Summary
यह प्रोटोकॉल निलंबन संस्कृति स्थितियों का उपयोग करके प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) से किडनी ऑर्गेनोइड ्स के उत्पादन के लिए एक व्यापक और कुशल विधि प्रस्तुत करता है। इस अध्ययन का प्राथमिक जोर प्रारंभिक सेल घनत्व और डब्ल्यूएनटी एगोनिस्ट एकाग्रता के निर्धारण में निहित है, जिससे किडनी ऑर्गेनॉइड अनुसंधान में रुचि रखने वाले जांचकर्ताओं को लाभ होता है।
Abstract
किडनी ऑर्गेनोइड्स को विभिन्न दृष्टिकोणों के माध्यम से प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) से उत्पन्न किया जा सकता है। ये ऑर्गेनोइड रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग और संभावित चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए बहुत वादा करते हैं। यह लेख आईपीएससी से किडनी ऑर्गेनोइड बनाने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रक्रिया प्रस्तुत करता है, जो पश्चवर्ती आदिम लकीर (पीएस) से मध्यवर्ती मेसोडर्म (आईएम) तक शुरू होता है। दृष्टिकोण एपीईएल 2 माध्यम पर निर्भर करता है, जो एक परिभाषित, पशु घटक-मुक्त माध्यम है। यह 4 दिनों की अवधि के लिए डब्ल्यूएनटी एगोनिस्ट (CHIR99021) की उच्च सांद्रता के साथ पूरक है, इसके बाद फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर 9 (एफजीएफ 9)/हेपरिन और अतिरिक्त 3 दिनों के लिए CHIR99021 की कम सांद्रता होती है। इस प्रक्रिया के दौरान, आईपीएससी की शुरुआत में इष्टतम सेल घनत्व और CHIR99021 एकाग्रता का चयन करने पर जोर दिया जाता है, क्योंकि ये कारक सफल किडनी ऑर्गेनॉइड पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण पहलू एक कम अनुयायी प्लेट में निलंबन संस्कृति है, जिससे आईएम को धीरे-धीरे नेफ्रॉन संरचनाओं में विकसित होने की अनुमति मिलती है, जिसमें ग्लोमेरुलर, समीपस्थ ट्यूबलर और डिस्टल ट्यूबलर संरचनाएं शामिल हैं, जो सभी एक नेत्रहीन बोधगम्य प्रारूप में प्रस्तुत की जाती हैं। कुल मिलाकर, यह विस्तृत प्रोटोकॉल विभिन्न आईपीएससी से किडनी ऑर्गेनोइड का उत्पादन करने के लिए एक कुशल और विशिष्ट तकनीक प्रदान करता है, जो सफल और सुसंगत परिणाम सुनिश्चित करता है।
Introduction
किडनी अपनी कार्यात्मक इकाई के आधार पर शारीरिक होमियोस्टैसिस को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। नेफ्रॉन, जो अपशिष्ट उत्पादों को उत्सर्जित करते हैं, शरीर के तरल पदार्थों की संरचना को नियंत्रित कर सकते हैं। वंशानुगत उत्परिवर्तन या अन्य उच्च जोखिम वाले कारकों के कारण क्रोनिक किडनी रोग (सीकेडी), अंततः अंतिम चरण गुर्दे की बीमारी (ईएसकेडी) 1,2 में प्रगति करेगा। ईएसकेडी स्पष्ट रूप से नेफ्रॉन की सीमित पुनर्जनन क्षमता के कारण है। इस प्रकार, गुर्दे की प्रतिस्थापन चिकित्सा की आवश्यकता होती है। मानव आईपीएससी का निर्देशित भेदभाव रोगी-विशिष्ट 3 डी किडनी ऑर्गेनोइड्स की इन विट्रो पीढ़ी को सक्षम बनाता है, जिसका उपयोग गुर्दे के विकास का अध्ययन करने, रोगी-विशिष्ट बीमारियों को मॉडल करने और नेफ्रोटॉक्सिक दवा स्क्रीनिंग 3,4 करने के लिए किया जा सकता है।
भ्रूण के विकास के दौरान, गुर्दे मध्यवर्ती मेसोडर्म (आईएम) से उत्पन्न होते हैं, जो आदिम लकीर (पीएस) से अलग होता है। शास्त्रीय डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग मार्ग एफजीएफ (एफजीएफ 9, एफजीएफ 20) और बीएमपी (जेएनके के माध्यम से बीएमपी 7 सिग्नलिंग) 5,6,7 की समन्वित भागीदारी के साथ आईएम के अतिरिक्त भेदभाव को प्रेरित कर सकता है। वे नेफ्रिक पूर्वज कोशिकाओं (एनपीसी) की दो महत्वपूर्ण कोशिका आबादी का उत्पादन करते हैं: मूत्रवाहिनी कली (यूबी), और मेटानेफ्रिक मेसेनचाइम (एमएम), क्रमशः 8,9 एकत्र नलिकाओं और नेफ्रॉन का निर्माण करते हैं। प्रत्येक नेफ्रॉन में ग्लोमेरुलर और ट्यूबलर खंड होते हैं, जैसे कि समीपस्थ और डिस्टल नलिकाएं, और हेनले10,11 का लूप। ऊपर उल्लिखित सिद्धांत के अनुसार, वर्तमान में प्रकाशित प्रोटोकॉल किडनी ऑर्गेनोइड्स 5,12 को प्रेरित करने के लिए सिग्नल कैस्केड और विकास कारक उत्तेजना की नकल करते हैं।
पिछले कई वर्षों में, मानव आईपीएससी को किडनी ऑर्गेनोइड्स 5,6,7,12 में अलग करने के लिए कई प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं। Takasato et al.7 ने FGF9 द्वारा प्रतिस्थापन से पहले CHIR (WNT एगोनिस्ट) उपचार की अवधि को अनुकूलित किया। उनके प्रोटोकॉल के अनुसार, 4 दिनों के लिए सीएचआईआर एक्सपोजर, उसके बाद 3 दिनों के लिए एफजीएफ 9, आईपीएससी से आईएम को प्रेरित करने का सबसे प्रभावी तरीका है। ट्रांसवेल फिल्टर को उनकी प्रक्रिया में संस्कृति प्रारूप के रूप में उपयोग किया गया था; हालांकि, यह विधि शुरुआती लोगों के लिए मुश्किल है। इसलिए, कुमार एट अल .13 ने संस्कृति प्रारूप को बदलने की कोशिश की और संस्कृति को निलंबित करने का विकल्प चुना। उन्होंने 7 वें दिन अनुयायी कोशिकाओं को कम अनुगामी प्लेटों में बीज बोने के लिए अलग कर दिया ताकि उन्हें भ्रूण के शरीर (ईबी) में इकट्ठा करने में मदद मिल सके जिसमें नेफ्रॉन जैसी संरचनाएं होती हैं। हालांकि, इन विधियों का बैच प्रभाव स्पष्ट था, खासकर विभिन्न आईपीएससी में। इसके अतिरिक्त, विभिन्न साहित्य ों ने बताया कि सीएचआईआर की एकाग्रता 7 μM से 12 μM 5,13,14 तक भिन्न होती है।
हमने अनुमान लगाया कि सेल घनत्व और सीएचआईआर की एकाग्रता विभिन्न आईपीएससी में ऑर्गेनोइड ्स की पीढ़ी को प्रभावित कर सकती है, और यह हमारे प्रयोगों में कई बार सत्यापित किया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल ने कुमार एट अल.13 की अध्ययन विधि को थोड़ा संशोधित किया है और उपयोगकर्ताओं को चरण-दर-चरण प्रक्रिया प्रदान की है। दृष्टिकोण की अनुसूची और योजनाबद्ध चित्र 1 में दिखाए गए हैं।
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Protocol
वर्तमान अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले आईपीएससी एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किए गए थे। कोशिकाओं को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों पर एमटीईएसआर माध्यम के साथ बनाए रखा गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। तालिका 1 में अध्ययन में उपयोग की जाने वाली सभी मध्यम रचनाएं शामिल हैं।
1. पश्चवर्ती आदिम लकीर (पीएस) को विभेदन और उत्प्रेरण के लिए आईपीएससी चढ़ाना।
- 2 एमएल डीपीबीएस के साथ झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित 6-वेल प्लेट पर आईपीएससी धोएं। एक पिपेट का उपयोग करके डीपीबीएस को एस्पिरेट करें।
- आईपीएससी को अलग करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल डिटेचमेंट समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) के 1 एमएल जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- आईपीएससी में 1 एमएल एमटीईएसआर जोड़ें, और सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं ने प्लास्टिक की सतह से उठा लिया है।
- कमरे के तापमान (आरटी) पर 3 मिनट के लिए 400 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। सेल गोली को पुन: निलंबित करें और हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल नंबर की गणना करें।
- झिल्ली मैट्रिक्स और कल्चर के साथ लेपित 24-वेल या 6-वेल प्लेट पर सेल घनत्व की एक श्रृंखला को 10 μM Rho kinese अवरोधक (Y-27632) के साथ पूरक mTeSR के साथ बीज दें ( सामग्री की तालिका देखें)। उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस सीओ2 इनक्यूबेटर में रात भर कल्चर करें।
नोट: पीएस को प्रेरित करने के लिए, CHIR99021 की इष्टतम एकाग्रता और उपयुक्त सेल घनत्व विभिन्न आईपीएससी लाइनों से भिन्न होते हैं। घनत्व की एक श्रृंखला (जैसे, 0.6, 0.9, 1.2, 1.5, 1.8, 2.4 * 103 एकल कोशिकाएं प्रति वर्ग सेंटीमीटर) और 7 μM-12 μM से CHIR99021 की एकाग्रता की एक सीमा। एक ही दिन में प्रत्येक घनत्व और प्रत्येक CHIR का विभेदन शुरू करें। 24-वेल प्लेट में CHIR99021 की इष्टतम एकाग्रता और उपयुक्त सेल घनत्व का पता लगाएं और फिर 6-वेल प्लेटों में संस्कृति का विस्तार करें। यहां हम 6-वेल प्लेट के आधार पर एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। - अगले दिन, एमटीईएसआर को एस्पिरेट करें और 2 एमएल डीपीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
- चरण I माध्यम के 2 एमएल जोड़ें (स्टेम-सेल भेदभाव माध्यम जिसमें 8-12 μM CHIR99021) (तालिका 1), दिन 0 के रूप में संदर्भित करें।
- उन्हें 4 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कल्चर करें, हर दो दिनों में स्टेज 1 माध्यम को ताज़ा करें।
2. नेफ्रोजेनिक मध्यवर्ती मेसोडर्म (आईएम) को प्रेरित करना
- दिन 4 पर, चरण I माध्यम को हटा दें और डीपीबीएस के 2 मिलीलीटर से धो लें।
- कोशिकाओं में चरण II माध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें (स्टेम-सेल भेदभाव माध्यम जिसमें 200 ng / mL FGF9, 1 μg / mL हेपरिन, और 1 μM CHIR99021) (तालिका 1)।
- उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कल्चर करें, और दिन 7 तक हर 2 दिनों में माध्यम को ताज़ा करें।
3. निलंबन संस्कृति में किडनी ऑर्गेनोइड ्स उत्पन्न करना
नोट: दिन 0 से दिन 7 तक अवलोकन अवधि के दौरान, कोशिकाओं की स्थिति महत्वपूर्ण है। यदि कोशिकाएं सफल विस्तार प्रदर्शित करती हैं और महत्वपूर्ण सेल मलबे के बिना ढेर हो जाती हैं, तो यह मध्यवर्ती मेसोडर्म (आईएम) की सफल व्युत्पत्ति को प्रदर्शित करता है, जो अगले चरण में आगे बढ़ने की तत्परता का संकेत देता है। हालांकि, यदि कोशिकाएं प्रारंभिक एपोप्टोसिस के लक्षण दिखाती हैं, उसके बाद नेक्रोसिस या टूटना, तो यह CHIR99021 या सेल घनत्व की अनुचित सांद्रता का संकेत हो सकता है।
- 7 वें दिन, चरण II माध्यम को हटा दें और 2 एमएल डीपीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
- प्रत्येक कुएं में सेल डिटेचमेंट घोल के 1 एमएल जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाएं चरण कंट्रास्ट के तहत अपवर्तक न हों।
- चरण II के पिपेट 1 एमएल को कोशिकाओं में मिलाएं, मिलाएं, और सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं सतह से उठ गई हैं।
- सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- सतह पर तैरनेवाला को निकालें और चरण III माध्यम के 2 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें (स्टेम-सेल भेदभाव माध्यम जिसमें 200 एनजी / एमएल एफजीएफ 9, 1 μg / mL हेपरिन, और 1 μM CHIR99021 में 0.1% मिथाइलसेल्यूलोज (एमसी), 0.1% पॉलीविनाइल अल्कोहल (PVA)) 10 μM Rho kinese अवरोधक (Y-27632) के साथ पूरक है ( सामग्री की तालिका देखें)। इसे धीरे से मिलाएं।
- सेल सस्पेंशन और बीज को 1: 3 के अनुपात में 6-अच्छी तरह से कम आसंजन प्लेट में मिलाएं। प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर इनक्यूबेटर में ऑर्बिटल शेकर (सीओ2 प्रतिरोधी, 60 आरपीएम पर घूमना) पर रखें।
- 24 घंटे बाद, Rho kinese अवरोधक (Y-27632) को हटा दें और चरण III मीडिया (200 ng / mL FGF9, 1 μg / mL हेपरिन, 1 μM CHIR99021, 0.1% MC, 0.1% PVA के साथ स्टेम-सेल भेदभाव मध्यम पूरक) जोड़ें। दो दिनों के लिए संस्कृति। नीचे दिए गए चरणों का पालन करके निलंबन संस्कृति में माध्यम बदलें:
- सड़न रोकनेवाला कैंची से 1 एमएल पिपेट की नोक काट लें।
- प्लेट के बीच में ऑर्गेनोइड्स को व्यवस्थित करने के लिए 6-वेल प्लेट को धीरे से हिलाएं।
- तैयार पिपेट के साथ ऑर्गेनोइड्स को 15 एमएल ट्यूब में एस्पिरेट करें और उन्हें 5 मिनट तक खड़े रहने दें।
- सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें और ट्यूब के निचले भाग में ऑर्गेनोइड छोड़ दें।
- ऑर्गेनोइड्स को फिर से निलंबित करने के लिए ताजा माध्यम जोड़ें और 6-अच्छी तरह से कम-आसंजन प्लेट में वापस आ जाएं।
- इनक्यूबेटर में 60 आरपीएम पर कम-आसंजन प्लेट को हिलाना जारी रखें। चरण III माध्यम को 12 वें दिन तक हर दो दिन में बदलें।
- 12 वें दिन, मध्यम को चरण IV माध्यम में बदलें (स्टेम-सेल भेदभाव माध्यम जिसमें 0.1% एमसी और 0.1% पीवीए होता है)।
- 25 वें दिन तक हर दो दिनों में माध्यम बदलें। ऑर्गेनोइड ्स धीरे-धीरे 12-25 दिन से परिपक्व नेफ्रॉन संरचनाओं में विकसित हो सकते हैं।
4. किडनी ऑर्गेनोइड्स का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होना।
- 15 एमएल ट्यूब में किडनी ऑर्गेनोइड्स इकट्ठा करें और 2 एमएल पीबीएस से धो लें।
- इसे 5-10 मिनट के लिए सेट करने की अनुमति देने के बाद, किडनी ऑर्गेनोइड्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ताजा तैयार 2% पीएफए में ठीक करें।
- पीएफए को निकालें और 0.3% ट्राइटन एक्स -100 (0.3% पीबीएसटी) युक्त 1 एमएल पीबीएस के साथ ऑर्गेनोइड्स को धोएं, इसे 8 मिनट के लिए शेकर (रोटेशन गति 60 आरपीएम से अधिक नहीं) पर समान रूप से हिलाएं, इसे 5 मिनट तक खड़े रहने दें, और फिर सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। तीन बार दोहराएं।
नोट: ऑर्गेनोइड्स को 2-4 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.3% पीबीएसटी में संग्रहीत किया जा सकता है। - पीबीएसटी (ब्लॉकिंग बफर) में 10% गधे सीरम के साथ निश्चित ऑर्गेनोइड्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- प्राथमिक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध) को 1: 300 के अनुपात के साथ एक अवरुद्ध बफर में पतला करें।
- आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऑर्गेनोइड्स को इनक्यूबेट करें।
नोट: सुनिश्चित करें कि ग्लोमेरुली और नलिकाओं को एक ऑर्गनोइड पर एक साथ दाग दिया जा सकता है। - ऑर्गेनोइड्स को 1 एमएल 0.3% पीबीएसटी के साथ धोएं, इसे 8 मिनट के लिए शेकर (रोटेशन गति 60 आरपीएम से अधिक नहीं) पर समान रूप से हिलाएं, इसे 5 मिनट तक खड़े रहने दें, और फिर सतह पर तैरने वाला को हटा दें। तीन बार दोहराएं।
- ऑर्गेनोइड्स को द्वितीयक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध) और डीएपीआई के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन के साथ इनक्यूबेट करें। फिर चरण 4.7 दोहराएँ।
नोट: द्वितीयक एंटीबॉडी और डीएपीआई दोनों ब्लॉकिंग समाधान, द्वितीयक एंटीबॉडी (1: 400) और डीएपीआई (1: 1000) में पतला होते हैं। - धुंधला होने के बाद, मेथनॉल (प्रत्येक 5 मिनट के लिए 25%, 50%, 75%, और 100%) के साथ ऑर्गेनोइड को निर्जलित करें, फिर 5 मिनट के लिए बेंज़िल अल्कोहल और बेंज़िल बेंजोएट (बीएबीबी, 1: 2 अनुपात) ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ प्रवेश करें।
- साफ किए गए ऑर्गेनोइड्स को ग्लास-बॉटम डिश ( सामग्री की तालिका देखें) पर रखें और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा उनकी जांच करें।
नोट: इमेजिंग करते समय, ग्लास डिश के निचले भाग में पेट्री डिश चुनें, और परमीटिंग करते समय, डिश के निचले हिस्से को नम रखने के लिए बीएबीबी को सीधे पेट्री डिश में डालें।
5. इन विट्रो डेक्सट्रान अपटेक परख
- 25 वें दिन, 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेटर में 4 घंटे के लिए फ्लोरेसेंस-लेबल डेक्सट्रान (सामग्री की तालिका देखें) के 100 μg / mL के साथ ऑर्गेनोइड्स को इनक्यूबेट करें।
- 4 घंटे बाद, एक ताजा माध्यम पर स्विच करें और एक वाइड-फील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके लाइव सेल कल्चर छवियों को कैप्चर करें।
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Representative Results
आईएम का उत्पादन जीएसके 3 अवरोधक CHIR99021 का उपयोग करके कैननिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग को सक्रिय करके प्राप्त किया जाता है, इसके बाद एफजीएफ 9 / हेपरिन। दिन 0 से दिन 4 तक, आईपीएससी तेजी से विस्तार करते हैं और रोडमॉइड या त्रिकोणीय आकार लेते हैं। संगम 90% -100% तक पहुंचता है और 7 वें दिन तक समान रूप से जमा होता है। निलंबन संस्कृति पर, समुच्चय 7 वें दिन अलग होने के बाद अनायास नेफ्रॉन संरचनाओं का निर्माण करते हैं। निलंबन संस्कृति के माध्यम से बनाए गए गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स ट्यूबलर जैसी संरचनाओं को प्रदर्शित करते हैं और एकत्रीकरण के 18 दिनों के बाद उज्ज्वल क्षेत्र छवियों में आसानी से देखे जाते हैं (चित्रा 2 और चित्रा 3)।
आमतौर पर, आईपीएससी की 24-वेल प्लेट के कुएं से शुरू होने वाली एक परख 200-300 ऑर्गेनोइड ्स का उत्पादन करती है। इनमें से, 80% -90% में नेफ्रॉन जैसी संरचनाएं होती हैं (चित्रा 2)। HIPSC-B1 iPSC लाइन के लिए, किडनी ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए सबसे अच्छी स्थितियों में 8 μM CHIR99021 के साथ 24-वेल प्लेट के कुएं की 1.8-2.0 x 10 4 कोशिकाओं का संवर्धन शामिल है (चित्रा 2, चित्रा 3, और चित्रा 4)। इन किडनी ऑर्गेनोइड्स को हर 2-3 दिनों में चरण IV माध्यम को बदलकर 25 दिन के बाद 1-2 सप्ताह तक बनाए रखा जा सकता है।
पूरे ऑर्गेनोइड्स के इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण से नेफ्रॉन खंडों की उपस्थिति का पता चलता है, जिसमें एनपीएचएस 1-, सिनैप्टोपोडिन (सिनैपो-) और डब्ल्यूटी 1-लेबल पोडोसाइट्स, एमईआईएस 1/2/3-लेबल अंतरालीय कोशिकाएं, लोटस टेट्रागोनोलोबस लेक्टिन (एलटीएल-) लेबल समीपस्थ नलिकाएं, ई-कैडरिन (ईसीएडी-) लेबल डिस्टल नलिकाएं और जीएटीए 3-लेबल संग्रह नलिकाएं शामिल हैं। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल एंडोथेलियल कोशिकाओं को प्रेरित करता है जो सीडी 31 (चित्रा 5) के साथ सकारात्मक धुंधलापन दिखाते हैं।
अंत में, इन विट्रो डेक्सट्रान अपटेक परख गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स के शारीरिक रूप से प्रासंगिक कार्यों को इंगित करते हैं। 4 घंटे के लिए प्रतिदीप्ति-लेबल डेक्सट्रान के 100 μg / mL के साथ गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स (दिन 7 + 18) को इंजेक्ट करने के बाद, डेक्सट्रान को उज्ज्वल क्षेत्र छवियों (चित्रा 5 L और चित्रा 6) में समीपस्थ नलिकाओं में ले जाया जाता है।
चित्रा 1: प्रयोगात्मक अनुसूची और प्रोटोकॉल का अवलोकन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: CHIR99021 की विभिन्न सांद्रता का उपयोग करके दिन 0 से दिन 7 तक किडनी ऑर्गेनोइड ्स का उत्पादन। स्केल सलाखों: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: CHIR99021 की विभिन्न सांद्रता का उपयोग करके दिन 8 से दिन 21 तक किडनी ऑर्गेनोइड ्स का उत्पादन। स्केल सलाखों: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: 1.5 x 10 4 से 2.2 x 104 कोशिकाओं / कुएं तक विभिन्न सेल घनत्व के दिन 7 पर कैप्चर की गई छवियां। स्केल सलाखों: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स के प्रतिनिधि कॉन्फोकल इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। (ए, बी) डी 7 + 11 किडनी ऑर्गेनोइड्स के नेफ्रॉन पूर्वज (एसएएल 1, ब्लू), प्री-ट्यूबलर एग्रीगेट (पैक्स 8, मैजेंटा), पोडोसाइट्स (एनपीएचएस 1, ब्लू) के मार्करों के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण। (C-K) ऑर्गेनोइड्स में खंडित पैटर्निंग का इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण पोडोसाइट्स (एनपीएचएस 1, एनपीएचएस 2, सिनैपो और डब्ल्यूटी 1, लाल) की उपस्थिति को दर्शाता है; एमएएफबी, हरा), समीपस्थ नलिकाएं (एलटीएल, सफेद; एलआरपी 2, नीला; सीयूबीएन, लाल), डिस्टल नलिकाएं (ईसीएडी, हरा), एकत्रित नलिकाएं (जीएटीए 3, गुलाबी), मेसांगियल कोशिकाएं (पीडीजीएफआर, लाल), अंतरालीय कोशिकाएं (एमईआईएस 1/2/3, हरा), इंटीग्रिन बीटा 1 (टीआईजीबी 1, हरा) और एंडोथेलियल कोशिकाएं (सीडी 31, हरा)। स्केल बार: 100 μm (A, C, E-J), 50 μm (B), और 10 μm (D, K)। (एल) डेक्सट्रान अपडेट परख के बाद किडनी ऑर्गेनोइड्स का इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण। स्केल बार: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6: दिन 25 गुर्दे के ऑर्गेनोइड ्स का इन विट्रो कार्यात्मक सत्यापन। (A-D) 10 केडीए के फ्लोरेसेंस-लेबल डेक्सट्रान के साथ इनक्यूबेट किए गए किडनी ऑर्गेनोइड्स की लाइव छवियां। स्केल बार: 100 μm (A, B); 10 μm (C, D)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) | स्टॉक शंख। | काम करने वाला शंख। |
मंच  मध्यम |
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| APEL | n/a | n/a |
| CHIR 99021 | 10 μM | 4-12 μM |
मंच  मध्यम |
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| APEL | n/a | n/a |
| FGF9 | 100 ng/μL | 200 ng/mL |
| आरएचएसए | 0.2 g/mL | 1 μg/mL |
| हेपरिन | 2 mg/mL | 1 μg/mL |
| CHIR 99021 | 10 μM | 1 μM |
मंच  मध्यम |
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| APEL | n/a | n/a |
| FGF9 | 100 ng/μL | 200 ng/mL |
| आरएचएसए | 0.2 g/mL | 1 μg/mL |
| हेपरिन | 2 mg/mL | 1 μg/mL |
| CHIR 99021 | 10 μM | 1 μM |
| PVA | 1% | 0.10% |
| एम सी | 1% | 0.10% |
मंच  मध्यम |
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| APEL | n/a | n/a |
| PVA | 1% | 0.10% |
| एम सी | 1% | 0.10% |
तालिका 1: अध्ययन में उपयोग की जाने वाली मध्यम रचनाएं।
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Discussion
आईपीएससी से किडनी ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जिसमें बेसल माध्यम, प्रारंभिक सेल घनत्व और CHIR99021 की एकाग्रता में मामूली संशोधन शामिल हैं। विभिन्न प्रयोगों में, सफल किडनी ऑर्गेनॉइड पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण कारक मध्यवर्ती मेसोडर्म (आईएम) और 7 वें दिन कोशिका अवस्था का प्रारंभिक भेदभाव पाया गया। इसके अलावा, विभिन्न आईपीएससी लाइनों ने सेल प्रसार और भेदभाव क्षमता में भिन्नता ओं का प्रदर्शन किया, जिसके परिणामस्वरूप इष्टतम सेल घनत्व और CHIR99021 सांद्रता 5,13,14 थी। नतीजतन, रोगी-विशिष्ट आईपीएससी से पर्याप्त संख्या में किडनी ऑर्गेनोइड ्स का उत्पादन करने के लिए प्रत्येक आईपीएससी लाइन के लिए आदर्श स्थितियों का निर्धारण करना आवश्यक है।
इष्टतम स्थितियों की पहचान करने के लिए, बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए संस्कृति को 6-वेल प्लेटों तक बढ़ाने से पहले 24-वेल प्लेटों का उपयोग करके प्रारंभिक प्रयोग करने की सिफारिश की जाती है। यह कदम शोधकर्ताओं को कोशिका आकृति विज्ञान और मात्रा के आधार पर प्रेरण की सफलता का आकलन करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, ऑर्गेनोइड्स को निर्धारण के बाद 2-4 सप्ताह के लिए उनकी पूरी संरचना में संरक्षित किया जा सकता है, जिससे इस विधि की व्यवहार्यता और उपयोगिता बढ़ जाती है।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स आमतौर पर लगभग 50-300 μm मापते हैं और उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के तहत देखे जाने पर ट्यूबलर जैसी संरचनाओं का प्रदर्शन करते हैं। इम्यूनोफ्लोरोसेंट विश्लेषण गुर्दे के नेफ्रॉन के विश्वसनीय गठन की पुष्टि करता है, जैसे कि एनपीएचएस 1 और डब्ल्यूटी 1 के साथ लेबल किए गए पोडोसाइट्स, एलटीएल, एलआरपी 2 और क्यूबीएन के साथ लेबल समीपस्थ नलिकाएं, ईसीएडी के साथ लेबल किए गए डिस्टल नलिकाएं, जीएटीए 3 के साथ लेबल नलिकाएं एकत्र करना, और एमईआईएस 1/2/313 के साथ लेबल की गई अंतरालीय कोशिकाएं। इसके अतिरिक्त, यह प्रोटोकॉल सीडी 31 के साथ सना एंडोथेलियल कोशिकाओं की उपस्थिति को प्रेरित करता है, जो गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स के भीतर वैस्कुलराइजेशन की क्षमता का सुझाव देता है।
इन विट्रो डेक्सट्रान अपटेक परख गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स के शारीरिक रूप से प्रासंगिक कार्यों को प्रदर्शित करते हैं, जैसे कि प्रारंभिक निस्पंदन और पुन: अवशोषण। यह उन्हें रोग मॉडलिंग और शिथिलता के तंत्र का अध्ययन करने के लिए अत्यधिक उपयुक्त बनाता है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इन किडनी ऑर्गेनोइड्स की परिपक्वता पहली तिमाही मानव गुर्दे से मिलती-जुलती है, और इन विट्रो कल्चर13 में उनमें वाहिका की कमी है। अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने के लिए आगे के शोध की आवश्यकता है।
अंत में, वर्णित प्रोटोकॉल आईपीएससी से किडनी ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए एक आशाजनक विधि प्रदान करता है, जो आगे के शोध और अध्ययन के लिए एक अवसर प्रदान करता है।
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Disclosures
लेखकों ने हितों के संभावित टकराव की सूचना नहीं दी।
Acknowledgments
हम परियोजना में दिलचस्प चर्चा और महान योगदान के लिए सभी माओ और हू लैब सदस्यों, अतीत और वर्तमान के लिए बेहद आभारी हैं। हम महान समर्थन के लिए बाल स्वास्थ्य के लिए राष्ट्रीय नैदानिक अनुसंधान केंद्र को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (जियानहुआ माओ के U20A20351, लिदान हू के 82200784), चीन के झेजियांग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था । LQ22C070004 लिदान हू), और जियांग्सू प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान सं। BK20210150 गैंग वांग के लिए)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #07920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
References
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