Summary
פרוטוקול זה מציג שיטה מקיפה ויעילה לייצור אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) באמצעות תנאי תרבית תרחיף. הדגש העיקרי של מחקר זה טמון בקביעת צפיפות התאים הראשונית וריכוז האגוניסט WNT, ובכך לטובת חוקרים המעוניינים במחקר אורגנואידים בכליות.
Abstract
אורגנואידים בכליות יכולים להיווצר מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) באמצעות גישות שונות. אורגנואידים אלה טומנים בחובם הבטחה גדולה למידול מחלות, סינון תרופות ויישומים טיפוליים פוטנציאליים. מאמר זה מציג הליך שלב אחר שלב ליצירת אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), החל מהפס הפרימיטיבי האחורי (PS) ועד למזודרם הביניים (IM). הגישה מסתמכת על מדיום APEL 2, שהוא מדיום מוגדר ונטול רכיבים מן החי. הוא מתווסף עם ריכוז גבוה של אגוניסט WNT (CHIR99021) למשך 4 ימים, ואחריו גורם גדילה פיברובלסט 9 (FGF9)/הפרין וריכוז נמוך של CHIR99021 למשך 3 ימים נוספים. בתהליך זה, ניתן דגש לבחירת צפיפות התאים האופטימלית וריכוז CHIR99021 בתחילת תאי גזע פלוריפוטנטיים מוגנים, שכן גורמים אלה קריטיים לייצור מוצלח של אורגנואידים בכליות. היבט חשוב של פרוטוקול זה הוא תרבית ההשעיה בלוח הדבקה נמוך, המאפשר ל- IM להתפתח בהדרגה למבני נפרון, הכוללים מבנים צינוריים גלומרולריים, פרוקסימליים ודיסטליים, כולם מוצגים בפורמט מובן חזותית. בסך הכל, פרוטוקול מפורט זה מציע טכניקה יעילה וספציפית לייצור אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מגוונים, ומבטיח תוצאות מוצלחות ועקביות.
Introduction
לכליה תפקיד קריטי בשמירה על הומאוסטזיס פיזיולוגי, בהתאם ליחידה התפקודית שלה. נפרונים, המפרישים מוצרי פסולת, יכולים לווסת את הרכב נוזלי הגוף. מחלת כליות כרונית (CKD), הנגרמת על ידי מוטציות תורשתיות או גורמי סיכון גבוהים אחרים, תתקדם בסופו של דבר למחלת כליות סופנית (ESKD)1,2. ESKD נובע ככל הנראה מיכולת ההתחדשות המוגבלת של נפרונים. לפיכך, נדרש טיפול בתחליפי כליות. התמיינות מכוונת של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים מאפשרת יצירה חוץ גופית של אורגנואידים תלת-ממדיים ספציפיים למטופל, אשר יכולים לשמש לחקר התפתחות כליות, מודל מחלות ספציפיות למטופל וביצוע בדיקות סקר של תרופות נפרוטוקסיות 3,4.
במהלך ההתפתחות העוברית, הכליות מקורן במזודרם הביניים (IM), המבדיל מהפס הפרימיטיבי (PS). מסלול האיתות הקלאסי של WNT עשוי לגרום לבידול נוסף של IM עם השתתפות מתואמת של FGF (FGF9, FGF20) ו- BMP (איתות Bmp7 באמצעות JNK)5,6,7. הם מייצרים שתי אוכלוסיות תאים חשובות של תאי אב נפריים (NPC): ניצן השופכה (UB), והמזנכימה המטנפרית (MM), ויוצרים את צינורות האיסוף ואת הנפרון, בהתאמה 8,9. כל נפרון מורכב מקטעים גלומרולריים וצינוריים, כגון הצינוריות הפרוקסימליות והדיסטליות, והלולאה של הנלה10,11. על פי התיאוריה שהוזכרה לעיל, הפרוטוקולים המפורסמים כיום מחקים את מפל האותות ואת גירוי גורם הגדילה כדי לגרום לאורגנואידים בכליות 5,12.
במהלך השנים האחרונות, פרוטוקולים רבים פותחו כדי להבדיל iPSCs אנושיים לתוך אורגנואידים בכליות 5,6,7,12. Takasato et al.7 ייעל את משך הטיפול ב- CHIR (אגוניסט WNT) לפני החלפתו ב- FGF9. על פי הפרוטוקול שלהם, חשיפה ל- CHIR במשך 4 ימים, ואחריה FGF9 למשך 3 ימים, היא הדרך היעילה ביותר לגרום ל- IM מ- iPSCs. מסנני Transwell שימשו כפורמט התרבות בהליך שלהם; עם זאת, שיטה זו קשה למתחילים. לכן, קומאר ואחרים ניסו לשנות את פורמט התרבות ובחרו להשעות את התרבות. הם ניתקו את התאים הדבקים ביום השביעי לזריעה בלוחות דבקים נמוכים כדי לעזור להם להתאסף לגוף עוברי (EBs) המכילים מבנים דמויי נפרון. עם זאת, אפקט האצווה של שיטות אלה היה ברור, במיוחד iPSCs שונים. בנוסף, ספרות שונה דיווחה כי ריכוז CHIR נע בין 7 מיקרומטר ל 12 מיקרומטר 5,13,14.
שיערנו כי ריכוז צפיפות התאים וה-CHIR עשויים להשפיע על ייצור אורגנואידים בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שונים, וזה אומת פעמים רבות בניסויים שלנו. הפרוטוקול הנוכחי שינה מעט את שיטת המחקר של Kumar et al.13 וסיפק למשתמשים הליך שלב אחר שלב. לוח הזמנים והסכמה של הגישה מוצגים באיור 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ה-iPSCs ששימשו למחקר הנוכחי התקבלו ממקור מסחרי. התאים נשמרו עם תווך mTeSR על לוחות ממברנות מרתף מצופים מטריצה זמינים מסחרית (ראה טבלת חומרים). טבלה 1 מכילה את כל ההרכבים הבינוניים ששימשו במחקר.
1. ציפוי iPSCs להתמיינות והשראת פס פרימיטיבי אחורי (PS)
- שטפו iPSCs על צלחת 6 בארות מצופות מטריצת ממברנה עם DPBS של 2 מ"ל. שאפו את ה-DPBS באמצעות פיפטה.
- הוסף 1 מ"ל של תמיסת ניתוק התאים הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) כדי לנתק תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ולדגור ב-37°C למשך 5 דקות.
- הוסף 1 מ"ל של mTeSR לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים וודא שהתאים התרוממו משטח הפלסטיק.
- צנטריפוגה את התאים ב 400 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר (RT). השהה מחדש את גלולת התא וספור את מספר התא באמצעות המוציטומטר.
- זרעו מגוון של צפיפויות תאים על צלחת של 24 או 6 בארות המצופה במטריצת ממברנה ותרבית עם mTeSR בתוספת מעכב Rho קינאז 10 מיקרומטר (Y-27632) (ראו טבלת חומרים). תרבית אותם לילה באינקובטור CO2 של 37 מעלות צלזיוס.
הערה: כדי לגרום ל-PS, הריכוז האופטימלי של CHIR99021 וצפיפויות התאים המתאימות משתנים מקווי iPSC שונים. זרעו טווח של צפיפויות (למשל, 0.6, 0.9, 1.2, 1.5, 1.8, 2.4*103 תאים בודדים לסנטימטר מרובע) וטווח ריכוז של CHIR99021 בין 7 מיקרומטר ל-12 מיקרומטר. התחילו את ההתמיינות של כל צפיפות וכל CHIR באותו יום. מצא את הריכוז האופטימלי של CHIR99021 ואת צפיפות התאים המתאימה בצלחת של 24 בארות ולאחר מכן הרחב את התרבית בצלחות של 6 בארות. כאן אנו מספקים פרוטוקול המבוסס על צלחת 6 בארות. - למחרת, לשאוף את mTeSR ולשטוף את התאים עם 2 מ"ל של DPBS.
- הוסף 2 מ"ל של מדיום שלב I (מדיום התמיינות תאי גזע המכיל 8-12 מיקרומטר CHIR99021) (טבלה 1), המכונה יום 0.
- תרבית אותם באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס במשך 4 ימים, רענון שלב I בינוני כל יומיים.
2. השראת מזודרם ביניים נפרוגנית (IM)
- ביום 4, להסיר את שלב I בינוני ולשטוף עם 2 מ"ל של DPBS.
- הוסף 2 מ"ל של תווך שלב II לתאים (מדיום התמיינות תאי גזע המכיל 200 ננוגרם/מ"ל FGF9, 1 מיקרוגרם/מ"ל הפרין ו-1 מיקרומטר CHIR99021) (טבלה 1).
- תרביתו אותם באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, ורעננו את המדיום כל יומיים עד יום 7.
3. יצירת אורגנואידים בכליות בתרבות ההשעיה
הערה: במהלך תקופת התצפית מיום 0 עד יום 7, מצב התאים הוא קריטי. אם התאים מפגינים התרחבות מוצלחת ונערמים ללא פסולת תאים משמעותית, זה מדגים את הנגזרת המוצלחת של מזודרם הביניים (IM), מה שמצביע על הנכונות להמשיך לשלב הבא. עם זאת, אם התאים מראים סימנים של אפופטוזיס ראשוני, ואחריו נמק או שבירה, זה עשוי להצביע על ריכוזים לא מתאימים של CHIR99021 או צפיפות תאים.
- ביום 7, להסיר את שלב II בינוני ולשטוף את התאים עם 2 מ"ל של DPBS.
- הוסף 1 מ"ל של תמיסת ניתוק התא לכל באר ודגר ב 37 ° C במשך 5 דקות עד תאים נשברים תחת ניגודיות פאזה.
- פיפטה 1 מ"ל של שלב II בינוני לתאים, מערבבים, ומוודאים שהתאים התרוממו מפני השטח.
- אסוף את מתלה התא בצינור 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר את הסופרנאטנט והשהה מחדש את כדורית התא ב-2 מ"ל של מדיום שלב III (מדיום התמיינות תאי גזע המכיל 200 ננוגרם/מ"ל FGF9, 1 מיקרוגרם/מ"ל הפרין ו-1 מיקרומטר CHIR99021 ב-0.1% מתילצלולוז (MC), 0.1% פוליוויניל אלכוהול (PVA)) בתוספת מעכב Rho קינאז 10 מיקרומטר (Y-27632) (ראה טבלת חומרים). מערבבים בעדינות.
- מערבבים את תרחיף התא והזרעים לצלחת בעלת 6 בארות בהידבקות נמוכה ביחס של 1:3. הניחו את הצלחת על שייקר אורביטלי (עמיד בפני CO 2, מסתובב ב-60 סל"ד) באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
- 24 שעות לאחר מכן, יש להסיר את מעכב Rho קינאז (Y-27632) ולהוסיף מדיה שלב III (תוסף בינוני להתמיינות תאי גזע עם FGF9 של 200 ננוגרם/מ"ל, הפרין 1 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מיקרומטר CHIR99021, 0.1% MC, 0.1% PVA). תרבות במשך יומיים. שנה את המדיום בתרבות המתלים על-ידי ביצוע השלבים הבאים:
- חותכים את קצה פיפטה 1 מ"ל עם מספריים אספטיים.
- נערו בעדינות את הצלחת בעלת 6 הבארות כדי לסדר את האורגנואידים במרכז הצלחת.
- שואפים את האורגנואידים עם פיפטות מוכן לתוך צינור 15 מ"ל ולאפשר להם לעמוד במשך 5 דקות.
- שאפו את הסופרנאטנט והשאירו את האורגנואידים בתחתית הצינור.
- מוסיפים את המדיום הטרי כדי להשהות מחדש את האורגנואידים ומחזירים לצלחת בעלת 6 בארות עם הדבקה נמוכה.
- ממשיכים לנער את צלחת ההדבקה הנמוכה ב-60 סל"ד באינקובטור. שנה את מדיום שלב III כל יומיים עד ליום ה -12.
- ביום ה-12, יש לשנות את המדיום לשלב IV (מדיום התמיינות תאי גזע המכיל 0.1% MC ו-0.1% PVA).
- החליפו את המדיום כל יומיים עד היום ה-25. האורגנואידים יכולים להתפתח בהדרגה למבני נפרון בוגרים מהיום ה-12-25.
4. מכתים immunofluorescence של אורגנואידים בכליות
- לאסוף אורגנואידים בכליות לתוך צינור 15 מ"ל ולשטוף עם 2 מ"ל PBS.
- לאחר שתאפשרו לו להתייצב למשך 5-10 דקות, תקנו את אורגנואידי הכליה ב-2% PFA טרי למשך 20 דקות ב-4°C.
- הסר את ה- PFA ושטוף את האורגנואידים עם PBS 1 מ"ל המכיל 0.3% Triton X-100 (0.3% PBST), נער אותו באופן שווה על שייקר (עם מהירות סיבוב שאינה עולה על 60 סל"ד) במשך 8 דקות, אפשר לו לעמוד במשך 5 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant. חזור על הפעולה שלוש פעמים.
הערה: ניתן לאחסן את האורגנואידים ב-0.3% PBST ב-4°C למשך 2-4 שבועות. - יש לדגור על האורגנואידים הקבועים עם 10% נסיוב חמורים ב-PBST (חיץ חוסם) (ראו טבלת חומרים) למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
- לדלל את הנוגדנים הראשוניים (המפורטים בטבלת החומרים) במאגר חוסם ביחס של 1:300.
- לדגור את האורגנואידים עם נוגדנים ראשוניים לילה ב 4 °C עם תסיסה.
הערה: ודא שניתן להכתים גלומרולי וצינוריות בו זמנית על אורגנואיד אחד. - לשטוף את האורגנואידים עם 1 מ"ל 0.3% PBST, לנער אותו באופן שווה על שייקר (עם מהירות סיבוב לא יעלה על 60 סל"ד) במשך 8 דקות, לאפשר לו לעמוד במשך 5 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant. חזור על הפעולה שלוש פעמים.
- לדגור על האורגנואידים עם נוגדנים משניים (המפורטים בטבלת החומרים) ו- DAPI למשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס עם תסיסה. לאחר מכן חזור על שלב 4.7.
הערה: הן נוגדן משני והן DAPI מדוללים בתמיסת חסימה, נוגדן משני (1:400) ו- DAPI (1:1000). - לאחר הצביעה, יש לייבש את האורגנואידים במתנול (25%, 50%, 75% ו-100% למשך 5 דקות כל אחד), ולאחר מכן לחדור עם בנזיל אלכוהול ובנזיל בנזואט (BABB, יחס של 1:2) (ראו טבלת חומרים) למשך 5 דקות.
- הניחו את האורגנואידים המפונים על צלחת בעלת תחתית זכוכית (ראו טבלת חומרים) ובחנו אותם במיקרוסקופ קונפוקלי.
הערה: בעת ההדמיה, בחרו את צלחת הפטרי בתחתית צלחת הזכוכית, ובעת החלחול, הניחו את ה-BABB ישירות בצלחת הפטרי כדי לשמור על תחתית המנה לחה.
5. בדיקת ספיגת דקסטרן במבחנה
- ביום ה-25, יש לדגור על האורגנואידים עם 100 מיקרוגרם/מ"ל של דקסטרן עם תווית פלואורסצנטית (ראו טבלת חומרים) במשך 4 שעות באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
- 4 שעות לאחר מכן, עבור למדיום חדש וצלם תמונות של תרביות תאים חיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפקת IM מושגת על ידי הפעלת איתות WNT קנוני באמצעות מעכב GSK3 CHIR99021, ואחריו FGF9/הפרין. מיום 0 עד יום 4, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מתרחבים במהירות ומקבלים צורות רומבואידיות או משולשות. המפגש מגיע ל-90%-100% ומצטבר באופן שווה עד היום השביעי. בתרבית ההשעיה, הצברים יוצרים באופן ספונטני מבני נפרון לאחר התנתקות ביום 7. אורגנואידי הכליה שנוצרו באמצעות תרבית תרחיף מציגים מבנים דמויי צינוריות, וניתן לצפות בהם בקלות בתמונות שדה בהיר לאחר 18 יום של צבירה (איור 2 ואיור 3).
בדרך כלל, בדיקה אחת המתחילה מבאר של צלחת בת 24 בארות של iPSCs מניבה 200-300 אורגנואידים. מבין אלה, 80%-90% מכילים מבנים דמויי נפרון (איור 2). עבור קו hiPSC-B1 iPSC, התנאים הטובים ביותר ליצירת אורגנואידים בכליות כוללים תרבית של 1.8-2.0 x 104 תאים של באר של צלחת של 24 בארות עם 8 מיקרומטר CHIR99021 (איור 2, איור 3 ואיור 4). אורגנואידים אלה בכליות יכולים להישמר עד 1-2 שבועות מעבר ליום 25 על ידי שינוי שלב IV בינוני כל 2-3 ימים.
ניתוח אימונופלואורסנציה של כל האורגנואידים מגלה את נוכחותם של מקטעי נפרון, כולל NPHS1-, Synaptopodin (SYNAPO-) ופודוציטים המסומנים ב-WT1, תאים אינטרסטיציאליים המסומנים ב-MEIS1/2/3, לוטוס טטרגונולובוס לקטין (LTL-) המסומנים כצינוריות פרוקסימליות, E-Cadherin (ECAD-) מסומנים כצינוריות דיסטליות, ותעלות איסוף המסומנות ב-GATA3. יתר על כן, פרוטוקול זה גורם לתאי אנדותל שמראים צביעה חיובית עם CD31 (איור 5).
לבסוף, מבחני ספיגת דקסטרן במבחנה מצביעים על התפקודים הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית של אורגנואידים בכליות. לאחר דגירה של אורגנואידים בכליות (יום 7+18) עם 100 מיקרוגרם/מ"ל של דקסטרן עם תווית פלואורסצנטית במשך 4 שעות, דקסטרן נצפה נלקח לתוך הצינוריות הפרוקסימליות בתמונות שדה בהיר (איור 5L ואיור 6).
איור 1: לוח הזמנים של הניסוי והסקירה הכללית של הפרוטוקול. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: יצירת אורגנואידים בכליות מיום 0 ליום 7 באמצעות ריכוזים שונים של CHIR99021. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: יצירת אורגנואידים בכליות מהיום ה-8 ליום ה-21 באמצעות ריכוזים שונים של CHIR99021. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונות שצולמו ביום 7 של צפיפויות תאים שונות מ-1.5 x 104 עד 2.2 x 104 תאים/באר. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תמונות אימונופלואורסצנטיות קונפוקליות מייצגות של אורגנואידים בכליות. (A,B) ניתוח אימונופלואורסצנטי לסמנים של אב נפרון (SALL1, כחול), צבר קדם-צינורי (PAX8, מגנטה), פודוציטים (NPHS1, כחול) של אורגנואידים בכליות D7+11. (ג-ק) ניתוח אימונופלואורסנציה של תבניות מקוטעות באורגנואידים מראה נוכחות של פודוציטים (NPHS1, NPHS2, SYNAPO ו- WT1, אדום; MAFB, ירוק), צינוריות פרוקסימליות (LTL, לבן; LRP2, כחול; CUBN, אדום), צינוריות דיסטליות (ECAD, ירוק), צינורות איסוף (GATA3, ורוד), תאים מזנגיאליים (PDGFR, אדום), תאים אינטרסטיציאליים (MEIS1/2/3, ירוק), אינטגרין בטא 1 (TIGB1, ירוק) ותאי אנדותל (CD31, ירוק). פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר (A,C,E-J), 50 מיקרומטר (B) ו-10 מיקרומטר (D,K). (L) ניתוח immunofluorescence של אורגנואידים בכליות לאחר בדיקת עדכון דקסטרן. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: אימות תפקודי במבחנה של אורגנואידים בכליות ביום 25. (א-ד) תמונות חיות של אורגנואידים בכליות מודגרים עם דקסטרן עם תווית פלואורסצנטית של 10 kDa. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר (A,B); 10 מיקרומטר (C,D). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| מגיב | מניית קונק. | עבודה conc. |
במה  בינוני |
||
| אייפל | לא ישים | לא ישים |
| CHIR 99021 | 10 מיקרומטר | 4-12 מיקרומטר |
במה  בינוני |
||
| אייפל | לא ישים | לא ישים |
| FGF9 | 100 נ"ג/מיקרוליטר | 200 ננוגרם/מ"ל |
| rHSA | 0.2 גרם/מ"ל | 1 מיקרוגרם/מ"ל |
| הפארין | 2 מ"ג/מ"ל | 1 מיקרוגרם/מ"ל |
| CHIR 99021 | 10 מיקרומטר | 1 מיקרומטר |
במה  בינוני |
||
| אייפל | לא ישים | לא ישים |
| FGF9 | 100 נ"ג/מיקרוליטר | 200 ננוגרם/מ"ל |
| rHSA | 0.2 גרם/מ"ל | 1 מיקרוגרם/מ"ל |
| הפארין | 2 מ"ג/מ"ל | 1 מיקרוגרם/מ"ל |
| CHIR 99021 | 10 מיקרומטר | 1 מיקרומטר |
| PVA | 1% | 0.10% |
| מ.ק. | 1% | 0.10% |
במה  בינוני |
||
| אייפל | לא ישים | לא ישים |
| PVA | 1% | 0.10% |
| מ.ק. | 1% | 0.10% |
טבלה 1: ההרכבים הבינוניים ששימשו במחקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול מפורט תואר ליצירת אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), הכולל שינויים קלים בתווך הבסיסי, צפיפות התאים הראשונית וריכוז CHIR99021. בניסויים שונים, הגורמים הקריטיים ליצירת אורגנואידים מוצלחים בכליות נמצאו כהתמיינות הראשונית של מזודרם הביניים (IM) ומצב התא ביום 7. יתר על כן, קווי iPSC שונים הציגו שינויים בפוטנציאל התרבות והתמיינות תאים, וכתוצאה מכך צפיפות תאים אופטימלית משתנה וריכוזי CHIR99021 5,13,14. כתוצאה מכך, קביעת התנאים האידיאליים עבור כל קו iPSC חיונית לייצור מספר משמעותי של אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ספציפיים למטופל.
כדי לזהות את התנאים האופטימליים, מומלץ לבצע ניסויים ראשוניים באמצעות לוחות 24 בארות לפני הגדלת התרבות לצלחות 6 בארות לייצור בקנה מידה גדול יותר. שלב זה מאפשר לחוקרים להעריך את הצלחת האינדוקציה בהתבסס על מורפולוגיה של התא וכמותו. יתר על כן, ניתן לשמר את האורגנואידים במבנה המלא שלהם במשך 2-4 שבועות לאחר הקיבוע, מה שמשפר את ההיתכנות והתועלת של שיטה זו.
אורגנואידי הכליה הנוצרים באמצעות פרוטוקול זה מודדים בדרך כלל כ 50-300 מיקרומטר ומציגים מבנים דמויי צינורית כאשר הם נצפים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. ניתוח אימונופלואורסצנטי מאשר היווצרות אמינה של נפרון כליות, כגון פודוציטים המסומנים ב- NPHS1 ו- WT1, צינוריות פרוקסימליות המסומנות ב- LTL, LRP2 ו- CUBN, צינוריות דיסטליות המסומנות ב- ECAD, צינורות איסוף המסומנים ב- GATA3 ותאים אינטרסטיציאליים המסומנים ב- MEIS1/2/313. בנוסף, פרוטוקול זה גורם לנוכחות של תאי אנדותל מוכתמים ב- CD31, מה שמרמז על הפוטנציאל לכלי דם בתוך אורגנואידים בכליות.
בדיקות ספיגה של דקסטרן במבחנה מדגימות תפקודים פיזיולוגיים רלוונטיים של אורגנואידי הכליה, כגון סינון ראשוני וספיגה מחדש. זה הופך אותם למתאימים מאוד למידול מחלות ולימוד מנגנוני התפקוד הלקוי. עם זאת, חשוב לציין כי הבשלות של אורגנואידים אלה בכליות דומה לכליות אנושיות בשליש הראשון, והם חסרים כלי דם בתרבית חוץ גופית13. יש צורך במחקר נוסף כדי להבהיר את המנגנונים העומדים בבסיסם.
לסיכום, הפרוטוקול המתואר מציע שיטה מבטיחה לייצור אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), ומספק אפיק למחקר ומחקר נוספים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא דיווחו על ניגוד עניינים פוטנציאלי.
Acknowledgments
אנו אסירי תודה לכל חברי מאו והו לאב, בעבר ובהווה, על הדיונים המעניינים והתרומות הגדולות לפרויקט. אנו מודים למרכז המחקר הקליני הלאומי לבריאות הילד על התמיכה הגדולה. מחקר זה נתמך כספית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (U20A20351 לג'יאנהואה מאו, 82200784 ללידן הו), הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ג'יאנג בסין (No. LQ22C070004 ללידן הו), והקרן למדעי הטבע של פרובינציית ג'יאנגסו (מענקים מס'. BK20210150 לגאנג וואנג).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #07920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
References
- Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
- Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease - a systematic review and meta-analysis. PLOS ONE. 11 (7), 0158765 (2016).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Morizane, R., Lam, A. Q., Freedman, B. S., Kishi, S., Valerius, M. T., Bonventre, J. V. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6 (1), 8715 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Mugford, J. W., Sipilä, P., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney. Developmental biology. 324 (1), 88-98 (2008).
- SaxOn, L., Sariola, H.
- Kobayashi, A., et al. Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development. Cell Stem Cell. 3 (2), 169-181 (2008).
- Boyle, S., et al. Fate mapping using Cited1-CreERT2 mice demonstrates that the cap mesenchyme contains self-renewing progenitor cells and gives rise exclusively to nephronic epithelia. Developmental Biology. 313 (1), 234-245 (2008).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15 (10), 613-624 (2019).
- Kumar, S. V., et al. Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells. Development. 146 (5), 172361 (2019).
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
