Summary
Dieses Protokoll stellt eine umfassende und effiziente Methode zur Herstellung von Nierenorganoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unter Verwendung von Suspensionskulturbedingungen dar. Das Hauptaugenmerk dieser Studie liegt auf der Bestimmung der anfänglichen Zelldichte und der WNT-Agonistenkonzentration, was Forschern, die sich für die Erforschung von Nierenorganoiden interessieren, zugute kommt.
Abstract
Nierenorganoide können aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) durch verschiedene Ansätze erzeugt werden. Diese Organoide sind vielversprechend für die Modellierung von Krankheiten, das Screening von Medikamenten und potenzielle therapeutische Anwendungen. In diesem Artikel wird ein Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Herstellung von Nierenorganoiden aus iPS-Zellen vorgestellt, beginnend mit dem posterioren primitiven Streifen (PS) bis zum intermediären Mesoderm (IM). Der Ansatz stützt sich auf das Medium APEL 2, bei dem es sich um ein definiertes, tierbaustofffreies Medium handelt. Es wird mit einer hohen Konzentration von WNT-Agonisten (CHIR99021) für eine Dauer von 4 Tagen ergänzt, gefolgt von Fibroblasten-Wachstumsfaktor 9 (FGF9)/Heparin und einer niedrigen Konzentration von CHIR99021 für weitere 3 Tage. Während dieses Prozesses wird der Schwerpunkt auf die Auswahl der optimalen Zelldichte und CHIR99021 Konzentration zu Beginn von iPS-Zellen gelegt, da diese Faktoren für die erfolgreiche Generierung von Nierenorganoiden entscheidend sind. Ein wichtiger Aspekt dieses Protokolls ist die Suspensionskultur in einer niedrig adhärenten Platte, die es dem IM ermöglicht, sich allmählich zu Nephronstrukturen zu entwickeln, die glomeruläre, proximale tubuläre und distale tubuläre Strukturen umfassen, die alle in einem visuell verständlichen Format präsentiert werden. Insgesamt bietet dieses detaillierte Protokoll eine effiziente und spezifische Technik zur Herstellung von Nierenorganoiden aus verschiedenen iPS-Systemen, um erfolgreiche und konsistente Ergebnisse zu gewährleisten.
Introduction
Die Niere spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der physiologischen Homöostase, abhängig von ihrer funktionellen Einheit. Nephrone, die Abfallprodukte ausscheiden, können die Zusammensetzung der Körperflüssigkeiten regulieren. Eine chronische Nierenerkrankung (CKD), die durch erbliche Mutationen oder andere Hochrisikofaktoren verursacht wird, entwickelt sich schließlich zu einer Niereninsuffizienz im Endstadium (ESKD)1,2. ESKD ist offenbar auf die eingeschränkte Regenerationsfähigkeit von Nephronen zurückzuführen. Daher ist eine Nierenersatztherapie erforderlich. Die gerichtete Differenzierung humaner iPS-Zellen ermöglicht die In-vitro-Generierung patientenspezifischer 3D-Nierenorganoide, die zur Untersuchung der Nierenentwicklung, zur Modellierung patientenspezifischer Erkrankungen und zur Durchführung eines nephrotoxischen Wirkstoffscreenings verwendet werden können 3,4.
Während der Embryonalentwicklung entstehen die Nieren aus dem intermediären Mesoderm (IM), das sich vom primitiven Streifen (PS) unterscheidet. Der klassische WNT-Signalweg kann eine zusätzliche Differenzierung von IM unter koordinierter Beteiligung von FGF (FGF9, FGF20) und BMP (Bmp7-Signalweg durch JNK) induzieren5,6,7. Sie produzieren zwei wichtige Zellpopulationen von nephrischen Vorläuferzellen (NPC): die Harnleiterknospe (UB) und das metanephrische Mesenchym (MM), die die Sammelkanäle bzw. das Nephron bilden 8,9. Jedes Nephron besteht aus glomerulären und tubulären Segmenten, wie den proximalen und distalen Tubuli, und der Henle-Schleife10,11. Nach der oben genannten Theorie ahmen die derzeit veröffentlichten Protokolle die Signalkaskaden und die Stimulation des Wachstumsfaktors nach, um Nierenorganoide zu induzieren 5,12.
In den letzten Jahren wurden viele Protokolle entwickelt, um humane iPS-Zellen in Nierenorganoide zu differenzieren 5,6,7,12. Takasato et al.7 optimierten die Dauer der CHIR-Behandlung (WNT-Agonist) vor dem Ersatz durch FGF9. Gemäß ihrem Protokoll ist eine CHIR-Exposition für 4 Tage, gefolgt von FGF9 für 3 Tage, der effektivste Weg, um IM von iPS-Zellen zu induzieren. Transwell-Filter wurden als Kulturformat in ihrem Verfahren verwendet; Für Anfänger ist diese Methode jedoch schwierig. Daher versuchten Kumar et al.13, das Kulturformat zu ändern und entschieden sich, die Kultur auszusetzen. Sie dissoziierten die adhärenten Zellen an Tag 7 für die Aussaat in niedrig adhärenten Platten, um ihnen zu helfen, sich zu Embryoidkörpern (EBs) zusammenzusetzen, die nephronähnliche Strukturen enthalten. Der Batch-Effekt dieser Methoden war jedoch offensichtlich, insbesondere in verschiedenen iPS-Systemen. Darüber hinaus wurde in der Literatur berichtet, dass die Konzentration von CHIR zwischen 7 μM und 12 μM variierte 5,13,14.
Wir spekulierten, dass die Konzentration der Zelldichte und der CHIR die Bildung von Organoiden in verschiedenen iPS-Zellen beeinflussen könnte, und dies wurde in unseren Experimenten mehrfach bestätigt. Das vorliegende Protokoll hat die Studienmethode von Kumar et al.13 leicht modifiziert und den Anwendern ein Schritt-für-Schritt-Verfahren an die Hand gegeben. Der Zeitplan und das Schema des Ansatzes sind in Abbildung 1 dargestellt.
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Protocol
Die für die vorliegende Studie verwendeten iPS-Zellen wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen. Die Zellen wurden mit mTeSR-Medium auf kommerziell erhältlichen, mit Basalmembranmatrix beschichteten Platten gepflegt (siehe Materialtabelle). Tabelle 1 enthält alle in der Studie verwendeten Medienzusammensetzungen.
1. Beschichtung von iPS-Zellen zur Differenzierung und Induktion eines posterioren primitiven Streifens (PS)
- Waschen Sie iPS-Zellen auf der membranmatrixbeschichteten 6-Well-Platte mit 2 ml DPBS. Saugen Sie das DPBS mit einer Pipette an.
- 1 ml der handelsüblichen Zellablösungslösung (siehe Materialtabelle) zugeben, um iPS-Zellen abzulösen, und 5 Minuten lang bei 37 °C inkubieren.
- Geben Sie 1 ml mTeSR zu iPS-Zellen und stellen Sie sicher, dass sich die Zellen von der Kunststoffoberfläche abgehoben haben.
- Die Zellen werden bei 400 x g für 3 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert. Resuspendieren Sie das Zellpellet und zählen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer.
- Säen Sie eine Reihe von Zelldichten auf eine 24-Well- oder 6-Well-Platte, die mit einer Membranmatrix beschichtet ist, und kultivieren Sie sie mit mTeSR, ergänzt mit 10 μM Rho-Kinase-Inhibitor (Y-27632) (siehe Materialtabelle). Kultivieren Sie sie über Nacht in einem 37 °CCO 2 - Inkubator.
HINWEIS: Um PS zu induzieren, variieren die optimale Konzentration von CHIR99021 und die geeigneten Zelldichten von verschiedenen iPSC-Linien. Säen Sie einen Bereich von Dichten (z. B. 0,6, 0,9, 1,2, 1,5, 1,8, 2,4 * 103 Einzelzellen pro Quadratzentimeter) und einen Konzentrationsbereich von CHIR99021 von 7 μM-12 μM. Initiieren Sie die Differenzierung jeder Dichte und jedes CHIR am selben Tag. Finden Sie die optimale Konzentration von CHIR99021 und die geeigneten Zelldichten in einer 24-Well-Platte und erweitern Sie dann die Kultur in 6-Well-Platten. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, das auf einer 6-Well-Platte basiert. - Am nächsten Tag saugen Sie das mTeSR ab und waschen Sie die Zellen mit 2 ml DPBS.
- 2 ml Medium der Stufe I (Stammzelldifferenzierungsmedium mit 8-12 μM CHIR99021) zugeben (Tabelle 1), wird als Tag 0 bezeichnet.
- 4 Tage lang in einem 37 °C warmen Inkubator kultivieren, Stufe I alle zwei Tage auffrischen.
2. Induktion des nephrogenen intermediären Mesoderms (IM)
- Entfernen Sie am 4. Tag das Medium der Stufe I und waschen Sie es mit 2 ml DPBS.
- Geben Sie 2 ml Medium der Stufe II zu den Zellen (Stammzelldifferenzierungsmedium mit 200 ng/ml FGF9, 1 μg/ml Heparin und 1 μM CHIR99021) (Tabelle 1).
- Kultivieren Sie sie in einem 37 °C warmen Inkubator und frischen Sie das Medium alle 2 Tage bis zum 7. Tag auf.
3. Generierung von Nierenorganoiden in Suspensionskultur
HINWEIS: Während des Beobachtungszeitraums von Tag 0 bis Tag 7 ist der Zustand der Zellen kritisch. Wenn die Zellen eine erfolgreiche Expansion aufweisen und sich ohne nennenswerte Zelltrümmer anhäufen, zeigt dies die erfolgreiche Ableitung des intermediären Mesoderms (IM), was auf die Bereitschaft hinweist, zur nächsten Stufe überzugehen. Wenn die Zellen jedoch Anzeichen einer anfänglichen Apoptose zeigen, gefolgt von Nekrose oder Bruch, kann dies auf unangemessene Konzentrationen von CHIR99021 oder Zelldichten hinweisen.
- Entfernen Sie am 7. Tag das Medium der Stufe II und waschen Sie die Zellen mit 2 ml DPBS.
- Geben Sie 1 ml der Zellablösungslösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie bei 37 °C für 5 Minuten, bis die Zellen unter Phasenkontrast refraktiv sind.
- Pipettieren Sie 1 ml des Mediums der Stufe II in die Zellen, mischen Sie sie und stellen Sie sicher, dass sich die Zellen von der Oberfläche abgehoben haben.
- Die Zellsuspension wird in einem 15-ml-Röhrchen aufgefangen und bei 400 x g für 3 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 2 ml Medium der Stufe III (Stammzelldifferenzierungsmedium mit 200 ng/ml FGF9, 1 μg/ml Heparin und 1 μM CHIR99021 in 0,1 % Methylcellulose (MC), 0,1 % Polyvinylalkohol (PVA)), ergänzt mit 10 μM Rho-Kinase-Inhibitor (Y-27632) (siehe Materialtabelle). Mischen Sie es vorsichtig.
- Mischen Sie die Zellsuspension und das Saatgut im Verhältnis 1:3 in eine 6-Well-Platte mit geringer Adhäsion. Die Platte wird auf einen Orbitalschüttler (CO 2 -beständig, rotierend mit 60 U/min) in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 gestellt.
- 24 Stunden später entfernen Sie den Rho-Kinase-Inhibitor (Y-27632) und fügen Sie Medien der Stufe III hinzu (Stammzelldifferenzierungsmedium mit 200 ng/ml FGF9, 1 μg/ml Heparin, 1 μM CHIR99021, 0,1 % MC, 0,1 % PVA). Kultur für 2 Tage. Ändern Sie das Medium in der Aussetzungskultur, indem Sie die folgenden Schritte ausführen:
- Schneiden Sie die Spitze der 1-ml-Pipette mit einer aseptischen Schere ab.
- Schütteln Sie vorsichtig die 6-Well-Platte, um die Organoide in der Mitte der Platte anzuordnen.
- Die Organoide mit den vorbereiteten Pipetten in ein 15-ml-Röhrchen absaugen und 5 min stehen lassen.
- Saugen Sie den Überstand an und lassen Sie die Organoide am Boden des Röhrchens.
- Fügen Sie das frische Medium hinzu, um die Organoide zu resuspendieren, und geben Sie es wieder in eine 6-Well-Platte mit geringer Adhäsion.
- Schütteln Sie die Platte mit geringer Haftung weiter bei 60 U/min im Inkubator. Wechseln Sie das Medium der Stufe III alle zwei Tage bis zum 12. Tag.
- Wechseln Sie am 12. Tag das Medium in ein Medium der Stufe IV (Stammzelldifferenzierungsmedium mit 0,1 % MC und 0,1 % PVA).
- Wechseln Sie das Medium alle zwei Tage bis zum 25. Tag. Die Organoide können sich vom 12. bis 25. Tag allmählich zu reifen Nephronstrukturen entwickeln.
4. Immunfluoreszenzfärbung von Nierenorganoiden
- Nierenorganoide in einem 15-ml-Röhrchen sammeln und mit 2 ml PBS waschen.
- Nachdem Sie es 5-10 Minuten einwirken lassen, fixieren Sie die Nierenorganoide in frisch zubereitetem 2%igem PFA für 20 Minuten bei 4 °C.
- Entfernen Sie das PFA und waschen Sie die Organoide mit 1 ml PBS mit 0,3 % Triton X-100 (0,3 % PBST), schütteln Sie es 8 Minuten lang gleichmäßig auf einem Schüttler (mit einer Drehzahl von nicht mehr als 60 U/min), lassen Sie es 5 Minuten stehen und entfernen Sie dann den Überstand. Wiederholen Sie dies dreimal.
HINWEIS: Die Organoide können in 0,3% PBST bei 4° C für 2-4 Wochen gelagert werden. - Die fixierten Organoide werden mit 10% Eselsserum in PBST (Blockierungspuffer) (siehe Materialtabelle) über Nacht bei 4 °C inkubiert.
- Verdünnen Sie die primären Antikörper (aufgeführt in der Materialtabelle) in einem Blockierungspuffer im Verhältnis 1:300.
- Inkubieren Sie die Organoide mit Primärantikörpern über Nacht bei 4 °C unter Rühren.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Glomeruli und Tubuli gleichzeitig auf einem Organoid gefärbt werden können. - Waschen Sie die Organoide mit 1 ml 0,3% PBST, schütteln Sie sie gleichmäßig auf einem Schüttler (mit einer Drehzahl von nicht mehr als 60 U/min) für 8 Minuten, lassen Sie sie 5 Minuten stehen und entfernen Sie dann den Überstand. Wiederholen Sie dies dreimal.
- Inkubieren Sie die Organoide mit Sekundärantikörpern (aufgeführt in der Materialtabelle) und DAPI über Nacht bei 4 °C unter Rühren. Wiederholen Sie dann Schritt 4.7.
HINWEIS: Sowohl der Sekundärantikörper als auch der DAPI werden in Blockierungslösung, Sekundärantikörper (1:400) und DAPI (1:1000) verdünnt. - Nach der Färbung werden die Organoide mit Methanol (25 %, 50 %, 75 % und 100 %) für jeweils 5 min dehydriert, dann 5 min lang mit Benzylalkohol und Benzylbenzoat (BABB, Verhältnis 1:2) permeat (siehe Materialtabelle).
- Mouten Sie die geklärten Organoide auf einer Glasbodenschale (siehe Materialtabelle) und untersuchen Sie sie mittels konfokaler Mikroskopie.
HINWEIS: Wählen Sie bei der Bildgebung die Petrischale am Boden der Glasschale und legen Sie das BABB beim Durchdringen direkt in die Petrischale, um den Boden der Schale feucht zu halten.
5. In-vitro-Dextran-Aufnahme-Assay
- An Tag 25 werden die Organoide mit 100 μg/ml fluoreszenzmarkiertem Dextran (siehe Materialtabelle) für 4 h in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
- Wechseln Sie 4 Stunden später zu einem frischen Medium und nehmen Sie lebende Zellkulturbilder mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop auf.
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Representative Results
Die Produktion von IM wird durch die Aktivierung des kanonischen WNT-Signalwegs mit dem GSK3-Inhibitor CHIR99021, gefolgt von FGF9/Heparin, erreicht. Von Tag 0 bis Tag 4 dehnen sich iPS-Zellen schnell aus und nehmen rautenförmige oder dreieckige Formen an. Die Konfluenz erreicht 90%-100% und akkumuliert sich gleichmäßig bis zum 7. Tag. Nach der Suspensionskultur bilden die Aggregate spontan Nephronstrukturen, nachdem sie am 7. Tag dissoziiert wurden. Die durch Suspensionskultur erzeugten Nierenorganoide weisen röhrenförmige Strukturen auf und sind nach 18 Tagen Aggregation in Hellfeldbildern leicht zu beobachten (Abbildung 2 und Abbildung 3).
In der Regel liefert ein Assay, der von einer 24-Well-Platte mit iPS-Zellen ausgeht, 200-300 Organoide. Davon enthalten 80%-90% nephronartige Strukturen (Abbildung 2). Für die hiPSC-B1 iPSC-Linie sind die besten Bedingungen für die Erzeugung von Nierenorganoiden die Kultivierung von 1,8-2,0 x 10 4 Zellen einer Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 8 μM CHIR99021 (Abbildung 2, Abbildung 3 und Abbildung 4). Diese Nierenorganoide können bis zu 1-2 Wochen über den 25. Tag hinaus aufrechterhalten werden, indem das Medium der Stufe IV alle 2-3 Tage gewechselt wird.
Die Immunfluoreszenzanalyse der gesamten Organoide zeigt das Vorhandensein von Nephronsegmenten, einschließlich NPHS1-, Synaptopodin (SYNAPO-) und WT1-markierter Podozyten, MEIS1/2/3-markierter interstitieller Zellen, Lotus Tetragonolobus Lectin (LTL-) markierter proximaler Tubuli, E-Cadherin (ECAD-) markierter distaler Tubuli und GATA3-markierter Sammelrohre. Darüber hinaus induziert dieses Protokoll Endothelzellen, die eine positive Färbung mit CD31 aufweisen (Abbildung 5).
Schließlich weisen in vitro Dextran-Aufnahmeassays auf die physiologisch relevanten Funktionen von Nierenorganoiden hin. Nach Inkubation der Nierenorganoide (Tag 7 + 18) mit 100 μg/ml fluoreszenzmarkiertem Dextran für 4 h wird beobachtet, dass das Dextran in Hellfeldbildern in die proximalen Tubuli aufgenommen wird (Abbildung 5L und Abbildung 6).
Abbildung 1: Der Versuchsplan und die Übersicht über das Protokoll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Generierung von Nierenorganoiden von Tag 0 bis Tag 7 unter Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen von CHIR99021. Maßstabsleisten: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Generierung von Nierenorganoiden von Tag 8 bis Tag 21 unter Verwendung verschiedener Konzentrationen von CHIR99021. Maßstabsleisten: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: An Tag 7 aufgenommene Bilder der verschiedenen Zelldichten von 1,5 x 10 4 bis 2,2 x 104 Zellen/Well. Maßstabsleisten: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Repräsentative konfokale Immunfluoreszenzbilder von Nierenorganoiden. (A,B) Immunfluoreszenzanalyse für Marker des Nephron-Vorläufers (SALL1, blau), des prätubulären Aggregats (PAX8, magenta), des Podozyten (NPHS1, blau) von D7+11-Nierenorganoiden. (C-K) Die Immunfluoreszenzanalyse von segmentierten Mustern in Organoiden zeigt das Vorhandensein von Podozyten (NPHS1, NPHS2, SYNAPO und WT1, rot; MAFB, grün), proximale Tubuli (LTL, weiß; LRP2, blau; CUBN, rot), distale Tubuli (ECAD, grün), Sammelkanäle (GATA3, rosa), mesangiale Zellen (PDGFR, rot), interstitielle Zellen (MEIS1/2/3, grün), Integrin beta 1 (TIGB1, grün) und Endothelzellen (CD31, grün). Maßstabsleisten: 100 μm (A,C,E-J), 50 μm (B) und 10 μm (D,K). (L) Immunfluoreszenzanalyse von Nierenorganoiden nach dem Dextran-Update-Assay. Maßstab: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: In-vitro-Funktionsvalidierung von Tag-25-Nierenorganoiden. (A-D) Live-Bilder von Nierenorganoiden, die mit fluoreszenzmarkiertem Dextran von 10 kDa inkubiert wurden. Maßstabsleisten: 100 μm (A,B); 10 μm (C,D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Reagenz | Lagerkonz. | Arbeitskonz. |
Bühne  Mittel |
||
| APEL | n/a | n/a |
| CHIR 99021 | 10 μM | 4-12 μM |
Bühne  Mittel |
||
| APEL | n/a | n/a |
| FGF9-KARTON | 100 ng/μl | 200 ng/ml |
| rHSA | 0,2 g/ml | 1 μg/ml |
| Heparin | 2 mg/ml | 1 μg/ml |
| CHIR 99021 | 10 μM | 1 μM |
Bühne  Mittel |
||
| APEL | n/a | n/a |
| FGF9-KARTON | 100 ng/μl | 200 ng/ml |
| rHSA | 0,2 g/ml | 1 μg/ml |
| Heparin | 2 mg/ml | 1 μg/ml |
| CHIR 99021 | 10 μM | 1 μM |
| PVA | 1% | 0.10% |
| MC | 1% | 0.10% |
Bühne  Mittel |
||
| APEL | n/a | n/a |
| PVA | 1% | 0.10% |
| MC | 1% | 0.10% |
Tabelle 1: Die in der Studie verwendeten Medienzusammensetzungen.
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Discussion
Es wurde ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung von Nierenorganoiden aus iPS-Zellen beschrieben, das geringfügige Modifikationen des Basalmediums, der anfänglichen Zelldichte und der Konzentration von CHIR99021 beinhaltet. In verschiedenen Experimenten wurde festgestellt, dass die entscheidenden Faktoren für eine erfolgreiche Generierung von Nierenorganoiden die anfängliche Differenzierung des intermediären Mesoderms (IM) und der Zellzustand an Tag 7 sind. Darüber hinaus zeigten verschiedene iPSC-Linien Variationen im Zellproliferations- und Differenzierungspotenzial, was zu unterschiedlichen optimalen Zelldichten und CHIR99021 Konzentrationen führte 5,13,14. Folglich ist es wichtig, die idealen Bedingungen für jede iPSC-Linie zu bestimmen, um eine beträchtliche Anzahl von Nierenorganoiden aus patientenspezifischen iPS-Zellen herzustellen.
Um die optimalen Bedingungen zu identifizieren, wird empfohlen, Vorversuche mit 24-Well-Platten durchzuführen, bevor die Kultur für eine Produktion in größerem Maßstab auf 6-Well-Platten hochskaliert wird. Dieser Schritt ermöglicht es den Forschern, den Erfolg der Induktion anhand der Zellmorphologie und -menge zu beurteilen. Darüber hinaus können die Organoide nach der Fixierung 2-4 Wochen lang in ihrer vollständigen Struktur erhalten bleiben, was die Machbarkeit und den Nutzen dieser Methode erhöht.
Die mit diesem Protokoll erzeugten Nierenorganoide messen typischerweise etwa 50-300 μm und weisen röhrenförmige Strukturen auf, wenn sie unter Hellfeldmikroskopie beobachtet werden. Die Immunfluoreszenzanalyse bestätigt die zuverlässige Bildung von Nierennephronen, wie z. B. Podozyten, die mit NPHS1 und WT1 markiert sind, proximale Tubuli, die mit LTL, LRP2 und CUBN markiert sind, distale Tubuli, die mit ECAD markiert sind, Sammelrohre, die mit GATA3 markiert sind, und interstitielle Zellen, die mit MEIS1/2/3 markiert sind13. Darüber hinaus induziert dieses Protokoll das Vorhandensein von Endothelzellen, die mit CD31 gefärbt sind, was auf das Potenzial für eine Vaskularisierung innerhalb der Nierenorganoide hindeutet.
In-vitro-Dextran-Aufnahmeassays zeigen physiologisch relevante Funktionen der Nierenorganoide, wie z.B. Vorfiltration und Resorption. Dadurch eignen sie sich sehr gut für die Modellierung von Krankheiten und die Untersuchung der Mechanismen von Funktionsstörungen. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Reife dieser Nierenorganoide der menschlichen Nieren im ersten Trimester ähnelt und ihnen in der In-vitro-Kultur ein Gefäßsystem fehlt13. Weitere Forschung ist notwendig, um die zugrundeliegenden Mechanismen aufzuklären.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das beschriebene Protokoll eine vielversprechende Methode zur Erzeugung von Nierenorganoiden aus iPS-Zellen darstellt und einen Weg für weitere Forschung und Studien bietet.
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Disclosures
Die Autoren berichteten über keinen potenziellen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Wir sind allen ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern des Mao und Hu Lab sehr dankbar für die interessanten Diskussionen und die großartigen Beiträge zum Projekt. Wir danken dem National Clinical Research Center for Child Health für die großartige Unterstützung. Diese Studie wurde finanziell unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (U20A20351 an Jianhua Mao, 82200784 an Lidan Hu), der Natural Science Foundation der chinesischen Provinz Zhejiang (No. LQ22C070004 an Lidan Hu) und der Naturwissenschaftlichen Stiftung der Provinz Jiangsu (Stipendien-Nr. BK20210150 zu Gang Wang).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #07920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
References
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