Summary
يقدم هذا البروتوكول طريقة شاملة وفعالة لإنتاج عضويات الكلى من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) باستخدام ظروف ثقافة التعليق. يكمن التركيز الأساسي لهذه الدراسة في تحديد كثافة الخلايا الأولية وتركيز ناهض WNT ، مما يفيد الباحثين المهتمين بأبحاث الكلى العضوية.
Abstract
يمكن توليد عضويات الكلى من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) من خلال طرق مختلفة. هذه المواد العضوية تحمل وعدا كبيرا لنمذجة الأمراض ، وفحص الأدوية ، والتطبيقات العلاجية المحتملة. تقدم هذه المقالة إجراء خطوة بخطوة لإنشاء عضويات الكلى من iPSCs ، بدءا من الخط البدائي الخلفي (PS) إلى الأديم المتوسط المتوسط المتوسط (IM). يعتمد النهج على وسيط APEL 2 ، وهو وسيط محدد خال من المكونات الحيوانية. يتم استكماله بتركيز عال من ناهض WNT (CHIR99021) لمدة 4 أيام ، يليه عامل نمو الخلايا الليفية 9 (FGF9) / الهيبارين وتركيز منخفض من CHIR99021 لمدة 3 أيام إضافية. خلال هذه العملية ، يتم التركيز على اختيار كثافة الخلايا المثلى وتركيز CHIR99021 في بداية iPSCs ، حيث أن هذه العوامل ضرورية لتوليد عضوي الكلى بنجاح. أحد الجوانب المهمة لهذا البروتوكول هو ثقافة التعليق في لوحة منخفضة الالتصاق ، مما يسمح لل IM بالتطور تدريجيا إلى هياكل نيفرون ، تشمل الهياكل الكبيبية والأنبوبية القريبة والأنبوبية البعيدة ، وكلها مقدمة بتنسيق مفهوم بصريا. بشكل عام ، يقدم هذا البروتوكول التفصيلي تقنية فعالة ومحددة لإنتاج عضويات الكلى من iPSCs المتنوعة ، مما يضمن نتائج ناجحة ومتسقة.
Introduction
تلعب الكلية دورا مهما في الحفاظ على التوازن الفسيولوجي ، اعتمادا على وحدتها الوظيفية. يمكن للنيفرون ، الذي يفرز الفضلات ، تنظيم تكوين سوائل الجسم. مرض الكلى المزمن (CKD) ، الناجم عن طفرات وراثية أو عوامل أخرى عالية الخطورة ، سيتقدم في النهاية إلى المرحلة النهائية من مرض الكلى (ESKD) 1,2. يبدو أن ESKD يرجع إلى قدرة التجديد المحدودة للنيفرون. وبالتالي ، مطلوب العلاج ببدائل الكلى. يتيح التمايز الموجه ل iPSCs البشرية الجيل في المختبر من عضويات الكلى ثلاثية الأبعاد الخاصة بالمريض ، والتي يمكن استخدامها لدراسة نمو الكلى ، ونمذجة الأمراض الخاصة بالمريض ، وإجراء فحص الأدوية السامة للكلية 3,4.
أثناء التطور الجنيني ، تنشأ الكلى من الأديم المتوسط المتوسط (IM) ، والذي يختلف عن الخط البدائي (PS). قد يؤدي مسار إشارات WNT الكلاسيكي إلى تمايز إضافي للمراسلة الفورية بمشاركة منسقة من FGF (FGF9 ، FGF20) و BMP (إشارات Bmp7 من خلال JNK) 5،6،7. أنها تنتج مجموعتين مهمتين من الخلايا السلفية الكلوية (NPC): برعم الحالب (UB) ، واللحمة المتوسطة metanephric (MM) ، وتشكيل القنوات الجامعة والنيفرون ،على التوالي 8,9. يتكون كل نفرون من شرائح كبيبية وأنبوبية ، مثل الأنابيب القريبة والبعيدة ، وحلقة Henle10,11. وفقا للنظرية المذكورة أعلاه ، تحاكي البروتوكولات المنشورة حاليا شلالات الإشارة وتحفيز عامل النمو للحث على عضويات الكلى 5,12.
على مدى السنوات العديدة الماضية ، تم تطوير العديد من البروتوكولات للتمييز بين iPSCs البشرية إلى عضويات الكلى5،6،7،12. قام Takasato et al.7 بتحسين مدة علاج CHIR (ناهض WNT) قبل استبداله ب FGF9. وفقا لبروتوكولهم ، فإن التعرض ل CHIR لمدة 4 أيام ، متبوعا ب FGF9 لمدة 3 أيام ، هو الطريقة الأكثر فعالية للحث على المراسلة الفورية من iPSCs. تم استخدام مرشحات Transwell كشكل للثقافة في إجراءاتهم. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة صعبة للمبتدئين. لذلك ، حاول Kumar et al.13 تغيير تنسيق الثقافة واختار تعليق الثقافة. قاموا بفصل الخلايا الملتصقة في اليوم 7 للبذر في صفائح منخفضة الالتصاق لمساعدتها على التجمع في أجسام جنينية (EBs) تحتوي على هياكل تشبه النيفرون. ومع ذلك ، كان تأثير الدفعة لهذه الطرق واضحا ، خاصة في iPSCs المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، ذكرت الأدبيات المختلفة أن تركيز CHIR يتراوح من 7 ميكرومتر إلى 12 ميكرومتر5،13،14.
لقد تكهننا بأن تركيز كثافة الخلايا و CHIR قد يؤثران على توليد المواد العضوية في iPSCs المختلفة ، وقد تم التحقق من ذلك عدة مرات في تجاربنا. وقد عدل البروتوكول الحالي قليلا طريقة دراسة كومار وآخرون.13 وزود المستخدمين بإجراء تدريجي. يظهر الجدول الزمني والتخطيطي للنهج في الشكل 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على iPSCs المستخدمة في هذه الدراسة من مصدر تجاري. تم الحفاظ على الخلايا بوسط mTeSR على ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء القاع المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد). يحتوي الجدول 1 على جميع التراكيب المتوسطة المستخدمة في الدراسة.
1. طلاء iPSCs للتمايز وإحداث خط بدائي خلفي (PS)
- اغسل iPSCs على لوحة 6 آبار مغلفة بمصفوفة الغشاء مع 2 مل DPBS. نضح DPBS باستخدام ماصة.
- أضف 1 مل من محلول فصل الخلايا المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) لفصل iPSCs واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- أضف 1 مل من mTeSR إلى iPSCs ، وتأكد من رفع الخلايا عن السطح البلاستيكي.
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 400 × غرام لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). أعد تعليق حبيبات الخلية واحسب رقم الخلية باستخدام مقياس الدم.
- قم بزرع مجموعة من كثافات الخلايا على صفيحة 24 بئرا أو 6 آبار مطلية بمصفوفة غشائية وثقافة مع mTeSR مكمل بمثبط كيناز Rho 10 μM (Y-27632) (انظر جدول المواد). استزرعهم طوال الليل في حاضنة CO2 37 درجة مئوية.
ملاحظة: للحث على PS ، يختلف التركيز الأمثل ل CHIR99021 وكثافات الخلايا المناسبة من خطوط iPSC المختلفة. قم بزرع مجموعة من الكثافات (على سبيل المثال ، 0.6 ، 0.9 ، 1.2 ، 1.5 ، 1.8 ، 2.4 * 103 خلايا مفردة لكل سنتيمتر مربع) ومجموعة من تركيز CHIR99021 من 7 ميكرومتر إلى 12 ميكرومتر. ابدأ في تمايز كل كثافة وكل CHIR في نفس اليوم. أوجد التركيز الأمثل CHIR99021 وكثافات الخلايا المناسبة في صفيحة 24 بئرا ثم قم بتوسيع الثقافة في ألواح 6 آبار. هنا نقدم بروتوكولا يعتمد على لوحة 6 آبار. - في اليوم التالي ، استنشاق mTeSR وغسل الخلايا مع 2 مل من DPBS.
- أضف 2 مل من وسط المرحلة الأولى (وسط تمايز الخلايا الجذعية الذي يحتوي على 8-12 ميكرومتر CHIR99021) (الجدول 1) ، يشار إليه باليوم 0.
- قم بزراعتها في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 4 أيام ، وقم بتحديث المرحلة الأولى المتوسطة كل يومين.
2. تحفيز الأديم المتوسط المتوسط كلوي المنشأ (IM)
- في اليوم 4 ، قم بإزالة المرحلة المتوسطة واغسلها ب 2 مل من DPBS.
- أضف 2 مل من وسط المرحلة الثانية إلى الخلايا (وسط تمايز الخلايا الجذعية الذي يحتوي على 200 نانوغرام / مل FGF9 ، 1 ميكروغرام / مل من الهيبارين ، و 1 ميكرومتر CHIR99021) (الجدول 1).
- قم بزراعتها في حاضنة 37 درجة مئوية ، وقم بتحديث الوسيط كل يومين حتى اليوم 7.
3. توليد عضويات الكلى في ثقافة التعليق
ملاحظة: خلال فترة المراقبة من اليوم 0 إلى اليوم 7 ، تكون حالة الخلايا حرجة. إذا أظهرت الخلايا توسعا ناجحا وتراكمت دون حطام خلوي كبير ، فهذا يدل على الاشتقاق الناجح للأديم المتوسط الوسيط (IM) ، مما يشير إلى الاستعداد للمضي قدما إلى المرحلة التالية. ومع ذلك ، إذا أظهرت الخلايا علامات موت الخلايا المبرمج الأولي ، متبوعا بالنخر أو الكسر ، فقد يكون ذلك مؤشرا على تركيزات غير مناسبة من CHIR99021 أو كثافات الخلايا.
- في اليوم 7 ، قم بإزالة وسط المرحلة الثانية واغسل الخلايا ب 2 مل من DPBS.
- أضف 1 مل من محلول انفصال الخلايا إلى كل بئر واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق حتى تنكسر الخلايا تحت تباين الطور.
- ماصة 1 مل من المرحلة الثانية المتوسطة إلى الخلايا ، اخلطها وتأكد من رفع الخلايا عن السطح.
- اجمع تعليق الخلية في أنبوب سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 2 مل من وسط المرحلة الثالثة (وسط تمايز الخلايا الجذعية الذي يحتوي على 200 نانوغرام / مل FGF9 ، 1 ميكروغرام / مل من الهيبارين ، و 1 ميكرومتر CHIR99021 في 0.1٪ ميثيل سلولوز (MC) ، 0.1٪ كحول بولي فينيل (PVA)) مكمل بمثبط كيناز Rho 10 ميكرومتر (Y-27632) (انظر جدول المواد). امزجه بلطف.
- امزج معلق الخلية والبذور في صفيحة منخفضة الالتصاق ذات 6 آبار بنسبة 1: 3. ضع اللوحة على شاكر مداري (مقاومة CO 2 ، تدور عند 60 دورة في الدقيقة) في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- بعد 24 ساعة ، قم بإزالة مثبط Rho kinase (Y-27632) وإضافة وسائط المرحلة الثالثة (مكمل متوسط تمايز الخلايا الجذعية مع 200 نانوغرام / مل FGF9 ، 1 ميكروغرام / مل هيبارين ، 1 ميكرومتر CHIR99021 ، 0.1٪ MC ، 0.1٪ PVA). ثقافة لمدة 2 أيام. قم بتغيير الوسيط في ثقافة التعليق باتباع الخطوات التالية:
- قطع طرف ماصة 1 مل مع مقص معقمة.
- هز برفق لوحة 6 آبار لترتيب المواد العضوية في منتصف اللوحة.
- نضح المواد العضوية مع الماصات المعدة في أنبوب 15 مل واتركها تقف لمدة 5 دقائق.
- نضح الطافد واترك المواد العضوية في أسفل الأنبوب.
- أضف الوسط الطازج لإعادة تعليق المواد العضوية وإعادة الطلاء مرة أخرى إلى لوحة منخفضة الالتصاق ذات 6 آبار.
- استمر في هز لوحة الالتصاق المنخفضة عند 60 دورة في الدقيقة في الحاضنة. قم بتغيير المرحلة الثالثة المتوسطة كل يومين حتى اليوم 12.
- في اليوم 12 ، قم بتغيير الوسيط إلى وسط المرحلة الرابعة (وسط تمايز الخلايا الجذعية الذي يحتوي على 0.1٪ MC و 0.1٪ PVA).
- قم بتغيير الوسيط كل يومين حتى اليوم 25. يمكن أن تتطور الكائنات العضوية تدريجيا إلى هياكل نيفرون ناضجة من اليوم 12-25.
4. تلطيخ المناعي لعضويات الكلى
- اجمع عضويات الكلى في أنبوب سعة 15 مل واغسلها ب 2 مل من برنامج تلفزيوني.
- بعد السماح لها بالتثبيت لمدة 5-10 دقائق ، ثبت عضويات الكلى في 2٪ PFA طازجة لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة PFA واغسل المواد العضوية ب 1 مل PBS تحتوي على 0.3٪ Triton X-100 (0.3٪ PBST) ، رجها بالتساوي على شاكر (بسرعة دوران لا تتجاوز 60 دورة في الدقيقة) لمدة 8 دقائق ، واتركها تقف لمدة 5 دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية. كرر ثلاث مرات.
ملاحظة: يمكن تخزين المواد العضوية في 0.3٪ PBST عند 4 درجات مئوية لمدة 2-4 أسابيع. - احتضان المواد العضوية الثابتة مع مصل الحمير 10٪ في PBST (حاجز الحظر) (انظر جدول المواد) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- تمييع الأجسام المضادة الأولية (المدرجة في جدول المواد) في مخزن مؤقت مانع بنسبة 1: 300.
- احتضان الكائنات العضوية بالأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الإثارة.
ملاحظة: تأكد من أن الكبيبات والأنابيب يمكن تلطيخها في وقت واحد على عضوي واحد. - اغسل المواد العضوية ب 1 مل 0.3٪ PBST ، وقم برجها بالتساوي على شاكر (بسرعة دوران لا تتجاوز 60 دورة في الدقيقة) لمدة 8 دقائق ، واتركها لمدة 5 دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية. كرر ثلاث مرات.
- احتضان الكائنات العضوية بالأجسام المضادة الثانوية (المدرجة في جدول المواد) و DAPI طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الإثارة. ثم كرر الخطوة 4.7.
ملاحظة: يتم تخفيف كل من الجسم المضاد الثانوي و DAPI في محلول مانع ، والجسم المضاد الثانوي (1: 400) و DAPI (1: 1000). - بعد التلوين ، قم بتجفيف المواد العضوية بالميثانول (25٪ ، 50٪ ، 75٪ ، و 100٪ لمدة 5 دقائق لكل منهما) ، ثم تخللها كحول البنزيل وبنزوات البنزيل (BABB ، نسبة 1: 2) (انظر جدول المواد) لمدة 5 دقائق.
- قم بتحريك المواد العضوية التي تم تطهيرها على طبق ذو قاع زجاجي (انظر جدول المواد) وافحصها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر.
ملاحظة: عند التصوير ، اختر طبق بتري في أسفل الطبق الزجاجي ، وعند التخلل ، ضع BABB مباشرة في طبق بتري للحفاظ على رطوبة قاع الطبق.
5. في المختبر مقايسة امتصاص ديكستران
- في اليوم 25 ، احتضان الكائنات العضوية ب 100 ميكروغرام / مل من ديكستران المسمى بالتألق (انظر جدول المواد) لمدة 4 ساعات في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- بعد 4 ساعات ، قم بالتبديل إلى وسيط جديد والتقط صورا لزراعة الخلايا الحية باستخدام مجهر مضان واسع المجال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم تحقيق إنتاج IM عن طريق تنشيط إشارات WNT المتعارف عليها باستخدام مثبط GSK3 CHIR99021 ، يليه FGF9 / الهيبارين. من اليوم 0 إلى اليوم 4 ، تتوسع iPSCs بسرعة وتتخذ أشكالا معينية أو مثلثة. يصل التقاء 90٪ -100٪ ويتراكم بالتساوي حتى اليوم 7. عند ثقافة التعليق ، تشكل الركام تلقائيا هياكل النيفرون بعد الانفصال في اليوم 7. تعرض عضويات الكلى التي تم إنشاؤها من خلال ثقافة التعليق هياكل تشبه الأنبوب ويمكن ملاحظتها بسهولة في صور المجال الساطع بعد 18 يوما من التجميع (الشكل 2 والشكل 3).
عادة ، ينتج عن اختبار واحد يبدأ من بئر صفيحة 24 بئرا من iPSCs 200-300 عضوي. من بين هذه ، 80 ٪ -90 ٪ تحتوي على هياكل تشبه النيفرون (الشكل 2). بالنسبة لخط hiPSC-B1 iPSC ، تتضمن أفضل الظروف لتوليد عضويات الكلى زراعة 1.8-2.0 × 10 4 خلايا من بئر صفيحة 24 بئرا مع 8 ميكرومتر CHIR99021 (الشكل 2 ، الشكل 3 ، والشكل 4). يمكن الحفاظ على هذه المواد العضوية في الكلى لمدة تصل إلى 1-2 أسابيع بعد اليوم 25 عن طريق تغيير وسط المرحلة الرابعة كل 2-3 أيام.
يكشف تحليل التألق المناعي للعضويات بأكملها عن وجود شرائح نيفرون ، بما في ذلك NPHS1- و Synaptopodin (SYNAPO-) و WT1 المسمى podocytes ، والخلايا الخلالية المسمى MEIS1 / 2/3 ، و Lotus Tetragonolobus Lectin (LTL-) المسمى الأنابيب القريبة ، و E-Cadherin (ECAD-) المسمى الأنابيب البعيدة ، وقنوات التجميع التي تحمل علامة GATA3. علاوة على ذلك ، يحفز هذا البروتوكول الخلايا البطانية التي تظهر تلطيخا إيجابيا مع CD31 (الشكل 5).
أخيرا ، تشير فحوصات امتصاص ديكستران في المختبر إلى الوظائف ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية لعضويات الكلى. بعد احتضان عضويات الكلى (اليوم 7 + 18) مع 100 ميكروغرام / مل من ديكستران المسمى بالتألق لمدة 4 ساعات ، لوحظ أن ديكستران يؤخذ إلى الأنابيب القريبة في صور المجال الساطع (الشكل 5L والشكل 6).
الشكل 1: الجدول التجريبي ونظرة عامة على البروتوكول. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: توليد عضويات الكلى من اليوم 0 إلى اليوم 7 باستخدام تركيزات مختلفة من CHIR99021. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: توليد عضويات الكلى من اليوم 8 إلى اليوم 21 باستخدام تركيزات مختلفة من CHIR99021. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الصور التي تم التقاطها في اليوم 7 لكثافات الخلايا المختلفة من 1.5 × 10 4 إلى 2.2 × 104 خلايا / بئر. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: صور تألق مناعي متحد البؤر تمثيلية لعضويات الكلى. (أ ، ب) تحليل التألق المناعي لعلامات السلف النيفرون (SALL1 ، أزرق) ، الركام قبل الأنبوبي (PAX8 ، أرجواني) ، podocyte (NPHS1 ، أزرق) من عضويات الكلى D7 + 11. (سي - ك) يظهر تحليل التألق المناعي للأنماط المجزأة في الكائنات العضوية وجود خلايا بودوسيتات (NPHS1 و NPHS2 و SYNAPO و WT1 ، أحمر. MAFB ، أخضر) ، الأنابيب القريبة (LTL ، أبيض ؛ LRP2 ، أزرق ؛ CUBN ، أحمر) ، الأنابيب البعيدة (ECAD ، الأخضر) ، قنوات التجميع (GATA3 ، الوردي) ، الخلايا المتوسطة (PDGFR ، الأحمر) ، الخلايا الخلالية (MEIS1 / 2/3 ، الأخضر) ، Integrin beta 1 (TIGB1 ، الأخضر) والخلايا البطانية (CD31 ، الأخضر). قضبان المقياس: 100 ميكرومتر (A ، C ، E-J) ، 50 ميكرومتر (B) ، و 10 ميكرومتر (D ، K). (L) تحليل التألق المناعي لعضويات الكلى بعد مقايسة تحديث ديكستران. شريط المقياس: 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: التحقق الوظيفي في المختبر من عضويات الكلى في اليوم 25. (أ-د) صور حية لعضويات الكلى المحتضنة بديكستران المسمى بالفلورة من 10 كيلو دالتون. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر (أ ، ب) ؛ 10 ميكرومتر (C ، D). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الكاشف | الأسهم conc. | العمل conc. |
مرحلة  متوسط |
||
| أبيل | غير متوفر | غير متوفر |
| شير 99021 | 10 ميكرومتر | 4-12 ميكرومتر |
مرحلة  متوسط |
||
| أبيل | غير متوفر | غير متوفر |
| إف جي إف 9 | 100 نانوغرام / ميكرولتر | 200 نانوغرام / مل |
| rHSA | 0.2 جم / مل | 1 ميكروغرام / مل |
| الهيبارين | 2 ملغ/مل | 1 ميكروغرام / مل |
| شير 99021 | 10 ميكرومتر | 1 ميكرومتر |
مرحلة  متوسط |
||
| أبيل | غير متوفر | غير متوفر |
| إف جي إف 9 | 100 نانوغرام / ميكرولتر | 200 نانوغرام / مل |
| rHSA | 0.2 جم / مل | 1 ميكروغرام / مل |
| الهيبارين | 2 ملغ/مل | 1 ميكروغرام / مل |
| شير 99021 | 10 ميكرومتر | 1 ميكرومتر |
| بولا | 1% | 0.10% |
| مولودية | 1% | 0.10% |
مرحلة  متوسط |
||
| أبيل | غير متوفر | غير متوفر |
| بولا | 1% | 0.10% |
| مولودية | 1% | 0.10% |
جدول 1: التراكيب المتوسطة المستخدمة في الدراسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم وصف بروتوكول مفصل لتوليد عضويات الكلى من iPSCs ، بما في ذلك تعديلات طفيفة على الوسط القاعدي ، وكثافة الخلية الأولية ، وتركيز CHIR99021. في تجارب مختلفة ، تم العثور على العوامل الحاسمة لتوليد عضوي ناجح في الكلى لتكون التمايز الأولي للأديم المتوسط المتوسط (IM) وحالة الخلية في اليوم 7. علاوة على ذلك ، أظهرت خطوط iPSC المختلفة اختلافات في تكاثر الخلايا وإمكانية التمايز ، مما أدى إلى اختلاف كثافة الخلايا المثلى وتركيزات CHIR990215،13،14. وبالتالي ، فإن تحديد الظروف المثالية لكل خط iPSC أمر ضروري لإنتاج عدد كبير من عضويات الكلى من iPSCs الخاصة بالمريض.
لتحديد الظروف المثلى ، يوصى بإجراء تجارب أولية باستخدام ألواح 24 بئرا قبل توسيع نطاق الاستزراع إلى ألواح 6 آبار للإنتاج على نطاق أوسع. تسمح هذه الخطوة للباحثين بتقييم نجاح الحث بناء على مورفولوجيا الخلية وكميتها. علاوة على ذلك ، يمكن الحفاظ على المواد العضوية في هيكلها الكامل لمدة 2-4 أسابيع بعد التثبيت ، مما يعزز جدوى وفائدة هذه الطريقة.
عادة ما تقيس عضويات الكلى المتولدة باستخدام هذا البروتوكول حوالي 50-300 ميكرومتر وتظهر هياكل تشبه الأنبوب عند ملاحظتها تحت المجهر الميداني الساطع. يؤكد التحليل المناعي الفلوري التكوين الموثوق به لنفرون الكلى ، مثل الخلايا الصخرية الموسومة ب NPHS1 و WT1 ، والأنابيب القريبة الموسومة ب LTL و LRP2 و CUBN ، والأنابيب البعيدة الموسومة ب ECAD ، وقنوات التجميع الموسومة ب GATA3 ، والخلايا الخلالية الموسومة ب MEIS1 / 2/313. بالإضافة إلى ذلك ، يحفز هذا البروتوكول وجود خلايا بطانية ملطخة ب CD31 ، مما يشير إلى إمكانية الأوعية الدموية داخل عضويات الكلى.
تظهر مقايسات امتصاص ديكستران في المختبر الوظائف ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية لعضويات الكلى ، مثل الترشيح الأولي وإعادة الامتصاص. هذا يجعلها مناسبة للغاية لنمذجة المرض ودراسة آليات الخلل الوظيفي. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن نضج هذه الكائنات العضوية في الكلى يشبه الكلى البشرية في الأثلوث الأول ، وأنها تفتقر إلى الأوعية الدموية في الثقافة في المختبر 13. هناك حاجة إلى مزيد من البحث لتوضيح الآليات الأساسية.
في الختام ، يقدم البروتوكول الموصوف طريقة واعدة لتوليد عضويات الكلى من iPSCs ، مما يوفر وسيلة لمزيد من البحث والدراسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لم يبلغ المؤلفون عن أي تضارب محتمل في المصالح.
Acknowledgments
نحن ممتنون للغاية لجميع أعضاء مختبر ماو وهيو ، في الماضي والحاضر ، للمناقشات الشيقة والمساهمات العظيمة في المشروع. نشكر المركز الوطني للبحوث السريرية لصحة الطفل على الدعم الكبير. تم دعم هذه الدراسة ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (U20A20351 إلى جيانهوا ماو ، 82200784 إلى ليدان هو) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة تشجيانغ الصينية (No. LQ22C070004 إلى Lidan Hu) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة جيانغسو (المنح رقم. BK20210150 إلى جانج وانغ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #07920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
References
- Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
- Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease - a systematic review and meta-analysis. PLOS ONE. 11 (7), 0158765 (2016).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Morizane, R., Lam, A. Q., Freedman, B. S., Kishi, S., Valerius, M. T., Bonventre, J. V. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6 (1), 8715 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Mugford, J. W., Sipilä, P., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney. Developmental biology. 324 (1), 88-98 (2008).
- SaxOn, L., Sariola, H.
- Kobayashi, A., et al. Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development. Cell Stem Cell. 3 (2), 169-181 (2008).
- Boyle, S., et al. Fate mapping using Cited1-CreERT2 mice demonstrates that the cap mesenchyme contains self-renewing progenitor cells and gives rise exclusively to nephronic epithelia. Developmental Biology. 313 (1), 234-245 (2008).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15 (10), 613-624 (2019).
- Kumar, S. V., et al. Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells. Development. 146 (5), 172361 (2019).
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
