Summary
Bu protokol, süspansiyon kültürü koşulları kullanılarak indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) böbrek organoidleri üretmek için kapsamlı ve etkili bir yöntem sunar. Bu çalışmanın birincil vurgusu, başlangıç hücre yoğunluğunun ve WNT agonist konsantrasyonunun belirlenmesinde yatmaktadır, böylece böbrek organoid araştırmalarıyla ilgilenen araştırmacılara fayda sağlamaktadır.
Abstract
Böbrek organoidleri, çeşitli yaklaşımlarla indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) üretilebilir. Bu organoidler, hastalık modellemesi, ilaç taraması ve potansiyel terapötik uygulamalar için büyük umut vaat ediyor. Bu makale, posterior primitif çizgiden (PS) başlayarak orta mezoderme (IM) kadar iPSC'lerden böbrek organoidleri oluşturmak için adım adım bir prosedür sunmaktadır. Yaklaşım, tanımlanmış, hayvansal bileşen içermeyen bir ortam olan APEL 2 ortamına dayanır. 4 gün boyunca yüksek konsantrasyonda WNT agonisti (CHIR99021), ardından fibroblast büyüme faktörü 9 (FGF9) / heparin ve 3 gün boyunca düşük konsantrasyonda CHIR99021 ile desteklenir. Bu işlem sırasında, iPSC'lerin başlangıcında optimal hücre yoğunluğunun ve CHIR99021 konsantrasyonunun seçilmesine önem verilir, çünkü bu faktörler başarılı böbrek organoid üretimi için kritik öneme sahiptir. Bu protokolün önemli bir yönü, IM'nin yavaş yavaş glomerüler, proksimal tübüler ve distal tübüler yapıları kapsayan nefron yapılarına dönüşmesine izin veren düşük yapışık bir plakadaki süspansiyon kültürüdür ve tümü görsel olarak anlaşılabilir bir formatta sunulur. Genel olarak, bu ayrıntılı protokol, çeşitli iPSC'lerden böbrek organoidleri üretmek için verimli ve spesifik bir teknik sunarak başarılı ve tutarlı sonuçlar sağlar.
Introduction
Böbrek, fonksiyonel birimine bağlı olarak fizyolojik homeostazın korunmasında kritik bir rol oynar. Atık ürünleri salgılayan nefronlar, vücut sıvılarının bileşimini düzenleyebilir. Kalıtsal mutasyonların veya diğer yüksek risk faktörlerinin neden olduğu kronik böbrek hastalığı (KBH), sonunda son dönem böbrek hastalığına (SDBH) ilerleyecektir1,2. ESKD, görünüşe göre nefronların sınırlı rejenerasyon kapasitesinden kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, renal replasman tedavisi gereklidir. İnsan iPSC'lerinin yönlendirilmiş farklılaşması, böbrek gelişimini incelemek, hastaya özgü hastalıkları modellemek ve nefrotoksik ilaç taraması yapmak için kullanılabilen hastaya özgü 3D böbrek organoidlerinin in vitro olarak üretilmesini sağlar 3,4.
Embriyonik gelişim sırasında böbrekler, ilkel çizgiden (PS) farklılaşan ara mezodermden (IM) kaynaklanır. Klasik WNT sinyal yolu, FGF (FGF9, FGF20) ve BMP'nin (JNK aracılığıyla Bmp7 sinyali) koordineli katılımı ile IM'nin ek farklılaşmasına neden olabilir5,6,7. Nefrik progenitör hücrelerin (NPC) iki önemli hücre popülasyonunu üretirler: üreter tomurcuğu (UB) ve metanefrik mezenşim (MM), sırasıyla toplama kanallarını ve nefronu oluşturur 8,9. Her nefron, proksimal ve distal tübüller gibi glomerüler ve tübüler segmentlerden ve Henle10,11 döngüsünden oluşur. Yukarıda bahsedilen teoriye göre, şu anda yayınlanmış protokoller, böbrek organoidlerini indüklemek için sinyal kaskadlarını ve büyüme faktörü stimülasyonunu taklit eder 5,12.
Son birkaç yılda, insan iPSC'lerini böbrek organoidlerineayırmak için birçok protokol geliştirilmiştir 5,6,7,12. Takasato ve ark.7, FGF9 ile değiştirilmeden önce CHIR (WNT agonisti) tedavisinin süresini optimize etti. Protokollerine göre, 4 gün boyunca CHIR maruziyeti, ardından 3 gün boyunca FGF9, iPSC'lerden IM'yi indüklemenin en etkili yoludur. Transwell filtreleri, prosedürlerinde kültür formatı olarak kullanıldı; Ancak, bu yöntem yeni başlayanlar için zordur. Bu nedenle, Kumar ve ark.13 kültür formatını değiştirmeye çalıştı ve kültürü askıya almayı seçti. Yapışık hücreleri, nefron benzeri yapılar içeren embriyoid cisimlere (EB'ler) bir araya gelmelerine yardımcı olmak için düşük yapışkan plakalarda tohumlama için 7. günde ayırdılar. Bununla birlikte, bu yöntemlerin toplu etkisi, özellikle farklı iPSC'lerde belirgindi. Ek olarak, farklı literatürde CHIR konsantrasyonunun 7 μM ile 12 μM arasında değiştiği bildirilmiştir 5,13,14.
Hücre yoğunluğu ve CHIR konsantrasyonunun farklı iPSC'lerde organoid oluşumunu etkileyebileceğini tahmin ettik ve bu, deneylerimizde defalarca doğrulandı. Mevcut protokol, Kumar ve ark.13'ün çalışma yöntemini biraz değiştirmiş ve kullanıcılara adım adım bir prosedür sağlamıştır. Yaklaşımın programı ve şeması Şekil 1'de gösterilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma için kullanılan iPSC'ler ticari bir kaynaktan elde edilmiştir. Hücreler, ticari olarak temin edilebilen bazal membran matris kaplı plakalar üzerinde mTeSR ortamı ile muhafaza edildi (bkz. Malzeme Tablosu). Tablo 1 , çalışmada kullanılan tüm ortam bileşimlerini içermektedir.
1. Farklılaşma ve posterior ilkel çizgiyi (PS) indüklemek için iPSC'lerin kaplanması
- Membran matris kaplı 6 oyuklu plaka üzerindeki iPSC'leri 2 mL DPBS ile yıkayın. DPBS'yi bir pipet kullanarak aspire edin.
- iPSC'leri ayırmak için piyasada bulunan hücre ayırma solüsyonundan 1 mL ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 37 °C'de 5 dakika inkübe edin.
- iPSC'lere 1 mL mTeSR ekleyin ve hücrelerin plastik yüzeyden kalktığından emin olun.
- Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 3 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Hücre peletini yeniden süspanse edin ve bir hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın.
- Membran matrisi ile kaplanmış 24 oyuklu veya 6 oyuklu bir plakaya bir dizi hücre yoğunluğu tohumlayın ve 10 μM Rho kinaz inhibitörü (Y-27632) ile takviye edilmiş mTeSR ile kültür edin (bkz. Onları gece boyunca 37 ° C'lik bir CO2 inkübatörde kültürleyin.
NOT: PS'yi indüklemek için, optimal CHIR99021 konsantrasyonu ve uygun hücre yoğunlukları farklı iPSC hatlarından farklılık gösterir. Bir dizi yoğunluk (örneğin, santimetre kare başına 0.6, 0.9, 1.2, 1.5, 1.8, 2.4 * 103 tek hücre) ve 7 μM-12 μM arasında CHIR99021 bir konsantrasyon aralığı tohumlayın. Her yoğunluğun ve her CHIR'nin farklılaşmasını aynı gün başlatın. 24 oyuklu bir plakada optimum CHIR99021 konsantrasyonunu ve uygun hücre yoğunluklarını bulun ve ardından kültürü 6 oyuklu plakalarda genişletin. Burada 6 oyuklu bir plakaya dayalı bir protokol sunuyoruz. - Ertesi gün, mTeSR'yi aspire edin ve hücreleri 2 mL DPBS ile yıkayın.
- 2 mL evre I ortamı (8-12 μM CHIR99021 içeren kök hücre farklılaşma ortamı) ekleyin (Tablo 1), Gün 0 olarak bakın.
- Onları 4 gün boyunca 37 ° C'lik bir inkübatörde kültürleyin, her iki günde bir I. aşama ortamını yenileyin.
2. Nefrojenik ara mezodermin (IM) indüklenmesi
- 4. Günde, aşama I ortamını çıkarın ve 2 mL DPBS ile yıkayın.
- Hücrelere 2 mL evre II besiyeri ekleyin (200 ng/mL FGF9, 1 μg/mL Heparin ve 1 μM CHIR99021 içeren kök hücre farklılaşma ortamı) (Tablo 1).
- Bunları 37 °C'lik bir inkübatörde kültürleyin ve 7. güne kadar her 2 günde bir besiyerini yenileyin.
3. Süspansiyon kültüründe böbrek organoidlerinin üretilmesi
NOT: 0. günden 7. güne kadar olan gözlem süresi boyunca hücrelerin durumu kritiktir. Hücreler başarılı bir genişleme sergiler ve önemli hücre kalıntıları olmadan yığılırsa, bir sonraki aşamaya geçmeye hazır olduğunu gösteren ara mezodermin (IM) başarılı bir şekilde türetildiğini gösterir. Bununla birlikte, hücreler ilk apoptoz belirtileri gösteriyorsa, ardından nekroz veya kırılma gösteriyorsa, uygun olmayan konsantrasyonlarda CHIR99021 veya hücre yoğunluğunun göstergesi olabilir.
- 7. Günde, evre II ortamını çıkarın ve hücreleri 2 mL DPBS ile yıkayın.
- Her oyuğa 1 mL hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve hücreler faz kontrastı altında kırılana kadar 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
- Hücrelere 1 mL aşama II ortamı pipetleyin, karıştırın ve hücrelerin yüzeyden kalktığından emin olun.
- Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 2 mL aşama III ortamında (200 ng/mL FGF9, 1 μg/mL Heparin ve 1 μM CHIR99021 içeren kök hücre farklılaşma ortamı% 0.1 Metilselüloz (MC),% 0.1 Polivinilalkol (PVA)) içeren 10 μM Rho kinaz inhibitörü (Y-27632) ile desteklenmiştir (bkz. Yavaşça karıştırın.
- Hücre süspansiyonunu ve tohumu 1:3 oranında 6 oyuklu düşük yapışma plakasına karıştırın. Plakayı 37 °C ve %5CO2'de bir inkübatörde bir orbital çalkalayıcıya (CO2 dirençli, 60 rpm'de dönen) koyun.
- 24 saat sonra, Rho kinaz inhibitörünü (Y-27632) çıkarın ve aşama III ortamı ekleyin (200 ng / mL FGF9, 1 μg / mL Heparin, 1 μM CHIR99021,% 0.1 MC,% 0.1 PVA ile kök hücre farklılaşma ortamı takviyesi). 2 gün boyunca kültür. Aşağıdaki adımları izleyerek süspansiyon kültüründeki ortamı değiştirin:
- 1 mL'lik pipetin ucunu aseptik makasla kesin.
- Organoidleri plakanın ortasına yerleştirmek için 6 oyuklu plakayı hafifçe sallayın.
- Organoidleri hazırlanan pipetlerle 15 mL'lik bir tüpe aspire edin ve 5 dakika bekletin.
- Süpernatanı aspire edin ve organoidleri tüpün dibinde bırakın.
- Organoidleri yeniden süspanse etmek için taze ortamı ekleyin ve 6 oyuklu düşük yapışma plakasına geri koyun.
- Düşük yapışma plakasını inkübatörde 60 rpm'de sallamaya devam edin. Aşama III ortamını 12. güne kadar her iki günde bir değiştirin.
- 12. Günde, ortamı aşama IV ortamına değiştirin (% 0.1 MC ve% 0.1 PVA içeren kök hücre farklılaşma ortamı).
- Ortamı 25. güne kadar iki günde bir değiştirin. Organoidler, 12-25. günler arasında yavaş yavaş olgun nefron yapılarına dönüşebilir.
4. Böbrek organoidlerinin immünofloresan boyaması
- Böbrek organoidlerini 15 mL'lik bir tüpe toplayın ve 2 mL PBS ile yıkayın.
- 5-10 dakika bekledikten sonra, böbrek organoidlerini taze hazırlanmış% 2 PFA'da 20 ° C'de 4 dakika sabitleyin.
- PFA'yı çıkarın ve organoidleri %0,3 Triton X-100 (%0,3 PBST) içeren 1 mL PBS ile yıkayın, 8 dakika boyunca bir çalkalayıcı (60 rpm'yi geçmeyen bir dönüş hızıyla) üzerinde eşit şekilde çalkalayın, 5 dakika bekletin ve ardından süpernatanı çıkarın. Üç kez tekrarlayın.
NOT: Organoidler, 2-4 hafta boyunca 4 ° C'de% 0.3 PBST'de saklanabilir. - Sabit organoidleri PBST'de (bloke edici tampon) %10 eşek serumu ile (Malzeme Tablosuna bakınız) gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
- Birincil antikorları ( Malzeme Tablosunda listelenmiştir) 1:300 oranında bir bloke edici tampon içinde seyreltin.
- Organoidleri gece boyunca 4 ° C'de ajitasyon ile birincil antikorlarla inkübe edin.
NOT: Glomerüllerin ve tübüllerin bir organoid üzerinde aynı anda boyanabildiğinden emin olun. - Organoidleri 1 mL% 0.3 PBST ile yıkayın, bir çalkalayıcı üzerinde (dönüş hızı 60 rpm'yi geçmeyen bir devir ile) 8 dakika boyunca eşit şekilde çalkalayın, 5 dakika bekletin ve ardından süpernatanı çıkarın. Üç kez tekrarlayın.
- Organoidleri ikincil antikorlar ( Malzeme Tablosunda listelenmiştir) ve DAPI ile gece boyunca 4 ° C'de çalkalama ile inkübe edin. Ardından 4.7 adımını tekrarlayın.
NOT: Hem ikincil antikor hem de DAPI, bloke edici çözelti, ikincil antikor (1:400) ve DAPI (1:1000) içinde seyreltilir. - Boyamadan sonra, organoidleri metanol ile (her biri 5 dakika boyunca %25, %50, %75 ve %100) dehidre edin, ardından benzil alkol ve benzil benzoat (BABB, 1:2 oranı) ile süzün.
- Temizlenmiş organoidleri cam tabanlı bir tabak üzerine koyun (Malzeme Tablosuna bakınız) ve bunları konfokal mikroskopi ile inceleyin.
NOT: Görüntüleme yaparken, cam kabın altındaki Petri kabını seçin ve süzüntü verirken, kabın altını nemli tutmak için BABB'ı doğrudan Petri kabına koyun.
5. İn vitro dekstran alım testi
- 25. Günde, organoidleri 100 μg / mL floresan etiketli dekstran ile inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakınız) 4 saat boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de bir inkübatörde.
- 4 saat sonra, yeni bir ortama geçin ve geniş alanlı bir floresan mikroskobu kullanarak canlı hücre kültürü görüntülerini yakalayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IM üretimi, GSK3 inhibitörü CHIR99021 ve ardından FGF9/heparin kullanılarak kanonik WNT sinyalinin aktive edilmesiyle elde edilir. 0. Günden 4. Güne kadar, iPSC'ler hızla genişler ve eşkenar dörtgen veya üçgen şekiller alır. Birleşme %90-100'e ulaşır ve 7. güne kadar eşit olarak birikir. Süspansiyon kültürü üzerine, agregalar 7. günde ayrıştıktan sonra kendiliğinden nefron yapıları oluşturur. Süspansiyon kültürü ile oluşturulan böbrek organoidleri tübüler benzeri yapılar sergiler ve 18 günlük agregasyondan sonra parlak alan görüntülerinde kolayca gözlenir (Şekil 2 ve Şekil 3).
Tipik olarak, 24 oyuklu bir iPSC plakasının kuyusundan başlayan bir tahlil, 200-300 organoid verir. Bunların %80-90'ı nefron benzeri yapılar içermektedir (Şekil 2). HiPSC-B1 iPSC hattı için, böbrek organoidleri üretmek için en iyi koşullar, 8 μM CHIR99021 ile 24 oyuklu bir plakanın 1.8-2.0 x10 4 hücresinin kültürlenmesini içerir (Şekil 2, Şekil 3 ve Şekil 4). Bu böbrek organoidleri, her 2-3 günde bir evre IV ortamını değiştirerek 25. günden sonra 1-2 haftaya kadar korunabilir.
Tüm organoidlerin immünofloresan analizi, NPHS1-, Synaptopodin (SYNAPO-) ve WT1 etiketli podositler, MEIS1/2/3 etiketli interstisyel hücreler, Lotus Tetragonolobus Lektin (LTL-) işaretli proksimal tübüller, E-Cadherin (ECAD-) etiketli distal tübüller ve GATA3 etiketli toplama kanalları dahil olmak üzere nefron segmentlerinin varlığını ortaya koymaktadır. Ayrıca, bu protokol CD31 ile pozitif boyama gösteren endotel hücrelerini indükler (Şekil 5).
Son olarak, in vitro dekstran alım testleri, böbrek organoidlerinin fizyolojik olarak ilgili fonksiyonlarını gösterir. Böbrek organoidleri (Gün 7 + 18) 100 μg/mL floresan etiketli dekstran ile 4 saat inkübe edildikten sonra, parlak alan görüntülerinde dekstranın proksimal tübüllere alındığı gözlenir (Şekil 5L ve Şekil 6).
Şekil 1: Deney takvimi ve protokole genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Farklı CHIR99021 konsantrasyonları kullanılarak 0. günden 7. güne kadar böbrek organoidlerinin üretimi. Ölçek çubukları: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Farklı CHIR99021 konsantrasyonları kullanılarak 8. günden 21. güne kadar böbrek organoidlerinin üretimi. Ölçek çubukları: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 1.5 x 10 4 ila 2.2 x 104 hücre / kuyu arasındaki farklı hücre yoğunluklarının 7. gününde çekilen görüntüler. Ölçek çubukları: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Böbrek organoidlerinin temsili konfokal immünofloresan görüntüleri. (A,B) D7+11 böbrek organoidlerinin nefron progenitörü (SALL1, mavi), pre-tübüler agrega (PAX8, macenta), podosit (NPHS1, mavi) belirteçleri için immünofloresan analizi. (C-K) Organoidlerde Segmentli desenlemenin immünofloresan analizi, podositlerin (NPHS1, NPHS2, SYNAPO ve WT1, kırmızı; MAFB, yeşil), proksimal tübüller (LTL, beyaz; LRP2, mavi; CUBN, kırmızı), distal tübüller (ECAD, yeşil), toplama kanalları (GATA3, pembe), mezanjiyal hücreler (PDGFR, kırmızı), interstisyel hücreler (MEIS1/2/3, yeşil), İntegrin beta 1 (TIGB1, yeşil) ve endotel hücreleri (CD31, yeşil). Ölçek çubukları: 100 μm (A,C,E-J), 50 μm (B) ve 10 μm (D,K). (L) dekstran güncelleme testini takiben böbrek organoidlerinin immünofloresan analizi. Ölçek çubuğu: 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: 25. Gün böbrek organoidlerinin in vitro fonksiyonel doğrulaması. (A-D) 10 kDa'lık Floresan etiketli dekstran ile inkübe edilmiş böbrek organoidlerinin canlı görüntüleri. Ölçek çubukları: 100 μm (A,B); 10 μm (C,D). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Reaktif | Stok conc. | Çalışma conc. |
Safha  Orta |
||
| APEL (APEL) | Yok | Yok |
| CHIR 99021 | 10 μM | 4-12 μM |
Safha  Orta |
||
| APEL (APEL) | Yok | Yok |
| FGF9 | 100 ng/μL | 200 ng/mL |
| rHSA (rHSA) | 0,2 g/mL | 1 μg/mL |
| Heparin | 2 mg/mL | 1 μg/mL |
| CHIR 99021 | 10 μM | 1 μM |
Safha  Orta |
||
| APEL (APEL) | Yok | Yok |
| FGF9 | 100 ng/μL | 200 ng/mL |
| rHSA (rHSA) | 0,2 g/mL | 1 μg/mL |
| Heparin | 2 mg/mL | 1 μg/mL |
| CHIR 99021 | 10 μM | 1 μM |
| PVA | 1% | 0.10% |
| MC | 1% | 0.10% |
Safha  Orta |
||
| APEL (APEL) | Yok | Yok |
| PVA | 1% | 0.10% |
| MC | 1% | 0.10% |
Tablo 1: Çalışmada kullanılan ortam bileşimleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bazal ortamda, başlangıç hücre yoğunluğunda ve CHIR99021 konsantrasyonunda küçük değişiklikler içeren iPSC'lerden böbrek organoidleri üretmek için ayrıntılı bir protokol tanımlanmıştır. Çeşitli deneylerde, başarılı böbrek organoid üretimi için kritik faktörlerin, 7. günde ara mezodermin (IM) ve hücre durumunun ilk farklılaşması olduğu bulunmuştur. Ayrıca, farklı iPSC hatları, hücre proliferasyonu ve farklılaşma potansiyelinde farklılıklar sergiledi, bu da değişen optimal hücre yoğunlukları ve CHIR99021 konsantrasyonlarıile sonuçlandı 5,13,14. Sonuç olarak, hastaya özgü iPSC'lerden önemli sayıda böbrek organoidi üretmek için her bir iPSC hattı için ideal koşulların belirlenmesi esastır.
Optimum koşulları belirlemek için, daha büyük ölçekli üretim için kültürü 6 oyuklu plakalara ölçeklendirmeden önce 24 oyuklu plakalar kullanarak ön deneyler yapılması önerilir. Bu adım, araştırmacıların hücre morfolojisi ve miktarına dayalı olarak indüksiyonun başarısını değerlendirmelerini sağlar. Ayrıca, organoidler fiksasyonu takiben 2-4 hafta boyunca tam yapılarında korunabilir, bu da bu yöntemin fizibilitesini ve kullanışlılığını arttırır.
Bu protokol kullanılarak üretilen böbrek organoidleri tipik olarak yaklaşık 50-300 μm ölçer ve parlak alan mikroskobu altında gözlemlendiğinde boru benzeri yapılar sergiler. İmmünofloresan analiz, NPHS1 ve WT1 ile etiketlenmiş podositler, LTL, LRP2 ve CUBN ile etiketlenmiş proksimal tübüller, ECAD ile etiketlenmiş distal tübüller, GATA3 ile etiketlenmiş toplama kanalları ve MEIS1/2/3 ile etiketlenmiş interstisyel hücreler gibi böbrek nefronlarının güvenilir oluşumunu doğrular13. Ek olarak, bu protokol CD31 ile boyanmış endotel hücrelerinin varlığını indükler, bu da böbrek organoidleri içinde vaskülarizasyon potansiyelini düşündürür.
İn vitro dekstran alım testleri, ön filtrasyon ve yeniden emilim gibi böbrek organoidlerinin fizyolojik olarak ilgili işlevlerini gösterir. Bu, onları hastalık modellemesi ve işlev bozukluğu mekanizmalarını incelemek için oldukça uygun hale getirir. Bununla birlikte, bu böbrek organoidlerinin olgunluğunun ilk trimester insan böbreklerine benzediğini ve in vitro kültürde damar sisteminden yoksun olduklarını belirtmek önemlidir13. Altta yatan mekanizmaları aydınlatmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.
Sonuç olarak, açıklanan protokol, iPSC'lerden böbrek organoidleri üretmek için umut verici bir yöntem sunarak daha fazla araştırma ve çalışma için bir yol sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar potansiyel bir çıkar çatışması bildirmediler.
Acknowledgments
Geçmişteki ve günümüzdeki tüm Mao ve Hu Lab üyelerine, ilginç tartışmalar ve projeye büyük katkıları için son derece minnettarız. Ulusal Çocuk Sağlığı Klinik Araştırma Merkezi'ne büyük desteği için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Jianhua Mao'ya U20A20351, Lidan Hu'ya 82200784), Çin'in Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (No. LQ22C070004 Lidan Hu'ya) ve Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. BK20210150 Gang Wang'a).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #07920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
References
- Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
- Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease - a systematic review and meta-analysis. PLOS ONE. 11 (7), 0158765 (2016).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Morizane, R., Lam, A. Q., Freedman, B. S., Kishi, S., Valerius, M. T., Bonventre, J. V. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6 (1), 8715 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Mugford, J. W., Sipilä, P., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney. Developmental biology. 324 (1), 88-98 (2008).
- SaxOn, L., Sariola, H.
- Kobayashi, A., et al. Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development. Cell Stem Cell. 3 (2), 169-181 (2008).
- Boyle, S., et al. Fate mapping using Cited1-CreERT2 mice demonstrates that the cap mesenchyme contains self-renewing progenitor cells and gives rise exclusively to nephronic epithelia. Developmental Biology. 313 (1), 234-245 (2008).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15 (10), 613-624 (2019).
- Kumar, S. V., et al. Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells. Development. 146 (5), 172361 (2019).
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
