/mL d’héparine et 1 μM CHIR99021) (tableau 1).
- Cultivez-les dans un incubateur à 37 °C et rafraîchissez le milieu tous les 2 jours jusqu’au jour 7.
3. Génération d’organoïdes rénaux en culture en suspension
REMARQUE : Pendant la période d’observation du jour 0 au jour 7, l’état des cellules est critique. Si les cellules présentent une expansion réussie et s’accumulent sans débris cellulaires significatifs, cela démontre la dérivation réussie du mésoderme intermédiaire (IM), indiquant la volonté de passer à l’étape suivante. Cependant, si les cellules montrent des signes d’apoptose initiale, suivis d’une nécrose ou d’une rupture, cela peut indiquer des concentrations inappropriées de CHIR99021 ou de densités cellulaires.
- Le jour 7, retirez le milieu de stade II et lavez les cellules avec 2 mL de DPBS.
- Ajouter 1 mL de la solution de décollement cellulaire dans chaque puits et incuber à 37 °C pendant 5 min jusqu’à ce que les cellules soient réfractives sous contraste de phase.
- Pipeter 1 mL de milieu de stade II sur les cellules, mélanger et s’assurer que les cellules se sont décollées de la surface.
- Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL et centrifuger à 400 x g pendant 3 min à température ambiante.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 2 mL de milieu de stade III (milieu de différenciation des cellules souches contenant 200 ng/mL de FGF9, 1 μg/mL d’héparine et 1 μM CHIR99021 dans 0,1 % de méthylcellulose (MC), 0,1 % d’alcool polyvinylique (PVA)) complété par un inhibiteur de la kinase Rho 10 μM (Y-27632) (voir le tableau des matériaux). Mélangez délicatement.
- Mélangez la suspension cellulaire et la graine dans une plaque à 6 puits à faible adhérence dans un rapport de 1 :3. Placer la plaque sur un agitateur orbital (résistant au CO 2, tournant à 60 tr/min) dans un incubateur à 37 °C et 5% de CO2.
- 24 h plus tard, retirer l’inhibiteur de la kinase Rho (Y-27632) et ajouter un milieu de stade III (supplément de milieu de différenciation des cellules souches avec 200 ng/mL de FGF9, 1 μg/mL d’héparine, 1 μM CHIR99021, 0,1 % de MC, 0,1 % de PVA). Culture pendant 2 jours. Modifiez le milieu dans la culture de suspension en suivant les étapes ci-dessous :
- Coupez l’embout de la pipette de 1 mL à l’aide de ciseaux aseptiques.
- Secouez doucement la plaque à 6 puits pour disposer les organoïdes au milieu de la plaque.
- Aspirer les organoïdes avec les pipettes préparées dans un tube de 15 ml et les laisser reposer pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant et laisser les organoïdes au fond du tube.
- Ajouter le milieu frais pour remettre les organoïdes en suspension et replaquer dans une plaque à 6 puits à faible adhérence.
- Continuez à agiter la plaque à faible adhérence à 60 tr/min dans l’incubateur. Changez le milieu de stade III tous les deux jours jusqu’au jour 12.
- Le jour 12, changer le milieu pour un milieu de stade IV (milieu de différenciation des cellules souches contenant 0,1 % de MC et 0,1 % de PVA).
- Changez le support tous les deux jours jusqu’au jour 25. Les organoïdes peuvent progressivement se développer en structures néphroniques matures du jour 12 au jour 25.
4. Coloration par immunofluorescence d’organoïdes rénaux
- Recueillir les organoïdes rénaux dans un tube de 15 ml et laver avec 2 ml de PBS.
- Après avoir laissé reposer pendant 5 à 10 minutes, fixez les organoïdes rénaux dans du PFA à 2 % fraîchement préparé pendant 20 minutes à 4 °C.
- Retirez le PFA et lavez les organoïdes avec 1 mL de PBS contenant 0,3 % de Triton X-100 (0,3 % de PBST), agitez-le uniformément sur un agitateur (avec une vitesse de rotation ne dépassant pas 60 tr/min) pendant 8 min, laissez-le reposer pendant 5 min, puis retirez le surnageant. Répétez trois fois.
REMARQUE : Les organoïdes peuvent être conservés dans du PBST à 0,3 % à 4 °C pendant 2 à 4 semaines. - Incuber les organoïdes fixés avec 10 % de sérum d’ânesse dans du PBST (tampon de blocage) (voir tableau des matériaux) pendant une nuit à 4 °C.
- Diluer les anticorps primaires (énumérés dans le tableau des matériaux) dans un tampon bloquant avec un rapport de 1 :300.
- Incuber les organoïdes avec les anticorps primaires pendant une nuit à 4 °C avec agitation.
REMARQUE : Assurez-vous que les glomérules et les tubules peuvent être colorés simultanément sur un organoïde. - Lavez les organoïdes avec 1 mL de PBST à 0,3 %, agitez-les uniformément sur un shaker (avec une vitesse de rotation ne dépassant pas 60 tr/min) pendant 8 min, laissez-les reposer pendant 5 min, puis retirez le surnageant. Répétez trois fois.
- Incuber les organoïdes avec des anticorps secondaires (énumérés dans le tableau des matériaux) et du DAPI pendant une nuit à 4 °C avec agitation. Répétez ensuite l’étape 4.7.
REMARQUE : L’anticorps secondaire et le DAPI sont dilués dans une solution bloquante, un anticorps secondaire (1 :400) et un DAPI (1 :1000). - Après la coloration, déshydrater les organoïdes avec du méthanol (25 %, 50 %, 75 % et 100 % pendant 5 min chacun), puis imprégner d’alcool benzylique et de benzoate de benzyle (BABB, rapport 1 :2) (voir tableau des matériaux) pendant 5 min.
- Moudre les organoïdes dégagés sur une boîte à fond de verre (voir le tableau des matériaux) et les examiner par microscopie confocale.
REMARQUE : Lors de l’imagerie, choisissez la boîte de Pétri au fond de la boîte en verre et, lors de la perméation, placez le BABB directement dans la boîte de Pétri pour garder le fond de la boîte humide.
5. Dosage in vitro de l’absorption du dextran
- Le jour 25, incuber les organoïdes avec 100 μg/mL de dextran marqué par fluorescence (voir tableau des matériaux) pendant 4 h dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
- 4 heures plus tard, passez à un milieu neuf et capturez des images de culture de cellules vivantes à l’aide d’un microscope à fluorescence à grand champ.
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Representative Results
La production d’IM est obtenue en activant la signalisation WNT canonique à l’aide de l’inhibiteur GSK3 CHIR99021, suivi de FGF9/héparine. Du jour 0 au jour 4, les cellules iPS se dilatent rapidement et prennent des formes rhomboïdales ou triangulaires. La confluence atteint 90%-100% et s’accumule uniformément jusqu’au jour 7. Lors de la culture en suspension, les agrégats forment spontanément des structures néphroniques après s’être dissociés le jour 7. Les organoïdes rénaux créés par culture en suspension présentent des structures de type tubulaire et sont facilement observables sur les images en fond clair après 18 jours d’agrégation (Figure 2 et Figure 3).
En règle générale, un essai à partir d’un puits d’une plaque de 24 puits de cellules iPS donne 200 à 300 organoïdes. Parmi ceux-ci, 80 à 90 % contiennent des structures ressemblant à des néphrons (Figure 2). Pour la lignée hiPSC-B1 iPSC, les meilleures conditions pour générer des organoïdes rénaux consistent à cultiver 1,8-2,0 x 10 4 cellules d’un puits d’une plaque de 24 puits avec une CHIR99021 de 8 μM (Figure 2, Figure 3 et Figure 4). Ces organoïdes rénaux peuvent être maintenus jusqu’à 1 à 2 semaines après le jour 25 en changeant le milieu de stade IV tous les 2 à 3 jours.
L’analyse par immunofluorescence de l’ensemble des organoïdes révèle la présence de segments de néphrons, y compris des podocytes marqués NPHS1-, Synaptopodine (SYNAPO-) et WT1, des cellules interstitielles marquées MEIS1/2/3, des tubules proximaux marqués à la lectine de Lotus Tetragonolobus (LTL-), des tubules distaux marqués à l’E-Cadhérine (ECAD) et des canaux collecteurs marqués GATA3. De plus, ce protocole induit des cellules endothéliales qui présentent une coloration positive avec CD31 (Figure 5).
Enfin, les tests d’absorption du dextran in vitro indiquent les fonctions physiologiquement pertinentes des organoïdes rénaux. Après l’incubation des organoïdes rénaux (jours 7 + 18) avec 100 μg/mL de dextran marqué par fluorescence pendant 4 h, on observe que le dextran est absorbé dans les tubules proximaux sur des images en fond clair (Figure 5L et Figure 6).
Figure 1 : Le calendrier expérimental et la vue d’ensemble du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Génération d’organoïdes rénaux du jour 0 au jour 7 en utilisant différentes concentrations de CHIR99021. Barres d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Génération d’organoïdes rénaux du jour 8 au jour 21 en utilisant différentes concentrations de CHIR99021. Barres d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Images capturées au jour 7 des différentes densités cellulaires de 1,5 x 10 4 à 2,2 x 104 cellules/puits. Barres d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Images représentatives d’immunofluorescence confocale d’organoïdes rénaux. (A,B) Analyse par immunofluorescence des marqueurs du progéniteur du néphron (SALL1, bleu), de l’agrégat prétubulaire (PAX8, magenta), du podocyte (NPHS1, bleu) des organoïdes rénaux D7+11. (C-K) L’analyse par immunofluorescence de la structuration segmentée dans les organoïdes montre la présence de podocytes (NPHS1, NPHS2, SYNAPO et WT1, en rouge ; MAFB, vert), tubules proximaux (LTL, blanc ; LRP2, bleu ; CUBN, rouge), les tubules distaux (ECAD, vert), les canaux collecteurs (GATA3, rose), les cellules mésangiales (PDGFR, rouge), les cellules interstitielles (MEIS1/2/3, vert), l’intégrine bêta 1 (TIGB1, vert) et les cellules endothéliales (CD31, vert). Barres d’échelle : 100 μm (A,C,E-J), 50 μm (B) et 10 μm (D,K). (L) analyse par immunofluorescence d’organoïdes rénaux après l’essai de mise à jour du dextran. Barre d’échelle : 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Validation fonctionnelle in vitro d’organoïdes rénaux du jour 25. (A-D) Images en direct d’organoïdes rénaux incubés avec du dextran marqué par fluorescence de 10 kDa. Barres d’échelle : 100 μm (A,B) ; 10 μm (C,D). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Réactif | Stock conc. | Conc. de travail |
Étape  Douleur moyenne |
||
| L’APEL | n/a | n/a |
| CHIR 99021 | 10 μM | 4 à 12 μM |
Étape  Douleur moyenne |
||
| L’APEL | n/a | n/a |
| FGF9 (en anglais seulement) | 100 ng/μL | 200 ng/mL |
| rHSA (en anglais seulement) | 0,2 g/mL | 1 μg/mL |
| Héparine | 2 mg/mL | 1 μg/mL |
| CHIR 99021 | 10 μM | 1 μM |
Étape  Douleur moyenne |
||
| L’APEL | n/a | n/a |
| FGF9 (en anglais seulement) | 100 ng/μL | 200 ng/mL |
| rHSA (en anglais seulement) | 0,2 g/mL | 1 μg/mL |
| Héparine | 2 mg/mL | 1 μg/mL |
| CHIR 99021 | 10 μM | 1 μM |
| PVA | 1% | 0.10% |
| MC | 1% | 0.10% |
Étape  Douleur moyenne |
||
| L’APEL | n/a | n/a |
| PVA | 1% | 0.10% |
| MC | 1% | 0.10% |
Tableau 1 : Compositions de milieux utilisées dans l’étude.
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Discussion
Un protocole détaillé a été décrit pour générer des organoïdes rénaux à partir de CSPi, impliquant des modifications mineures du milieu basal, de la densité cellulaire initiale et de la concentration de CHIR99021. Dans diverses expériences, les facteurs critiques pour une génération réussie d’organoïdes rénaux se sont avérés être la différenciation initiale du mésoderme intermédiaire (IM) et l’état cellulaire au jour 7. De plus, différentes lignées de CSPi présentaient des variations dans le potentiel de prolifération et de différenciation cellulaires, ce qui entraînait des densités cellulaires optimales et des concentrations de CHIR99021variables 5,13,14. Par conséquent, il est essentiel de déterminer les conditions idéales pour chaque lignée de cellules iPS afin de produire un nombre substantiel d’organoïdes rénaux à partir de cellules iPS spécifiques au patient.
Pour identifier les conditions optimales, il est recommandé de mener des expériences préliminaires à l’aide de plaques de 24 puits avant de passer à la culture à des plaques de 6 puits pour une production à plus grande échelle. Cette étape permet aux chercheurs d’évaluer le succès de l’induction en fonction de la morphologie et de la quantité des cellules. De plus, les organoïdes peuvent être conservés dans leur structure complète pendant 2 à 4 semaines après la fixation, ce qui améliore la faisabilité et l’utilité de cette méthode.
Les organoïdes rénaux générés à l’aide de ce protocole mesurent généralement environ 50 à 300 μm et présentent des structures tubulaires lorsqu’ils sont observés en microscopie à fond clair. L’analyse immunofluorescente confirme la formation fiable de néphrons rénaux, tels que les podocytes marqués NPHS1 et WT1, les tubules proximaux marqués avec LTL, LRP2 et CUBN, les tubules distaux marqués avec ECAD, les canaux collecteurs marqués avec GATA3 et les cellules interstitielles marquées avec MEIS1/2/313. De plus, ce protocole induit la présence de cellules endothéliales colorées au CD31, suggérant un potentiel de vascularisation au sein des organoïdes rénaux.
Les essais d’absorption du dextran in vitro démontrent des fonctions physiologiquement pertinentes des organoïdes rénaux, telles que la filtration préliminaire et la réabsorption. Cela les rend très adaptés à la modélisation des maladies et à l’étude des mécanismes de dysfonctionnement. Cependant, il est important de noter que la maturité de ces organoïdes rénaux ressemble à celle des reins humains du premier trimestre et qu’ils n’ont pas de vascularisation dans la culture in vitro 13. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour élucider les mécanismes sous-jacents.
En conclusion, le protocole décrit offre une méthode prometteuse pour générer des organoïdes rénaux à partir de cellules iPS, offrant une voie pour d’autres recherches et études.
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Disclosures
Les auteurs n’ont signalé aucun conflit d’intérêts potentiel.
Acknowledgments
Nous sommes extrêmement reconnaissants à tous les membres du Mao et du Hu Lab, passés et présents, pour les discussions intéressantes et les grandes contributions au projet. Nous remercions le Centre national de recherche clinique pour la santé de l’enfant pour son grand soutien. Cette étude a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (U20A20351 à Jianhua Mao, 82200784 à Lidan Hu), la Fondation des sciences naturelles de la province chinoise du Zhejiang (No. LQ22C070004 à Lidan Hu) et la Fondation des sciences naturelles de la province du Jiangsu (subventions n° BK20210150 à Gang Wang).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #07920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
References
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