Summary
Detta protokoll presenterar en omfattande och effektiv metod för att producera njurorganoider från inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) med hjälp av suspensionsodlingsförhållanden. Den primära tyngdpunkten i denna studie ligger i bestämningen av den initiala celltätheten och koncentrationen av WNT-agonisten, vilket gynnar forskare som är intresserade av forskning om njurorganoider.
Abstract
Njurorganoider kan genereras från inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) genom olika metoder. Dessa organoider är mycket lovande för sjukdomsmodellering, läkemedelsscreening och potentiella terapeutiska tillämpningar. Den här artikeln presenterar en steg-för-steg-procedur för att skapa njurorganoider från iPSC, från den bakre primitiva strimman (PS) till den intermediära mesodermen (IM). Tillvägagångssättet bygger på APEL 2-mediet, som är ett definierat, djurkomponentfritt medium. Det kompletteras med en hög koncentration av WNT-agonist (CHIR99021) under en period av 4 dagar, följt av fibroblasttillväxtfaktor 9 (FGF9)/heparin och en låg koncentration av CHIR99021 under ytterligare 3 dagar. Under denna process läggs tonvikten på att välja den optimala celltätheten och CHIR99021 koncentrationen i början av iPSCs, eftersom dessa faktorer är avgörande för framgångsrik generering av njurorganoider. En viktig aspekt av detta protokoll är suspensionskulturen i en platta med låg vidhäftning, vilket gör att IM gradvis kan utvecklas till nefronstrukturer, som omfattar glomerulära, proximala tubulära och distala tubulära strukturer, allt presenterat i ett visuellt begripligt format. Sammantaget erbjuder detta detaljerade protokoll en effektiv och specifik teknik för att producera njurorganoider från olika iPSC:er, vilket säkerställer framgångsrika och konsekventa resultat.
Introduction
Njuren spelar en avgörande roll för att upprätthålla fysiologisk homeostas, beroende på dess funktionella enhet. Nefroner, som utsöndrar slaggprodukter, kan reglera sammansättningen av kroppsvätskor. Kronisk njursjukdom (CKD), som orsakas av ärftliga mutationer eller andra högriskfaktorer, kommer så småningom att utvecklas till njursjukdom i slutstadiet (ESKD)1,2. ESKD beror tydligen på nefronernas begränsade regenereringsförmåga. Njurersättningsterapi krävs därför. Riktad differentiering av humana iPSCs möjliggör in vitro-generering av patientspecifika 3D-njurorganoider, som kan användas för att studera njurutveckling, modellera patientspecifika sjukdomar och utföra screening av nefrotoxiska läkemedel 3,4.
Under embryonal utveckling härstammar njurarna från den intermediära mesodermen (IM), som skiljer sig från den primitiva strimman (PS). Den klassiska WNT-signalvägen kan inducera ytterligare differentiering av IM med samordnat deltagande av FGF (FGF9, FGF20) och BMP (Bmp7-signalering genom JNK)5,6,7. De producerar två viktiga cellpopulationer av nefriska stamceller (NPC): urinledarknoppen (UB) och metanefriskisenkymet (MM), som bildar uppsamlingskanalerna respektivenefronen 8,9. Varje nefron består av glomerulära och rörformiga segment, såsom de proximala och distala tubuli, och öglan av Henle10,11. Enligt den teori som nämns ovan efterliknar för närvarande publicerade protokoll signalkaskader och tillväxtfaktorstimulering för att inducera njurorganoider 5,12.
Under de senaste åren har många protokoll utvecklats för att differentiera humana iPSCs till njurorganoider 5,6,7,12. Takasato et al.7 optimerade varaktigheten av CHIR (WNT-agonist) behandling innan den ersattes med FGF9. Enligt deras protokoll är HIR-exponering i 4 dagar, följt av FGF9 i 3 dagar, det mest effektiva sättet att inducera IM från iPSCs. Transwell-filter användes som odlingsformat i deras procedur; Denna metod är dock svår för nybörjare. Därför försökte Kumar et al.13 ändra kulturformatet och valde att avbryta kulturen. De dissocierade de vidhäftande cellerna på dag 7 för sådd i lågvidhäftande plattor för att hjälpa dem att samlas till embryoidkroppar (EB) som innehåller nefronliknande strukturer. Batcheffekten av dessa metoder var dock tydlig, särskilt i olika iPSC:er. Dessutom rapporterade olika litteratur att koncentrationen av CHIR varierade från 7 μM till 12 μM 5,13,14.
Vi spekulerade i att koncentrationen av celldensitet och CHIR kan påverka genereringen av organoider i olika iPSC, och detta har verifierats flera gånger i våra experiment. Det nuvarande protokollet har modifierat studiemetoden för Kumar et al.13 något och gett användarna en steg-för-steg-procedur. Tidsplanen och schemat för inflygningen visas i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De iPSC:er som användes för denna studie erhölls från en kommersiell källa. Cellerna bibehölls med mTeSR-medium på kommersiellt tillgängliga matrisbelagda basalmembranplattor (se materialförteckning). Tabell 1 innehåller alla mediesammansättningar som användes i studien.
1. Plätering av iPSCs för differentiering och inducering av bakre primitiva strimmor (PS)
- Tvätta iPSCs på den membranmatrisbelagda 6-hålsplattan med 2 ml DPBS. Aspirera DPBS med en pipett.
- Tillsätt 1 ml av den kommersiellt tillgängliga cellavskiljningslösningen (se materialtabell) för att lossa iPSC och inkubera vid 37 °C i 5 minuter.
- Tillsätt 1 ml mTeSR till iPSCs och se till att cellerna har lyfts av plastytan.
- Centrifugera cellerna vid 400 x g i 3 minuter vid rumstemperatur (RT). Återsuspendera cellpelleten och räkna cellantalet med hjälp av en hemocytometer.
- Sådd en rad celldensiteter på en platta med 24 eller 6 brunnar belagd med membranmatris och odla med mTeSR kompletterat med 10 μM Rho-kinashämmare (Y-27632) (se materialförteckning). Odla dem över natten i en 37 °C CO2 -inkubator.
OBS: För att inducera PS varierar den optimala koncentrationen av CHIR99021 och lämpliga celldensiteter från olika iPSC-linjer. Frö ett intervall av densiteter (t.ex. 0,6, 0,9, 1,2, 1,5, 1,8, 2,4 * 103 enskilda celler per kvadratcentimeter) och ett koncentrationsintervall på CHIR99021 från 7 μM-12 μM. Initiera differentieringen av varje densitet och varje CHIR samma dag. Hitta den optimala koncentrationen av CHIR99021 och lämplig celltäthet i en 24-hålsplatta och expandera sedan kulturen i 6-hålsplattor. Här tillhandahåller vi ett protokoll baserat på en 6-hålsplatta. - Nästa dag, aspirera mTeSR och tvätta cellerna med 2 ml DPBS.
- Tillsätt 2 ml steg I-medium (stamcellsdifferentieringsmedium som innehåller 8-12 μM CHIR99021) (tabell 1), se dag 0.
- Odla dem i en 37 °C inkubator i 4 dagar, uppdatera steg I medium varannan dag.
2. Inducering av nefrogen intermediär mesoderm (IM)
- På dag 4, ta bort steg I medium och tvätta med 2 ml DPBS.
- Tillsätt 2 ml steg II-medium till cellerna (stamcellsdifferentieringsmedium innehållande 200 ng/ml FGF9, 1 μg/ml heparin och 1 μM CHIR99021) (tabell 1).
- Odla dem i en inkubator med 37 °C och uppdatera mediet varannan dag fram till dag 7.
3. Generering av njurorganoider i suspensionskultur
OBS: Under observationsperioden från dag 0 till dag 7 är cellernas tillstånd kritiskt. Om cellerna uppvisar framgångsrik expansion och hopar sig utan betydande cellrester, visar det den framgångsrika härledningen av den intermediära mesodermen (IM), vilket indikerar beredskapen att gå vidare till nästa steg. Men om cellerna visar tecken på initial apoptos, följt av nekros eller brott, kan det tyda på olämpliga koncentrationer av CHIR99021 eller celltäthet.
- På dag 7, ta bort steg II-mediet och tvätta cellerna med 2 ml DPBS.
- Tillsätt 1 ml av celllösenlösningen till varje brunn och inkubera vid 37 °C i 5 minuter tills cellerna bryts under faskontrast.
- Pipettera 1 ml steg II-medium till celler, blanda och se till att cellerna har lyft från ytan.
- Samla upp cellsuspensionen i ett 15 ml rör och centrifugera vid 400 x g i 3 minuter vid rumstemperatur.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 2 ml steg III-medium (stamcellsdifferentieringsmedium innehållande 200 ng/ml FGF9, 1 μg/ml heparin och 1 μM CHIR99021 i 0,1 % metylcellulosa (MC), 0,1 % polyvinylalkohol (PVA)) kompletterat med 10 μM Rho-kinashämmare (Y-27632) (se materialtabell). Blanda försiktigt.
- Blanda cellsuspensionen och fröet i en 6-håls lågvidhäftningsplatta i förhållandet 1:3. Placera plattan på en orbital shaker (CO 2 -resistent, roterar med 60 rpm) i en inkubator vid 37 °C och 5 % CO2 .
- 24 timmar senare avlägsnas Rho-kinashämmare (Y-27632) och media i stadium III tillsätts (tillskott av stamcellsdifferentieringsmedium med 200 ng/ml FGF9, 1 μg/ml heparin, 1 μM CHIR99021, 0,1 % MC, 0,1 % PVA). Kultur i 2 dagar. Ändra mediet i suspensionskulturen genom att följa stegen nedan:
- Klipp av spetsen på 1 ml pipetten med en aseptisk sax.
- Skaka försiktigt 6-brunnsplattan för att ordna organoiderna i mitten av plattan.
- Aspirera organoiderna med de förberedda pipetterna i ett 15 ml rör och låt dem stå i 5 minuter.
- Aspirera supernatanten och lämna organoiderna i botten av röret.
- Tillsätt det färska mediet för att återsuspendera organoiderna och platta tillbaka till en 6-brunns platta med låg vidhäftning.
- Fortsätt att skaka lågvidhäftningsplattan vid 60 rpm i inkubatorn. Byt steg III-medium varannan dag fram till dag 12.
- På dag 12 byts mediet till stadium IV-medium (stamcellsdifferentieringsmedium som innehåller 0,1 % MC och 0,1 % PVA).
- Byt medium varannan dag fram till dag 25. Organoiderna kan gradvis utvecklas till mogna nefronstrukturer från dag 12-25.
4. Immunofluorescensfärgning av njurorganoider
- Samla njurorganoider i ett 15 ml rör och tvätta med 2 ml PBS.
- Efter att ha låtit det stelna i 5-10 minuter, fixera njurorganoiderna i nyberedd 2% PFA i 20 min vid 4 °C.
- Ta bort PFA och tvätta organoiderna med 1 ml PBS innehållande 0,3 % Triton X-100 (0,3 % PBST), skaka den jämnt i en shaker (med en rotationshastighet som inte överstiger 60 rpm) i 8 minuter, låt den stå i 5 minuter och ta sedan bort supernatanten. Upprepa tre gånger.
OBS: Organoiderna kan förvaras i 0,3 % PBST vid 4 ° C i 2-4 veckor. - Inkubera de fixerade organoiderna med 10 % åsnesterum i PBST (blockerande buffert) (se materialtabell) över natten vid 4 °C.
- Späd de primära antikropparna (listade i materialtabellen) i en blockerande buffert med ett förhållande på 1:300.
- Inkubera organoiderna med primära antikroppar över natten vid 4 °C med omrörning.
OBS: Se till att glomeruli och tubuli kan färgas samtidigt på en organoid. - Tvätta organoiderna med 1 ml 0,3 % PBST, skaka den jämnt i en shaker (med en rotationshastighet som inte överstiger 60 rpm) i 8 minuter, låt den stå i 5 minuter och ta sedan bort supernatanten. Upprepa tre gånger.
- Inkubera organoiderna med sekundära antikroppar (listade i materialtabellen) och DAPI över natten vid 4 °C med omrörning. Upprepa sedan steg 4.7.
OBS: Både sekundär antikropp och DAPI späds i blockerande lösning, sekundär antikropp (1:400) och DAPI (1:1000). - Efter färgningen, torka organoiderna med metanol (25 %, 50 %, 75 % och 100 % i 5 minuter vardera), permeat sedan med bensylalkohol och bensylbensoat (BABB, förhållandet 1:2) (se materialtabell) i 5 minuter.
- Klipp de rensade organoiderna på en glasbottenskål (se materialtabell) och undersök dem med konfokalmikroskopi.
OBS: Vid avbildning, välj petriskålen i botten av glasskålen, och när du permeaterar, lägg BABB direkt i petriskålen för att hålla botten av skålen fuktig.
5. Bestämning av dextranupptag in vitro
- På dag 25 inkuberas organoiderna med 100 μg/ml fluorescensmärkt dextran (se materialtabell) i 4 timmar i en inkubator vid 37 °C och 5 % CO2 .
- 4 timmar senare, byt till ett nytt medium och ta levande cellkulturbilder med ett bredfältsfluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Produktionen av IM uppnås genom att aktivera kanonisk WNT-signalering med hjälp av GSK3-hämmaren CHIR99021, följt av FGF9/heparin. Från dag 0 till dag 4 expanderar iPSC:er snabbt och antar romboida eller triangulära former. Sammanflödet når 90%-100% och ackumuleras jämnt fram till dag 7. Vid suspensionsodling bildar aggregaten spontant nefronstrukturer efter dissociation på dag 7. Njurorganoiderna som skapas genom suspensionsodling uppvisar rörformiga strukturer och kan lätt observeras i ljusfältsbilder efter 18 dagars aggregering (figur 2 och figur 3).
Vanligtvis ger en analys som startar från en brunn på en 24-brunnars platta med iPSCs 200-300 organoider. Av dessa innehåller 80-90 % nefronliknande strukturer (figur 2). För hiPSC-B1 iPSC-linjen innebär de bästa förutsättningarna för att generera njurorganoider att odla 1,8-2,0 x 10 4 celler i en brunn med en 24-brunnars platta med 8 μM CHIR99021 (figur 2, figur 3 och figur 4). Dessa njurorganoider kan bibehållas i upp till 1-2 veckor efter dag 25 genom att byta stadium IV-medium var 2-3:e dag.
Immunofluorescensanalys av hela organoiderna avslöjar förekomsten av nefronsegment, inklusive NPHS1-, Synaptopodin (SYNAPO-) och WT1-märkta podocyter, MEIS1/2/3-märkta interstitiella celler, Lotus Tetragonolobus Lectin (LTL-) märkta proximala tubuli, E-Cadherin (ECAD-) märkta distala tubuli och GATA3-märkta uppsamlingskanaler. Dessutom inducerar detta protokoll endotelceller som visar positiv färgning med CD31 (figur 5).
Slutligen indikerar in vitro-analyser av dextranupptag de fysiologiskt relevanta funktionerna hos njurorganoider. Efter inkubation av njurorganoiderna (dag 7 + 18) med 100 μg/ml fluorescensmärkt dextran i 4 timmar, observeras att dextranet tas in i de proximala tubuli i ljusfältsbilder (Figur 5L och Figur 6).
Figur 1: Experimentschema och översikt över protokollet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Generering av njurorganoider från dag 0 till dag 7 med olika koncentrationer av CHIR99021. Skalstaplar: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Generering av njurorganoider från dag 8 till dag 21 med olika koncentrationer av CHIR99021. Skalstaplar: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Bilder tagna på dag 7 av de olika celltätheterna från 1,5 x 10 4 till 2,2 x 104 celler/brunn. Skalstaplar: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Representativa konfokala immunofluorescensbilder av njurorganoider. (A,B) Immunofluorescensanalys för markörer för nefronstamceller (SALL1, blå), pretubulärt aggregat (PAX8, magenta), podocyt (NPHS1, blått) av D7+11 njurorganoider. (C-K) Immunofluorescensanalys av segmenterat mönster i organoider visar närvaron av podocyter (NPHS1, NPHS2, SYNAPO och WT1, röd; MAFB, grön), proximala tubuli (LTL, vit; LRP2, blå; CUBN, röd), distala tubuli (ECAD, grön), samlar upp kanaler (GATA3, rosa), mesangiala celler (PDGFR, röd), interstitiella celler (MEIS1/2/3, grön), Integrin beta 1 (TIGB1, grön) och endotelceller (CD31, grön). Skalstreck: 100 μm (A,C,E-J), 50 μm (B) och 10 μm (D,K). L) Immunofluorescensanalys av njurorganoider efter dextranuppdateringstestet. Skalstapel: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Funktionell validering in vitro av njurorganoider dag 25. (A-D) Livebilder av njurorganoider inkuberade med fluorescensmärkt dextran på 10 kDa. Skalstreck: 100 μm (A,B); 10 μm (C,D). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Reagens | Lager konc. | Arbetar conc. |
Etapp  Medium |
||
| APEL | n/a | n/a |
| CHIR 99021 | 10 μM | 4-12 μM |
Etapp  Medium |
||
| APEL | n/a | n/a |
| FGF9 | 100 ng/μL | 200 ng/ml |
| rHSA | 0,2 g/ml | 1 μg/ml |
| Heparin | 2 mg/ml | 1 μg/ml |
| CHIR 99021 | 10 μM | 1 μM |
Etapp  Medium |
||
| APEL | n/a | n/a |
| FGF9 | 100 ng/μL | 200 ng/ml |
| rHSA | 0,2 g/ml | 1 μg/ml |
| Heparin | 2 mg/ml | 1 μg/ml |
| CHIR 99021 | 10 μM | 1 μM |
| PVA | 1% | 0.10% |
| MC | 1% | 0.10% |
Etapp  Medium |
||
| APEL | n/a | n/a |
| PVA | 1% | 0.10% |
| MC | 1% | 0.10% |
Tabell 1: De mediesammansättningar som användes i studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett detaljerat protokoll har beskrivits för att generera njurorganoider från iPSCs, vilket innebär mindre modifieringar av det basala mediet, initial celldensitet och koncentration av CHIR99021. I olika experiment visade sig de kritiska faktorerna för framgångsrik generering av njurorganoider vara den initiala differentieringen av den intermediära mesodermen (IM) och celltillståndet på dag 7. Dessutom uppvisade olika iPSC-linjer variationer i cellproliferation och differentieringspotential, vilket resulterade i varierande optimala celldensiteter och CHIR99021 koncentrationer 5,13,14. Följaktligen är det viktigt att bestämma de ideala förhållandena för varje iPSC-linje för att producera ett stort antal njurorganoider från patientspecifika iPSC.
För att identifiera de optimala förhållandena rekommenderas att utföra preliminära experiment med 24-hålsplattor innan odlingen skalas upp till 6-hålsplattor för större produktion. Detta steg gör det möjligt för forskare att bedöma framgången för induktion baserat på cellmorfologi och kvantitet. Dessutom kan organoiderna bevaras i sin fullständiga struktur i 2-4 veckor efter fixering, vilket förbättrar genomförbarheten och användbarheten av denna metod.
Njurorganoiderna som genereras med hjälp av detta protokoll mäter vanligtvis cirka 50-300 μm och uppvisar rörformiga strukturer när de observeras under ljusfältsmikroskopi. Immunofluorescensanalys bekräftar den tillförlitliga bildningen av njurnefroner, såsom podocyter märkta med NPHS1 och WT1, proximala tubuli märkta med LTL, LRP2 och CUBN, distala tubuli märkta med ECAD, uppsamlingskanaler märkta med GATA3 och interstitiella celler märkta med MEIS1/2/313. Dessutom inducerar detta protokoll närvaron av endotelceller färgade med CD31, vilket tyder på potentialen för vaskularisering i njurorganoiderna.
In vitro prov på upptag av dextran visar fysiologiskt relevanta funktioner hos njurorganoiderna, såsom preliminär filtration och reabsorption. Detta gör dem mycket lämpliga för sjukdomsmodellering och studier av mekanismerna för dysfunktion. Det är dock viktigt att notera att mognaden hos dessa njurorganoider liknar mänskliga njurar under första trimestern, och de saknar vaskulatur i in vitro-kulturen 13. Ytterligare forskning behövs för att klarlägga de bakomliggande mekanismerna.
Sammanfattningsvis erbjuder det beskrivna protokollet en lovande metod för att generera njurorganoider från iPSC, vilket ger en väg för vidare forskning och studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna rapporterade ingen potentiell intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi är oerhört tacksamma till alla Mao och Hu Lab-medlemmar, tidigare och nuvarande, för de intressanta diskussionerna och de stora bidragen till projektet. Vi tackar National Clinical Research Center for Child Health för det stora stödet. Denna studie finansierades ekonomiskt av National Natural Science Foundation of China (U20A20351 till Jianhua Mao, 82200784 till Lidan Hu), Natural Science Foundation of Zhejiang Province of China (nr. LQ22C070004 till Lidan Hu) och den naturvetenskapliga stiftelsen i Jiangsuprovinsen (anslag nr. BK20210150 till Gang Wang).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #07920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
References
- Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
- Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease - a systematic review and meta-analysis. PLOS ONE. 11 (7), 0158765 (2016).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Morizane, R., Lam, A. Q., Freedman, B. S., Kishi, S., Valerius, M. T., Bonventre, J. V. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6 (1), 8715 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Mugford, J. W., Sipilä, P., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney. Developmental biology. 324 (1), 88-98 (2008).
- SaxOn, L., Sariola, H.
- Kobayashi, A., et al. Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development. Cell Stem Cell. 3 (2), 169-181 (2008).
- Boyle, S., et al. Fate mapping using Cited1-CreERT2 mice demonstrates that the cap mesenchyme contains self-renewing progenitor cells and gives rise exclusively to nephronic epithelia. Developmental Biology. 313 (1), 234-245 (2008).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15 (10), 613-624 (2019).
- Kumar, S. V., et al. Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells. Development. 146 (5), 172361 (2019).
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
