Summary
Denne protokollen presenterer en omfattende og effektiv metode for å produsere nyreorganoider fra induserte pluripotente stamceller (iPSCs) ved bruk av suspensjonskulturbetingelser. Hovedvekten av denne studien ligger i bestemmelsen av den opprinnelige celletettheten og WNT-agonistkonsentrasjonen, og derved til fordel for forskere som er interessert i nyreorganoidforskning.
Abstract
Nyreorganoider kan genereres fra induserte pluripotente stamceller (iPSCs) gjennom ulike tilnærminger. Disse organoider holder stort løfte om sykdomsmodellering, narkotika screening og potensielle terapeutiske applikasjoner. Denne artikkelen presenterer en trinnvis prosedyre for å lage nyreorganoider fra iPSCs, fra den bakre primitive streken (PS) til mellomliggende mesoderm (IM). Tilnærmingen er avhengig av APEL 2-mediet, som er et definert, animalsk komponentfritt medium. Det suppleres med en høy konsentrasjon av WNT-agonist (CHIR99021) i en varighet på 4 dager, etterfulgt av fibroblastvekstfaktor 9 (FGF9)/heparin og en lav konsentrasjon av CHIR99021 i ytterligere 3 dager. I løpet av denne prosessen legges det vekt på å velge optimal celletetthet og CHIR99021 konsentrasjon ved starten av iPSCs, da disse faktorene er kritiske for vellykket nyreorganoidgenerering. Et viktig aspekt ved denne protokollen er suspensjonskulturen i en lav adherent plate, slik at IM gradvis kan utvikle seg til nephronstrukturer, som omfatter glomerulære, proksimale rørformede og distale rørformede strukturer, alt presentert i et visuelt forståelig format. Samlet sett tilbyr denne detaljerte protokollen en effektiv og spesifikk teknikk for å produsere nyreorganoider fra forskjellige iPSCer, noe som sikrer vellykkede og konsistente resultater.
Introduction
Nyren spiller en kritisk rolle i å opprettholde fysiologisk homeostase, avhengig av dens funksjonelle enhet. Nefroner, som skiller ut avfallsstoffer, kan regulere sammensetningen av kroppsvæsker. Kronisk nyresykdom (CKD), forårsaket av arvelige mutasjoner eller andre høyrisikofaktorer, vil etter hvert utvikle seg til nyresykdom i sluttstadiet (ESKD)1,2. ESKD skyldes tilsynelatende den begrensede regenereringskapasiteten til nefroner. Dermed er nyreutskiftningsterapi nødvendig. Rettet differensiering av humane iPSCer muliggjør in vitro-generering av pasientspesifikke 3D-nyreorganoider, som kan brukes til å studere nyreutvikling, modellere pasientspesifikke sykdommer og utføre nefrotoksisk legemiddelscreening 3,4.
Under embryonal utvikling stammer nyrene fra mellomliggende mesoderm (IM), som skiller seg fra den primitive streken (PS). Den klassiske WNT-signalveien kan indusere ytterligere differensiering av IM med koordinert deltakelse av FGF (FGF9, FGF20) og BMP (Bmp7-signalering gjennom JNK) 5,6,7. De produserer to viktige cellepopulasjoner av nephric progenitorceller (NPC): ureteral bud (UB) og metanephric mesenchyme (MM), som danner oppsamlingskanalene og nefronen, henholdsvis 8,9. Hver nefron består av glomerulære og rørformede segmenter, som proksimale og distale tubuli, og løkken til Henle10,11. I følge teorien nevnt ovenfor etterligner for tiden publiserte protokoller signalkaskader og vekstfaktorstimulering for å indusere nyreorganoider 5,12.
I løpet av de siste årene har mange protokoller blitt utviklet for å skille humane iPSCs til nyreorganoider 5,6,7,12. Takasato et al.7 optimaliserte varigheten av CIR-behandling (WNT-agonist) før erstatning av FGF9. I henhold til protokollen deres er CIR-eksponering i 4 dager, etterfulgt av FGF9 i 3 dager, den mest effektive måten å indusere IM fra iPSCs. Transwellfiltre ble brukt som kulturformat i prosedyren; Denne metoden er imidlertid vanskelig for nybegynnere. Derfor forsøkte Kumar et al.13 å endre kulturformatet og valgte å suspendere kulturen. De dissosierte de adherente cellene på dag 7 for såing i lavadherente plater for å hjelpe dem med å samle seg til embryoidlegemer (EB) som inneholder nefronlignende strukturer. Imidlertid var batcheffekten av disse metodene tydelig, spesielt i forskjellige iPSCer. I tillegg rapporterte forskjellig litteratur at konsentrasjonen av CHIR varierte fra 7 μM til 12 μM 5,13,14.
Vi spekulerte på at konsentrasjonen av celletetthet og CHIR kan påvirke genereringen av organoider i forskjellige iPSCer, og dette har blitt verifisert mange ganger i våre eksperimenter. Den nåværende protokollen har noe modifisert studiemetoden til Kumar et al.13 og gitt brukerne en trinnvis prosedyre. Tidsplanen og skjemaet for tilnærmingen er vist i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
iPSCene som ble brukt i denne studien ble hentet fra en kommersiell kilde. Cellene ble vedlikeholdt med mTeSR-medium på kommersielt tilgjengelige kjellermembranmatrisebelagte plater (se materialtabell). Tabell 1 inneholder alle mediumsammensetningene som ble benyttet i studien.
1. Plettering iPSCs for differensiering og indusering av bakre primitive strek (PS)
- Vask iPSCs på membranmatrisebelagt 6-brønnsplate med 2 ml DPBS. Aspirer DPBS ved hjelp av en pipette.
- Tilsett 1 ml av den kommersielt tilgjengelige celledetachmentløsningen (se materialfortegnelse) for å løsne iPSC og inkubere ved 37 °C i 5 minutter.
- Tilsett 1 ml mTeSR til iPSCs, og sørg for at cellene har løftet seg av plastoverflaten.
- Sentrifuger cellene ved 400 x g i 3 minutter ved romtemperatur (RT). Resuspender cellepelleten og telle cellenummeret ved hjelp av et hemocytometer.
- Frø en rekke celletettheter på en 24-brønn- eller 6-brønnsplate belagt med membranmatrise og kultur med mTeSR supplert med 10 μM Rho kinasehemmer (Y-27632) (se materialtabell). Dyrk dem over natten i en 37 °C CO2 -inkubator.
MERK: For å indusere PS varierer den optimale konsentrasjonen av CHIR99021 og passende celletetthet fra forskjellige iPSC-linjer. Frø en rekke tettheter (f.eks. 0,6, 0,9, 1,2, 1,5, 1,8, 2,4 * 103 enkeltceller per kvadratcentimeter) og en konsentrasjonsområde på CHIR99021 fra 7 μM-12 μM. Start differensieringen av hver tetthet og hver CHIR på samme dag. Finn den optimale konsentrasjonen av CHIR99021 og passende celletettheter i en 24-brønns plate og utvid deretter kulturen i 6-brønnsplater. Her gir vi en protokoll basert på en 6-brønnsplate. - Neste dag, aspirer mTeSR og vask cellene med 2 ml DPBS.
- Legg til 2 ml stadium I-medium (stamcelledifferensieringsmedium inneholdende 8-12 μM CHIR99021) (tabell 1), referert til som dag 0.
- Dyrk dem i en 37 ° C inkubator i 4 dager, oppdater trinn I medium annenhver dag.
2. Indusere nefrogen mellomliggende mesoderm (IM)
- På dag 4, fjern trinn I medium og vask med 2 ml DPBS.
- Tilsett 2 ml stadium II-medium til cellene (stamcelledifferensieringsmedium inneholdende 200 ng/ml FGF9, 1 μg/ml heparin og 1 μM CHIR99021) (tabell 1).
- Dyrk dem i en 37 °C inkubator, og oppdater mediet hver 2. dag frem til dag 7.
3. Generering av nyreorganoider i suspensjonskultur
MERK: I observasjonsperioden fra dag 0 til dag 7 er tilstanden til cellene kritisk. Hvis cellene viser vellykket ekspansjon og hoper seg opp uten signifikant celleavfall, demonstrerer det vellykket derivasjon av mellomliggende mesoderm (IM), noe som indikerer beredskapen til å gå videre til neste trinn. Men hvis cellene viser tegn på initial apoptose, etterfulgt av nekrose eller brudd, kan det være tegn på uhensiktsmessige konsentrasjoner av CHIR99021 eller celletetthet.
- På dag 7, fjern trinn II-mediet og vask cellene med 2 ml DPBS.
- Tilsett 1 ml av celleløsningen til hver brønn og inkuber ved 37 °C i 5 minutter til cellene brytes under fasekontrast.
- Pipett 1 ml stadium II medium til cellene, bland og sørg for at cellene har løftet seg fra overflaten.
- Samle cellesuspensjonen i et 15 ml rør og sentrifuge ved 400 x g i 3 minutter ved romtemperatur.
- Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 2 ml stadium III-medium (stamcelledifferensieringsmedium inneholdende 200 ng/ml FGF9, 1 μg/ml heparin og 1 μM CHIR99021 i 0,1 % metylcellulose (MC), 0,1 % polyvinylalkohol (PVA)) supplert med 10 μM Rho-kinasehemmer (Y-27632) (se materialtabell). Bland det forsiktig.
- Bland cellesuspensjonen og frøet i en 6-brønns lavadhesjonsplate i forholdet 1:3. Sett platen på en orbital shaker (CO 2 resistent, roterende ved 60 o / min) i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- 24 timer senere, fjern Rho kinase inhibitor (Y-27632) og legg til stadium III media (stamcelledifferensieringsmedium supplement med 200 ng / ml FGF9, 1 μg / ml heparin, 1 μM CHIR99021, 0,1% MC, 0,1% PVA). Kultur i 2 dager. Endre mediet i fjæringskulturen ved å følge trinnene nedenfor:
- Klipp av spissen på 1 ml pipetten med aseptisk saks.
- Rist forsiktig 6-brønnsplaten for å ordne organoidene midt på platen.
- Aspirer organoidene med de tilberedte pipettene inn i et 15 ml rør og la dem stå i 5 minutter.
- Aspirer supernatanten og la organoidene ligge i bunnen av røret.
- Tilsett det friske mediet for å resuspendere organoidene og relatere tilbake til en 6-brønns plate med lav vedheft.
- Fortsett å riste lavadhesjonsplaten ved 60 o / min i inkubatoren. Bytt stadium III-medium annenhver dag frem til dag 12.
- På dag 12, skift medium til stadium IV medium (stamcelledifferensieringsmedium inneholdende 0,1 % MC og 0,1 % PVA).
- Bytt medium annenhver dag frem til dag 25. Organoidene kan gradvis utvikle seg til modne nefranstrukturer fra dag 12-25.
4. Immunfluorescensfarging av nyreorganoider
- Samle nyreorganoider i et 15 ml rør og vask med 2 ml PBS.
- Etter å ha latt den virke i 5-10 min, fikser du nyreorganoidene i nylaget 2% PFA i 20 minutter ved 4 °C.
- Fjern PFA og vask organoidene med 1 ml PBS inneholdende 0,3% Triton X-100 (0,3% PBST), rist den jevnt på en shaker (med en rotasjonshastighet på ikke over 60 o / min) i 8 minutter, la den stå i 5 minutter, og fjern deretter supernatanten. Gjenta tre ganger.
MERK: Organoidene kan lagres i 0,3% PBST ved 4 ° C i 2-4 uker. - Inkuber de faste organoidene med 10 % eseserum i PBST (blokkeringsbuffer) (se materialfortegnelse) over natten ved 4 °C.
- Fortynn de primære antistoffene (oppført i materialfortegnelsen) i en blokkeringsbuffer med et forhold på 1:300.
- Inkuber organoidene med primære antistoffer over natten ved 4 °C med omrøring.
MERK: Sørg for at glomeruli og tubuli kan farges samtidig på en organoid. - Vask organoidene med 1 ml 0,3% PBST, rist den jevnt på en shaker (med en rotasjonshastighet på ikke over 60 o / min) i 8 minutter, la den stå i 5 minutter, og fjern deretter supernatanten. Gjenta tre ganger.
- Inkuber organoidene med sekundære antistoffer (oppført i materialtabellen) og DAPI over natten ved 4 °C ved omrøring. Gjenta deretter trinn 4.7.
MERK: Både sekundært antistoff og DAPI fortynnes i blokkeringsløsning, sekundært antistoff (1:400) og DAPI (1:1000). - Etter fargingen, dehydrer organoidene med metanol (25%, 50%, 75% og 100% i 5 minutter hver), og gjennomsyre deretter med benzylalkohol og benzylbenzoat (BABB, 1: 2-forhold) (se materialtabell) i 5 minutter.
- Hold de ryddede organoidene på en glassbunnsfat (se materialfortegnelse) og undersøk dem ved konfokalmikroskopi.
MERK: Når du avbilder, velg petriskålen i bunnen av glassfatet, og legg BABB direkte i petriskålen når du gjennomsyrer for å holde bunnen av fatet fuktig.
5. Opptak av ekstran in vitro
- På dag 25, inkuber organoidene med 100 μg / ml fluorescensmerket dextran (se materialtabell) i 4 timer i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- 4 timer senere, bytt til et nytt medium og ta levende cellekulturbilder ved hjelp av et bredfeltfluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Produksjonen av IM oppnås ved å aktivere kanonisk WNT-signalering ved hjelp av GSK3-hemmeren CHIR99021, etterfulgt av FGF9 / heparin. Fra dag 0 til dag 4 ekspanderer iPSCs raskt og antar rhomboid eller trekantede former. Sammenløpet når 90% -100% og akkumuleres jevnt til dag 7. Ved suspensjonskultur danner aggregatene spontant nefranstrukturer etter dissosiasjon på dag 7. Nyreorganoidene som dannes gjennom suspensjonskultur, viser rørformede strukturer og observeres lett på lyse feltbilder etter 18 dagers aggregering (figur 2 og figur 3).
Vanligvis gir en analyse som starter fra en brønn på en 24-brønnsplate med iPSCs 200-300 organoider. Blant disse inneholder 80%-90% nefronlignende strukturer (figur 2). For hiPSC-B1 iPSC-linjen innebærer de beste forholdene for å generere nyreorganoider dyrking av 1,8-2,0 x 10 4 celler i en brønn med en 24-brønnsplate med 8 μM CHIR99021 (figur 2, figur 3 og figur 4). Disse nyreorganoider kan opprettholdes i opptil 1-2 uker utover dag 25 ved å endre stadium IV medium hver 2-3 dager.
Immunfluorescensanalyse av hele organoider avslører tilstedeværelse av nefronsegmenter, inkludert NPHS1-, Synaptopodin (SYNAPO-) og WT1-merkede podocytter, MEIS1/2/3-merkede interstitielle celler, Lotus Tetragonolobus Lectin (LTL-) merkede proksimale tubuli, E-Cadherin (ECAD-) merkede distale tubuli og GATA3-merkede oppsamlingskanaler. Videre induserer denne protokollen endotelceller som viser positiv farging med CD31 (figur 5).
Endelig indikerer in vitro dekstranopptaksanalyser de fysiologisk relevante funksjonene til nyreorganoider. Etter inkubering av nyreorganoidene (dag 7 + 18) med 100 μg/ml fluorescensmerket dextran i 4 timer, observeres dextranet tatt inn i proksimale tubuli på lyse feltbilder (figur 5L og figur 6).
Figur 1: Den eksperimentelle tidsplanen og oversikten over protokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Generering av nyreorganoider fra dag 0 til dag 7 ved bruk av ulike konsentrasjoner av CHIR99021. Skala barer: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Generering av nyreorganoider fra dag 8 til dag 21 ved bruk av ulike konsentrasjoner av CHIR99021. Skala barer: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Bilder tatt på dag 7 av de forskjellige celletetthetene fra 1,5 x 10 4 til 2,2 x 104 celler/brønn. Skala barer: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5 Representative konfokale immunfluorescensbilder av nyreorganoider. (A,B) Immunfluorescensanalyse for markører av nephronprogenitorer (SALL1, blå), pretubulært aggregat (PAX8, magenta), podocytt (NPHS1, blått) av D7+11 nyreorganoider. (VG Nett) Immunfluorescensanalyse av Segmentert mønster i organoider viser tilstedeværelse av podocytter (NPHS1, NPHS2, SYNAPO og WT1, rød; MAFB, grønn), proksimale tubuli (LTL, hvit; LRP2, blå; CUBN, rød), distale tubuli (ECAD, grønn), samlekanaler (GATA3, rosa), mesangialceller (PDGFR, rød), interstitielle celler (MEIS1/2/3, grønn), Integrin beta 1 (TIGB1, grønn) og endotelceller (CD31, grønn). Skalastenger: 100 μm (A,C,E-J), 50 μm (B) og 10 μm (D,K). (L) immunfluorescensanalyse av nyreorganoider etter dekstranoppdateringsanalysen. Skala bar: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: In vitro funksjonell validering av nyreorganoider dag 25. (AD) Levende bilder av nyreorganoider inkubert med fluorescensmerket dextran på 10 kDa. Skala barer: 100 μm (A,B); 10 μm (C,D). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Reagent | Lager conc. | Arbeider conc. |
Stadium  Middels |
||
| APEL | N/a | N/a |
| CHIR 99021 | 10 μM | 4-12 μM |
Stadium  Middels |
||
| APEL | N/a | N/a |
| FGF9 | 100 ng/μL | 200 ng/ml |
| rHSA | 0,2 g/ml | 1 mikrogram/ml |
| Heparin | 2 mg/ml | 1 mikrogram/ml |
| CHIR 99021 | 10 μM | 1 μM |
Stadium  Middels |
||
| APEL | N/a | N/a |
| FGF9 | 100 ng/μL | 200 ng/ml |
| rHSA | 0,2 g/ml | 1 mikrogram/ml |
| Heparin | 2 mg/ml | 1 mikrogram/ml |
| CHIR 99021 | 10 μM | 1 μM |
| PVA | 1% | 0.10% |
| MC | 1% | 0.10% |
Stadium  Middels |
||
| APEL | N/a | N/a |
| PVA | 1% | 0.10% |
| MC | 1% | 0.10% |
Tabell 1: Mediumsammensetningene benyttet i studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En detaljert protokoll er beskrevet for generering av nyreorganoider fra iPSCs, som involverer mindre modifikasjoner av basalmediet, initial celletetthet og konsentrasjon av CHIR99021. I ulike eksperimenter ble de kritiske faktorene for vellykket nyreorganoidgenerering funnet å være den første differensieringen av mellomliggende mesoderm (IM) og celletilstanden på dag 7. Videre viste forskjellige iPSC-linjer variasjoner i celleproliferasjon og differensieringspotensial, noe som resulterte i varierende optimale celletettheter og CHIR99021 konsentrasjoner 5,13,14. Derfor er det viktig å bestemme de ideelle forholdene for hver iPSC-linje for å produsere et betydelig antall nyreorganoider fra pasientspesifikke iPSCer.
For å identifisere de optimale forholdene anbefales det å gjennomføre innledende eksperimenter med 24-brønnsplater før man skalerer opp kulturen til 6-brønnsplater for storskala produksjon. Dette trinnet gjør det mulig for forskere å vurdere suksessen til induksjon basert på cellemorfologi og kvantitet. Videre kan organoidene bevares i sin komplette struktur i 2-4 uker etter fiksering, noe som øker muligheten og nytten av denne metoden.
Nyreorganoider generert ved hjelp av denne protokollen måler vanligvis ca. 50-300 μm og utviser rørformede strukturer når de observeres under lysfeltmikroskopi. Immunfluorescerende analyse bekrefter pålitelig dannelse av nyrenefroner, slik som podocytter merket med NPHS1 og WT1, proksimale tubuli merket med LTL, LRP2 og CUBN, distale tubuli merket med ECAD, samlekanaler merket med GATA3 og interstitielle celler merket med MEIS1/2/313. I tillegg induserer denne protokollen tilstedeværelsen av endotelceller farget med CD31, noe som tyder på potensialet for vaskularisering i nyreorganoider.
In vitro dekstranopptakstester viser fysiologisk relevante funksjoner i nyreorganoidene, slik som foreløpig filtrering og reabsorpsjon. Dette gjør dem svært egnet for sykdomsmodellering og studier av dysfunksjonsmekanismer. Det er imidlertid viktig å merke seg at modenheten til disse nyreorganoidene ligner menneskelige nyrer i første trimester, og de mangler vaskulatur i in vitro-kulturen 13. Videre forskning er nødvendig for å belyse de underliggende mekanismene.
Avslutningsvis tilbyr den beskrevne protokollen en lovende metode for å generere nyreorganoider fra iPSCs, noe som gir en avenue for videre forskning og studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterte ingen potensiell interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi er svært takknemlige for alle Mao og Hu Lab medlemmer, tidligere og nåværende, for interessante diskusjoner og gode bidrag til prosjektet. Vi takker Nasjonalt klinisk forskningssenter for barnehelse for god støtte. Denne studien ble støttet økonomisk av National Natural Science Foundation of China (U20A20351 til Jianhua Mao, 82200784 til Lidan Hu), Natural Science Foundation of Zhejiang Province of China (nr. LQ22C070004 til Lidan Hu), og Natural Science Foundation of Jiangsu Province (tilskudd nr. BK20210150 til Gang Wang).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #07920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
References
- Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
- Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease - a systematic review and meta-analysis. PLOS ONE. 11 (7), 0158765 (2016).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Morizane, R., Lam, A. Q., Freedman, B. S., Kishi, S., Valerius, M. T., Bonventre, J. V. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6 (1), 8715 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Mugford, J. W., Sipilä, P., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney. Developmental biology. 324 (1), 88-98 (2008).
- SaxOn, L., Sariola, H.
- Kobayashi, A., et al. Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development. Cell Stem Cell. 3 (2), 169-181 (2008).
- Boyle, S., et al. Fate mapping using Cited1-CreERT2 mice demonstrates that the cap mesenchyme contains self-renewing progenitor cells and gives rise exclusively to nephronic epithelia. Developmental Biology. 313 (1), 234-245 (2008).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15 (10), 613-624 (2019).
- Kumar, S. V., et al. Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells. Development. 146 (5), 172361 (2019).
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
