Summary
In deze studie werd een nieuwe methode voor planta-genexpressie en genbewerking ontwikkeld, gemedieerd door Agrobacterium , in bamboe. Deze methode verbeterde de efficiëntie van de validatie van genfuncties in bamboe aanzienlijk, wat aanzienlijke implicaties heeft voor het versnellen van het proces van bamboeveredeling.
Abstract
Voor bamboe is een nieuwe planta-gentransformatiemethode ontwikkeld, die de noodzaak van tijdrovende en arbeidsintensieve eeltinductie- en regeneratieprocessen vermijdt. Deze methode omvat Agrobacterium-gemedieerde genexpressie via wonden en vacuüm voor bamboezaailingen. Het toonde met succes de expressie aan van exogene genen, zoals de RUBY reporter en het Cas9-gen , in bamboebladeren. De hoogste transformatie-efficiëntie voor de accumulatie van betalaïne in RUBY-zaailingen werd bereikt met behulp van de GV3101-stam, met een percentage van 85,2% na infectie. Hoewel het vreemde DNA niet integreerde in het bamboegenoom, was de methode efficiënt in het tot expressie brengen van de exogene genen. Verder is er ook een genbewerkingssysteem ontwikkeld met een inheemse reporter die deze methode gebruikt, waaruit een in situ mutant gegenereerd door het bewerkte bamboe violaxanthine de-epoxidase gen (PeVDE) in bamboebladeren, met een mutatiesnelheid van 17,33%. De mutatie van PeVDE resulteerde in verlaagde niet-fotochemische afschrikkingswaarden (NPQ) bij veel licht, die nauwkeurig kunnen worden gedetecteerd door een fluorometer. Dit maakt de bewerkte PeVDE een potentiële native reporter voor zowel exogene als endogene genen in bamboe. Met de verslaggever van PeVDE werd met succes een cinnamoyl-CoA-reductase-gen bewerkt met een mutatiesnelheid van 8,3%. Deze operatie vermijdt het proces van weefselkweek of eeltinductie, wat snel en efficiënt is voor het tot expressie brengen van exogene genen en endogene genbewerking in bamboe. Deze methode kan de efficiëntie van de verificatie van de genfunctie verbeteren en zal helpen bij het onthullen van de moleculaire mechanismen van belangrijke metabole routes in bamboe.
Introduction
Het onderzoek naar de genfunctie in bamboe is veelbelovend voor het geavanceerde begrip van bamboe en het ontsluiten van het potentieel voor genetische modificatie. Een effectieve manier hiervan kan worden bereikt door het proces van Agrobacterium-gemedieerde infectie in bamboebladeren, waarbij het T-DNA-fragment met exogene genen in de cellen wordt ingebracht, wat vervolgens leidt tot de expressie van de genen in de bladcellen.
Bamboe is een waardevolle en hernieuwbare grondstof met een breed scala aan toepassingen in productie, kunst en onderzoek. Bamboe heeft uitstekende houteigenschappen, zoals hoge mechanische sterkte, taaiheid, matige stijfheiden flexibiliteit1, die nu veel wordt gebruikt in een verscheidenheid aan huishoudelijke en industriële benodigdheden, waaronder tandenborstels, rietjes, knopen, wegwerpservies, ondergrondse pijpleidingen en koeltorenvullers voor thermische energieopwekking. Daarom speelt bamboeveredeling een cruciale rol bij het verkrijgen van bamboevariëteiten met uitstekende houteigenschappen voor het vervangen van kunststoffen en het verminderen van het gebruik van plastic, het beschermen van het milieu en het aanpakken van klimaatverandering, evenals het genereren van aanzienlijke economische waarde.
Traditionele bamboeveredeling staat echter voor uitdagingen vanwege de lange vegetatieve groeifase en de onzekere bloeiperiode. Hoewel er moleculaire veredelingstechnieken zijn ontwikkeld en toegepast op bamboeveredeling, is het proces van bamboegentransformatie tijdrovend, arbeidsintensief en gecompliceerd vanwege de eeltinductie- en regeneratieprocessen 2,3,4,5. Stabiele genetische transformatie vereist vaak Agrobacterium-gemedieerde methoden, waarbij weefselkweekprocessen zoals eeltinductie en regeneratie betrokken zijn. Bamboe heeft echter een laag vermogen tot eeltregeneratie, waardoor de toepassing van stabiele genetische transformatie in bamboe sterk wordt beperkt. Nadat Agrobacterium plantencellen heeft geïnfecteerd, komt het T-DNA-fragment de plantencellen binnen, waarbij de meeste T-DNA-fragmenten niet-geïntegreerd in de cellen blijven, wat resulteert in voorbijgaande expressie. Slechts een klein deel van de T-DNA-fragmenten integreert willekeurig in het chromosoom, wat leidt tot stabiele expressie. De voorbijgaande expressieniveaus vertonen een accumulatiecurve die kan variëren voor elk gen dat tot expressie wordt gebracht door een door Agrobacterium afgeleverd T-DNA. In de meeste gevallen treden de hoogste expressieniveaus 3-4 dagen na infiltratie op en nemen ze snel af na 5-6 dagen 6,7. Eerdere studies hebben aangetoond dat meer dan 1/3e van de mutaties in gen-bewerkte planten verkregen zonder selectiedruk voor resistentie afkomstig is van de voorbijgaande expressie van CRISPR/Cas9, terwijl de resterende minder dan 2/3e afkomstig is van stabiele expressie na DNA-integratie in het genoom8. Dit geeft aan dat T-DNA-integratie in het plantengenoom niet nodig is voor genbewerking. Bovendien remt selectiedruk voor resistentie de groei van niet-transgene cellen aanzienlijk, wat het regeneratieproces van geïnfecteerde explantaten rechtstreeks beïnvloedt. Daarom is het, door gebruik te maken van voorbijgaande expressie zonder selectiedruk voor resistentie in bamboe, mogelijk om niet-geïntegreerde expressie van exogene genen te bereiken en de genfunctie rechtstreeks in plantenorganen te bestuderen. Daarom kan een eenvoudige en tijdbesparende methode worden ontwikkeld voor exogene genexpressie en -bewerking in bamboe9.
De ontwikkelde exogene genexpressie- en genbewerkingsmethode wordt gekenmerkt door zijn eenvoud, kosteneffectiviteit en de afwezigheid van dure apparatuur of complexe procedures9. Bij deze methode werd het bamboe-endogene violaxanthine de-epoxidase-gen (PeVDE) gebruikt als verslaggever voor exogene genexpressie zonder selectiedruk. Dit komt omdat de bewerkte PeVDE in bamboebladeren het fotobeschermingsvermogen bij veel licht vermindert en een afname van de niet-fotochemische afschrikking (NPQ)-waarde vertoont, die kan worden gedetecteerd door middel van chlorofylfluorescentiebeeldvorming. Om de effectiviteit van deze methode aan te tonen, werd een ander bamboe-endogeen gen, het cinnamoyl-CoA-reductase-gen (PeCCR5)9, uitgeschakeld met behulp van dit systeem en genereerde met succes mutanten van dit gen. Deze techniek kan worden gebruikt voor de functionele karakterisering van genen die functies hebben in bamboebladeren. Door deze genen tijdelijk tot overexpressie te brengen in bamboebladeren, kunnen hun expressieniveaus worden verhoogd, of door genbewerking kan hun expressie worden verlaagd, waardoor stroomafwaartse genexpressieniveaus, bladfenotypes en productinhoud kunnen worden bestudeerd. Dit zorgt voor een efficiëntere en haalbaardere aanpak voor genfunctieonderzoek in bamboe. Deze techniek kan worden toegepast op de functionele karakterisering van genen die functioneren in bamboebladeren. Door deze genen tijdelijk tot overexpressie te brengen in bamboebladeren, kunnen hun expressieniveaus worden verhoogd, of door genbewerking kan hun expressie worden verlaagd, waardoor stroomafwaartse genexpressieniveaus, bladfenotypes en productinhoud kunnen worden bestudeerd. Bovendien is het belangrijk op te merken dat, als gevolg van uitgebreide polyploïdisatie, de meerderheid van commercieel belangrijke genen in bamboegenomen aanwezig zijn in meerdere kopieën, wat resulteert in genetische redundantie. Dit vormt een uitdaging voor het uitvoeren van multiplex genoombewerking in bamboe. Voorafgaand aan de toepassing van stabiele genetische transformatie- of genbewerkingstechnieken is het van cruciaal belang om genfuncties snel te valideren. Bij het aanpakken van het probleem van meerdere genkopieën, is een benadering het analyseren van transcriptoomexpressieprofielen om genen te identificeren die actief tot expressie worden gebracht tijdens specifieke stadia. Bovendien maakt het richten op de geconserveerde functionele domeinen van deze genkopieën het mogelijk om gemeenschappelijke doelsequenties te ontwerpen of meerdere doellocaties in dezelfde CRISPR/Cas9-vector op te nemen, waardoor deze genen gelijktijdig kunnen worden uitgeschakeld. Dit zorgt voor een efficiëntere en haalbaardere aanpak voor genfunctieonderzoek in bamboe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van bamboezaailingen
- Bereid zaailingen van moso-bamboe (Phyllostachys edulis) voor met zaden die zijn geoogst in Guilin, Guangxi, China. Begin met het weken van de zaden in water gedurende 2-3 dagen en zorg ervoor dat je het water dagelijks ververst. Maak vervolgens een substraat door aarde en vermiculiet te mengen in een verhouding van 3:1.
- Zaai de geweekte zaden in het substraat om te ontkiemen. Houd de zaailingen onder laboratoriumomstandigheden en houd de temperatuur tussen 18-25 °C. Zorg voor een fotoperiode van 16 uur licht/8 uur donker met een lichtintensiteit van 250-350 μmol/m2/s tijdens de lichtfase.
- Zorg voor een relatieve luchtvochtigheid van ongeveer 60%. Gebruik voor Agrobacterium-infectie zaailingen die 15 dagen oud zijn en een hoogte hebben van 2-10 cm, wat het beste stadium is voor transformatie.
LET OP: Omdat de bloei van bamboe onvoorspelbaar is, zijn zaden niet elk jaar beschikbaar. De zaden worden meestal 2-3 jaar bewaard bij 4 °C in een droge omgeving en kunnen nog steeds een levensvatbaarheid van meer dan 20% behouden.
2. Bereiding van plasmiden en Agrobacterium
- Plasmiden: Om het voorbijgaande expressie-effect te valideren, gebruikt u het pHDE-35S::RUBY-construct dat een zichtbaar reporter-gen bevat dat wordt aangedreven door de CaMV 35S-promotor 10. Gebruik voor het bewerken van genen het pCambia1300-Ubi::Cas9-construct, dat het Cas9-gen draagt dat wordt aangedreven door de maïs Ubi-promotor 11. Voeg de sgRNA-geleidingssequenties van PeVDE en andere doelgenen tussen de twee AarI-sites in het pCambia1300-Ubi::Cas9-construct 9 in.
- Plaats de CRISPR/Cas9-gids-RNA-sequenties tussen de twee AarI-restrictie-endonucleaseplaatsen van het pCambia1300-Ubi::Cas9-construct , inclusief PeVDE - en PeCCR5-doelgenen .
- Voeg GGCA toe aan het 5'-uiteinde van de 20-nucleotidesequentie en synthetiseer een enkelstrengs DNA-sequentie. Omgekeerd complement de 20-nucleotidesequentie en voeg AAAC toe aan het 5'-uiteinde, en synthetiseer vervolgens een andere enkelstrengs DNA-sequentie.
- Verdun beide enkelstrengs DNA-sequenties tot een concentratie van 10 nM/L in verdund water, meng grondig en verwarm gedurende 5 minuten bij 95 °C. Laat het mengsel afkoelen tot kamertemperatuur, wat resulteert in de vorming van dubbelstrengs adapters.
- Verbind de adapters met het lineaire pCambia1300-Ubi::Cas9-fragment verteerd door AarI-endonuclease met behulp van T4-DNA-ligase en sequentie van de geconstrueerde CRISPR/Cas9-vector om het gewenste gengerichte construct te verkrijgen.
- Om plasmiden om te zetten in Agrobacterium, gebruikt u de vries-dooimethode als volgt: Meng 1 μL van de plasmiden (concentratie: 10 - 1.000 ng/μL) met 100 μL Agrobacterium-competente cellen (translatie-efficiëntie: > 1 x 10 4 kolonievormende eenheden/μg) en meng ze voorzichtig. Leg het mengsel 5 minuten op ijs. Breng het mengsel over aan vloeibare stikstof gedurende 5 minuten.
- Ontdooi het mengsel in een waterbad van 37 °C gedurende 5 min. Voeg 500 μL Luria-Bertani (LB) medium toe aan het mengsel en incubeer het gedurende 2-3 uur op een schudincubator bij 28 °C bij 200 rpm. Introduceer de pHDE-35S::ROBY-plasmiden afzonderlijk in de AGL1-, GV3101-, LBA4044- en EHA105-stammen van Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens)12. Introduceer de CRISPR/Cas9-plasmiden in de GV3101-stam van A. tumefaciens.
- Kweek Agrobacterium in gistextractpepton (YEP) medium (10 g rundvleesextract, 10 g gistextract en 5 g NaCl per L) met de bijbehorende antibiotica (spectinomycine voor 35S::RUBY en kanamycine voor CRISPR/Cas9) bij 28 °C. De enkele kolonies werden 36-48 uur na de teelt waargenomen.
- Pluk de kolonies en breng ze over in vloeibaar YEP-medium (met bijbehorende antibiotica) voor verdere groei. Gebruik na 24-36 uur de primers van RUBY-F en RUBY-R (Tabel 1) om PCR uit te voeren om de succesvolle overdracht van plasmiden naar Agrobacterium te bevestigen.
- Breng 1 ml van de succesvol getransformeerde Agrobacterium over in 100 ml vers vloeibaar YEP-medium (met bijbehorende antibiotica) en laat het vervolgens een nacht groeien bij 28 °C tot een OD600 van 0,8.
- Centrifugeer de bacteriële suspensie bij 4.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, was de bacteriepellet eenmaal met suspensie infiltratiemedium (10 mM MgCl2 en 10 mM MES-KOH [pH 5,6]) en centrifugeer vervolgens opnieuw. Resuspendeer de bacteriekorrel in een suspensie-infiltratiemedium tot een OD600 van 0,6 voor bamboetransformatie.
3. Agrobacterium -gemedieerd in planta transformatiesysteem
- Bereid je voor op transformatie; Verwijder de zaailingen met wortels die aan de aarde vastzitten voorzichtig uit het substraat en zorg ervoor dat de wortels intact blijven. Wikkel de zaailingen in aluminiumfolie om vocht vast te houden en loslating van de grond te voorkomen (Figuur 1A).
- Breng de verpakte zaailingen gedurende 2 uur over naar een omgeving met een hogere luchtvochtigheid (relatieve luchtvochtigheid >90%) en een lagere verlichting (intensiteit minder dan 50 μmol/m2/s).
- Wikkel met een scherpe naald van een injectiespuit het bovenste deel van gekrulde onrijpe bladeren (ongeveer 1-2 cm van de bovenkant) van de bamboezaailingen een of twee keer op (zoals aangegeven door de rode driehoeken in figuur 1A).
- Dompel daarna het gewonde bovenste deel van de zaailingen in suspensies van Agrobacterium. Voer het hele proces, van verwonden tot onderdompelen in Agrobacterium snel uit, omdat de verse wond de inoculatie-efficiëntie verhoogt.
- Breng de zaailingen onmiddellijk over naar een vacuümkamer met een druk van 25-27 mmHg gedurende 2 minuten (Figuur 1B).
- Pak de zaailingen na het stofzuigen voorzichtig uit en plant ze opnieuw in het substraat. Zet de zaailingen gedurende 2 dagen in weinig licht of duisternis (<50 μmol/m2/s) met een hoge luchtvochtigheid (RV>90%) bij kamertemperatuur (18-25 °C). Kweek vervolgens de zaailingen onder normale groeiomstandigheden en geef ze elke 5-7 dagen water. Observeer hun fenotypes om materiaal te leveren voor volgende experimenten.
4. Ontwerpen van single guide RNA's (sgRNA's) voor genbewerking
- Identificeer een protospacer aangrenzend motief (PAM)-plaats in de buurt van een specifiek en geconserveerd domein van de doelgensequentie. Zorg ervoor dat de specifieke PAM-sequentie NGG is in dit CRISPR/Cas9-systeem. Controleer de specificiteit van de geselecteerde sequentie op het doel door een BlastN-zoekopdracht uit te voeren in de bamboegenoomdatabase. Zorg ervoor dat het sgRNA uniek is, vooral in het stroomopwaartse gebied en dicht bij de PAM 9,11.
OPMERKING: Deze vergelijking zal potentiële off-target sites in het genoom die worden beïnvloed door het genbewerkingsproces effectief verminderen. - Ontwerp twee sgRNA's (sgRNA-1 en sgRNA-2) op het eerste exon van het PeVDE-gen 13. Neem AgeI-restrictieplaatsen stroomopwaarts van de PAM in sgRNA-1 en XbaI-restrictieplaatsen stroomopwaarts van de PAM in sgRNA-2 op. Ontwerp één sgRNA op het vierde exon van het PeCCR5-gen , dat codeert voor het geconserveerde motief van KNWYCYGK. Dit motief is van cruciaal belang voor de katalyse van CCR's14.
- Ontwerp een 20-nucleotide-afstandssequentie naast de PAM-site. Deze afstandssequentie zal het Cas9-enzym naar de doellocatie leiden voor DNA-splitsing en daaropvolgende genbewerking.
OPMERKING: Het is raadzaam om een doelgebied stroomopwaarts van de splitsingsplaats van het endonuclease-enzym binnen de PAM-plaats te kiezen. Dit zal de validatie van de efficiëntie van genbewerking vergemakkelijken.
5. Primerontwerp en PCR
- Ontwerp handmatig specifieke primers voor amplificatie van de PeVDE- en PeCCR5-fragmenten . Ontwerp de stroomopwaartse en stroomafwaartse primers zo dat ze zich ten minste 100 bp buiten de doellocatie bevinden, met een lengteverschil van meer dan 100 bp om een duidelijke bandscheiding tijdens elektroforese mogelijk te maken. Ontwerp primers voor amplificatie van RUBY binnen de eerste 500 bp van het gen. Tabel 1 bevat een lijst van alle gebruikte primers.
- Gebruik een high-fidelity DNA-polymerase voor PCR. Gebruik in dit geval DNA-polymerase met hoge getrouwheid en efficiënte amplificatie bij het klonen van genen.
- Bereid het PCR-reactiemengsel als volgt: 5x buffer (Mg2+ Plus): 4 μL; dNTP-mengsel (elk 2,5 mM): 1,6 μL; Voorwaartse en achterwaartse primers (elk 10 pmol): elk 1 μL; bamboe genoom DNA (ongeveer 50 ng); DNA-polymerase (2,5 E/μL): 0,2 μL; Verdun water tot een totaal volume van 20 μL.
- Volg de PCR-bedrijfsomstandigheden: Initiële denaturatie bij 98 °C gedurende 5 minuten; Denaturatie bij 98 °C gedurende 10 s; Gloeien bij 56 °C gedurende 5 s; Verlenging bij 72 °C gedurende 30 s; Herhaal de denaturatie tot verlenging gedurende 32 cycli; Laatste verlenging bij 72 °C gedurende 5 min; Voor onbepaalde tijd op 4 °C houden.
OPMERKING: PCR-omstandigheden worden als voorbeeld gegeven en moeten mogelijk worden geoptimaliseerd voor specifieke toepassingen of doelen.
6. DNA-extractie, endonuclease-enzymvertering en sequencing
- Scheid het gebied met de laagste NPQ-waarden van verse bamboebladmessen met behulp van een schaar, zoals geïdentificeerd door de beeldvormende PAM-fluorometer (zie stap 7.4). Vries de bladmonsters in met vloeibare stikstof en breng de bevroren bladmonsters over in een vijzel. Maal de monsters met behulp van een stamper tot een fijn poeder en voeg tijdens het maalproces voldoende vloeibare stikstof toe. Deze stap helpt bij het vrijgeven van de cellulaire inhoud, inclusief DNA.
- Genoom-DNA extraheren uit het blad in poedervorm met behulp van de Cetyltrimethylammonium-ammoniumbromide (CTAB)-methode. Voeg 50 mg bladpoedermonsters toe aan 800 μL van een 2% CTAB-oplossing. Meng het monster grondig en incubeer het gedurende 30 minuten bij 65 °C, waarbij het om de 5 minuten zachtjes wordt geschud.
- Voeg een gelijk volume chloroform/isoamylalcohol (24:1, v/v) toe en schud het mengsel krachtig. Breng na het centrifugeren bij 8.000 g gedurende 8 minuten het supernatans over in een nieuwe buis.
- Voeg een gelijk volume chloroform/isoamylalcohol toe en herhaal stap 6.3. Voeg een gelijk volume ijskoude isopropanol toe en keer de buis meerdere keren om voordat u deze gedurende 30 minuten bij -20 °C plaatst. Na 5 minuten centrifugeren bij 8.000 x g de supernatant weggooien.
- Was de DNA-korrel 2x met 75% ethanol op 4 °C, los vervolgens op in 50 μL water.
- Amplificeer het genomische DNA met de doellocatie van de doelgenen van zowel wildtype als met Agrobacterium geïnfecteerde bamboebladeren met het protocol in stap 5.4.
- Voer de endonuclease-enzymvertering van de PCR-producten uit. Selecteer een specifiek enzym dat de gewenste restrictieplaatsen binnen de geamplificeerde DNA-fragmenten herkent. Gebruik AgeI en XbaI endonucleases voor de spijsvertering.
- Bereid een reactiemengsel bestaande uit AgeI of XbaI (20 eenheden/μL) - 1 μL, 1 μg PCR-producten, 10x buffer- 5 μL en voeg water toe tot een totaal volume van 50 μL. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
- Analyseer het aandeel verteerde DNA-fragmenten met behulp van gelelektroforese. Vergelijk de verteerde fragmenten van de wildtype en Agrobacterium-geïnfecteerde monsters om de efficiëntie van het bewerken van genen te beoordelen.
- Tag de transposase-adapter TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG en GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG sequenties naar het 5'-uiteinde van respectievelijk de voorwaartse en achterwaartse primers voor de versterking van PeVDE- en PeCCR5-fragmenten 9,15. Gebruik het protocol beschreven in stap 5.4 voor versterking. Bereid de PCR-producten (vóór de vertering) voor op diepe sequencing.
7. Meting van chlorofylfluorescentie van NPQ-waarden in bladeren
- Stel de bamboezaailingen voorafgaand aan de metingen gedurende 2 uur bloot aan een hoge lichtintensiteit van 1200 μmol/m2/s. Deze blootstelling verhoogt de hoeveelheid geabsorbeerd licht en activeert het fotoprotectiesysteem in de bladeren.
- Gebruik een beeldvormende PAM-fluorometer om de in vivo PS II chlorofylfluorescentie van bamboebladeren te meten. Stel de actinische lichtintensiteit in op 800 μmol/m2/s voor fluorescentiemetingen van 6 minuten. Breng gedurende deze periode elke 30 s een verzadigingspuls aan om chlorofylfluorescentiecurven te verkrijgen. De stabiele waarden van de curven worden gebruikt voor berekeningen13.
- Bereken de niet-fotochemische afschrikking (NPQ) met behulp van de formule:
NPQ = (F m - F m') / F m'
waarbij F m staat voor de maximale fluorescentie in de aan het donker aangepaste toestand, en Fm' voor de maximale fluorescentie in elke aan het licht aangepaste toestand. - Bewaak de NPQ-waarden via de visuele interface van de beeldvormingssoftware. De software maakt real-time analyse en weergave van de fluorescentiegegevens mogelijk, inclusief de NPQ-waarden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Agrobacterium-gemedieerd in planta genexpressie in bamboebladeren
Van het RUBY-reportergen is aangetoond dat het effectief is in het visualiseren van voorbijgaande genexpressie vanwege het vermogen om levendig rood betalaïne te produceren uit tyrosine10. In deze studie werd Agrobacterium-gemedieerde transformatie gebruikt om het exogene ROBIJN-gen tijdelijk tot expressie te brengen in bamboebladeren (Figuur 1). Op de 3e dag na infectie werd een rode verkleuring waargenomen in de onrijpe gevouwen bladeren, die levendiger werd op de 5edag nadat de bladeren zich hadden ontvouwd (blauwe driehoek, figuur 1C). Deze resultaten tonen aan dat Agrobacterium met succes de expressie van het exogene ROBIJN-gen in bamboebladeren heeft gemedieerd en dat er betalaïnesynthese heeft plaatsgevonden.
Bovendien werden vier stammen van Agrobacterium (AGL1, LBA4404, EHA105 en GV3101) vergeleken en ontdekten dat de GV3101-stam de meest significante accumulatie van betalaïne veroorzaakte in geïnfecteerde bamboebladeren, met het hoogste percentage van 85,2% van de zaailingen accumuleerde betalaïne na infectie, gevolgd door AGL1 (76,9%) en vervolgens EHA105 (49,1%) en LBA4404 (31,3%; Figuur 1D). Dit suggereert dat GV3101 de meest geschikte soort is voor dit doel. High-fidelity PCR werd uitgevoerd om te detecteren of het Agrobacterium-gemedieerde T-DNA-fragment was geïntegreerd in het bamboechromosoom. Na 40 PCR-cycli werden geen banden van het RUBY-gen gedetecteerd, wat aangeeft dat het T-DNA-fragment niet integreerde of in zo'n laag aantal was geïntegreerd dat het niet kon worden gedetecteerd. Deze resultaten concluderen dus dat deze genexpressie van voorbijgaande aard is.
Over het algemeen tonen deze bevindingen de haalbaarheid aan van Agrobacterium-gemedieerde transiënte in planta-genexpressie in bamboe met behulp van het RUBY-reportergen . De rode betalaïnekleur bleek echter onstabiel te zijn en verdween na 3 maanden infectie, wat aangeeft dat het voorbijgaande expressiesysteem niet stabiel is voor observatie op lange termijn.
In planta genbewerking van bamboe violaxanthine de-epoxidase gen (PeVDE)
Agrobacterium-gemedieerd in planta genexpressie is een voorbijgaande methode van genexpressie in bamboe. Om te onderzoeken of een voorbijgaand CRISPR/Cas9-systeem genbewerking in bamboebladeren zou kunnen bereiken, werd het belangrijkste enzym in de xanthofylcyclus van bamboe, violaxanthine de-epoxidase (PeVDE), geselecteerd als doelwit voor proefgenbewerking. Enkelvoudige gids-RNA's (sgRNA's) werden ontworpen op het eerste exon van het PeVDE-gen (sgRNA-1), dat restrictieplaatsen van AgeI stroomopwaarts van het protospacer-aangrenzende motief (PAM) bevat om de validatie van genbewerking te vergemakkelijken (Figuur 2A).
Het CRISPR/Cas9-construct met sgRNA-1 werd getransfecteerd in Agrobacterium om bamboebladeren te transformeren. Na infectie van de Agrobacterium met de CRISPR/Cas9-constructen die sgRNA-1 dragen gedurende 5 dagen, werden bamboezaailingen onderworpen aan een behandeling met veel licht en vervolgens werd chlorofylfluorescentieparameterdetectie uitgevoerd. Er werden bepaalde delen van bladbladen gevonden met lagere niet-fotochemische bluswaarden (NPQ) (Figuur 2B), wat aangeeft dat het fotoprotectievermogen van deze gebieden verminderd was bij intens licht. Aangezien het PeVDE-gen het vermogen heeft om overtollige geabsorbeerde lichtenergie af te voeren13, zijn deze gebieden met lagere NPQ-waarden waarschijnlijk de regio's waar het PeVDE-gen is bewerkt. Vervolgens werden enzymvertering en sequentieanalyse uitgevoerd van het PeVDE-genfragment in deze delen van de bladbladen (Figuur 2C-D) en er werd vastgesteld dat de mutatiesnelheid van sgRNA-1 17,33% was, wat aangeeft dat genbewerking succesvol was in deze gebieden van het PeVDE-gen.
Bovendien werd een andere sgRNA-targetingplaats, sgRNA-2, die een XbaI-restrictieplaats bevat, ontworpen op het eerste exon van PeVDE. Om de mogelijkheid van lange fragmentdeletie met dubbele sgRNA-targeting te onderzoeken, werd genbewerking op beide doellocaties uitgevoerd, wat resulteerde in lange fragmentdeletie (Figuur 2E).
Bewerkte PeVDE-mutant gebruikt als verslaggever in het transiënte genbewerkingssysteem
Of het PeVDE-sgRNA zou kunnen dienen als verslaggever in het transiënte genbewerkingssysteem werd onderzocht. Het cinnamoyl-CoA-reductase (PeCCR5)-gen (gen-ID: PH02Gene42984.t1) werd willekeurig geselecteerd om de PeVDE-reporter te evalueren. Eén sgRNA-doelwit voor PeCCR5 werd ontworpen in het geconserveerde motief op het vierde exon. Het CRISPR/Cas9-construct dat beide sgRNA's, PeVDE en PeCCR5 bevat, werd omgezet in bamboebladeren (Figuur 3A).
Na een Agrobacterium-infectie gedurende 30 dagen werden de zaailingen gedurende 20 minuten behandeld met licht met hoge intensiteit. Er werd waargenomen dat alleen de bladgebieden die voor het PeCCR5-gen waren bewerkt, geen effect hadden op de NPQ-waarden, terwijl de bladgebieden die werden getransfecteerd door sgRNA's van zowel PeVDE als PeCCR5 lagere NPQ-waarden vertoonden (Figuur 3B).
Vervolgens werd het PeCCR5-fragment uit de bladgebieden met lagere NPQ-waarden geamplificeerd en gesequenced en werd een mutatie-efficiëntie van 8,3% gevonden met behulp van diepe sequencing. Daarom diende de PeVDE-reporter met succes als een voorbijgaande genbewerkingsverslaggever en kan hij worden gebruikt om te screenen op genbewerking van andere endogene bamboegenen.
Over het algemeen tonen deze resultaten de haalbaarheid aan van het bewerken van bamboegenen met behulp van CRISPR/Cas9 in bamboe.
Figuur 1: In planta expressie van het RUBY-gen en betalaïne accumulatie in moso bamboebladeren . (A) Moso bamboe zaailingen gewikkeld in aluminiumfolie en klaar voor Agrobacterium infectie, met rode driehoeken die posities aangeven die zijn verwond door een scherpe naald van een spuit. (B) Vacuüminfiltratieproces van bamboezaailingen. (C) Accumulatie van betalaïne in bamboebladeren na 3 dagen infectie, waargenomen door fenotypische veranderingen. (D) Hier werden vier Agrobacterium-stammen , AGL1, LBA4404, EHA105 en GV3101 gemedieerde RUBY-gentransformatie in bamboebladeren uitgevoerd. GV3101 met de GFP-constructie werd gebruikt als negatieve controle. Dit cijfer is gewijzigd van9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: In planta expressie en genbewerking van het PeVDE-gen in bamboebladeren. (A) Locatie- en doelsequentie-informatie van sgRNA in het PeVDE-gen. Rode driehoeken geven de posities van de voorwaartse en achterwaartse primers aan voor fragmentversterking. (B) NPQ en ruwe beeldvorming van bamboebladeren na infectie. Getallen in de NPQ-afbeelding vertegenwoordigen NPQ-waarden in de monitor van de beeldvormingssoftware. (C) Elektroforeseresultaten van PeVDE-fragment voor en na de spijsvertering van leeftijdI. WT staat voor de niet-geïnfecteerde bladeren van het wildtype, en + en - vertegenwoordigen respectievelijk PeVDE-fragmenten met of zonder AgeI-vertering. (D) Diepe sequentieresultaten van het PeVDE-fragment in bladeren met een lagere NPQ-waarde. De rode, blauwe en grijze lettertypen in de sequenties vertegenwoordigen respectievelijk de doelsites, PAM en invoegingen. De rode streepjes geven verwijderde nucleotiden aan. (E) Sanger-sequentieresultaten van het PeVDE-fragment na bewerking door zowel sgRNA-1 als sgRNA-2. Dit cijfer is gewijzigd van9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: PeVDE sgRNA als verslaggever voor het screenen van genbewerking van PeCCR5. (A) Schematische weergave van CRISPR/Cas9-constructen die PeVDE- en PeCCR5-sgRNA's bevatten. (B) NPQ en ruwe afbeeldingen van bamboebladeren na infectie met de constructen in (A). Witte driehoeken geven gebieden aan met lagere NPQ-waarden. De regenboogkleur vertegenwoordigt de waarde van NPQ/4, waarbij rood overeenkomt met de minimumwaarde en paars overeenkomt met 1. (C) De rode, blauwe en grijze lettertypen in de sequenties vertegenwoordigen respectievelijk de doellocaties, PAM en invoegingen. De rode streepjes geven verwijderde nucleotiden aan. Dit cijfer is gewijzigd van9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| De naam van het gen | Primer sequentie (5'-3') | Toepassing | ||
| ROBIJN | F: ATGGATCATGCGACCCTCG | Voor PCR-amplificatie in geïnfecteerde bamboebladeren | ||
| R: GTACTCGTAGAGCTGCTGCAC | ||||
| PeVDE | F: TGTGGCTTCTAAAGCTCTGCAATCT | Voor het klonen en sequencen van genen | ||
| R: TGTCAATGCTACAAGTCCTGGCA | ||||
| PeVDE-Doel1 | F: GGCATAGCCCTCACGCAGCACCGG | Voor het ontwerpen van PeVDE sgRNA-1 target | ||
| R: AAACCCGGTGCTGCGTGAGGGCTA | ||||
| PeVDE-Target2 | F: GGCACTCCACGGTCCCAAATCTAG | Voor het ontwerpen van PeVDE sgRNA-2 target | ||
| R: AAACCTAGATTTGGGACCGTGGAG | ||||
| PeCCR5-doel | F: GGCACTGGTACTGCTACGCTAAGA | Voor het ontwerpen van PeCCR5 sgRNA-doelwit | ||
| R: AAACTCTTAGCGTAGCAGTACCAG | ||||
Tabel 1: De sequentie-informatie van primers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode vermindert de benodigde tijd aanzienlijk in vergelijking met traditionele genetische transformatiemethoden, die doorgaans 1-2 jaar duren, en bereikt voorbijgaande expressie van exogene genen en genbewerking van endogene genen binnen 5 dagen. Deze methode heeft echter beperkingen omdat het slechts een klein deel van de cellen kan transformeren, en de gen-bewerkte bladeren zijn chimeer en missen het vermogen om te regenereren tot complete planten. Desalniettemin biedt deze technologie voor genexpressie en genbewerking in planta een krachtige benadering voor de functionele verificatie van endogene bamboegenen.
Momenteel kan in planta genexpressie en genbewerkingstechnologie alleen worden uitgevoerd in onrijpe (gekrulde) bladeren, niet in volwassen bladeren. Naarmate de bladeren zich ontvouwen en groter worden, neemt het aantal gen-bewerkte cellen dat deling ondergaat toe, waardoor genbewerking in specifieke bladregio's mogelijk wordt. De gebruikte Agrobacterium-gemedieerde transformatiemethode resulteert echter niet in insertie van het exogene T-DNA in het bamboechromosoom, waardoor het moeilijk is om stabiele markergenen in bamboe 6,9 te gebruiken. Daarom is het een uitdaging om de exacte locaties van deze regio's te bepalen. Om dit aan te pakken, werd het PeVDE-gen bewerkt en vertoonde het bewerkte gebied een verminderd fotoprotectievermogen bij behandeling met veel licht, zoals aangegeven door lagere NPQ-waarden, die gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd met behulp van een chlorofylfluorometer beeldvorming-PAM. Zo werd PeVDE ontwikkeld als een marker in bamboe om het optreden van exogene genexpressie en genbewerking te detecteren. Vanwege de hoge conservering van dit gen bij verschillende soorten 13, kan het ook op grote schaal worden toegepast op andere planten.
Door de afzetting van een cuticulaire waslaag op de opperhuid van bamboebladeren, in combinatie met de karakteristieke gekrulde en strak omwikkelde morfologie van onrijpe bladeren, wordt de toegankelijkheid van Agrobacterium voor bladcellen aanzienlijk belemmerd. Om de effectiviteit van Agrobacterium-infectie te verbeteren, zijn fysieke benaderingen, waaronder wond- en vacuüminfiltratie, gebruikt om het binnendringen van Agrobacterium in de ingesloten gekrulde bamboebladeren te bevorderen. Dit proces maakt het mogelijk om de nabijheid van Agrobacterium en de bladcellen te verkleinen, waardoor de efficiëntie van genetische transformatie wordt verbeterd. Ondertussen is dit genbewerkingssysteem tot nu toe beperkt gebleven tot bamboebladeren en kan het niet tot expressie worden gebracht in organen met voortplantingsvermogen, zoals zaden en zijknoppen die door de volgende generatie kunnen worden geërfd. Toekomstige toepassingen van de techniek zullen worden geoptimaliseerd om in-planta genexpressie en genbewerkingstechnologie te bereiken in organen met voortplantingsvermogen, met als doel stabiel erfelijke regenererende planten te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen tegenstrijdige belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs willen het National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2021YFD2200502), de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31971736) bedanken voor de financiële steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35S::RUBY | Addgene, United States | 160908 | Plamid construct |
| Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1 | Biomed, China | BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01 | For Agrobacterium infection |
| CTAB | Sigma-Aldrich, United States | 57-09-0 | DNA extraction |
| Imaging-PAM fluorometer | Walz, Effeltrich, Germany | Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves | |
| ImagingWin | Walz, Effeltrich, Germany | Software for Imaging-PAM fluorometer | |
| Paq CI or Aar I | NEB, United States | R0745S | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
| PrimeSTAR Max DNA polymerase | Takara, Japan | R045Q | For gene cloning |
| T4 DNA ligase | NEB, United States | M0202V | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
References
- Jiang, Z. H. World Bamboo and Rattan (in Chinese). , Liaoning Science and Technology Publishing House. Shenyang, China. (2002).
- Ye, S., et al. An efficient plant regeneration and transformation system of ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) started from young shoot as explant. Frontiers in Plant Science. 8, 1298 (2017).
- Ye, S., et al. Robust CRISPR/Cas9 mediated genome editing and its application in manipulating plant height in the first generation of hexaploid Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro). Plant Biotechnology Journal. 18 (7), 1501-1503 (2020).
- Xiang, M., et al. Production of purple Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) with enhanced drought and cold stress tolerance by engineering anthocyanin biosynthesis. Planta. 254 (3), 50 (2021).
- Huang, B., et al. An efficient genetic transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing system for moso bamboo (Phyllostachys edulis). Frontiers in Plant Science. 13, 822022 (2022).
- Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods in Molecular Biology. 323, 225-229 (2006).
- Canto, T. Transient expression systems in plants: potentialities and constraints. Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).
- Chen, L., et al. A method for the production and expedient screening of CRISPR/Cas9-mediated non-transgenic mutant plants. Horticulture Research. 5, 13 (2018).
- Sun, H., et al. A new biotechnology for in-planta gene editing and its application in promoting flavonoid biosynthesis in bamboo leaves. Plant Methods. 19 (1), 20 (2023).
- He, Y., Zhang, T., Sun, H., Zhan, H., Zhao, Y. A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation. Horticulture Research. 7 (1), 152 (2020).
- Wang, C., Shen, L., Fu, Y., Yan, C., Wang, K. A simple CRISPR/Cas9 system for multiplex genome editing in rice. Journal of Genetics and Genomics. 42 (12), 703-706 (2015).
- McCormick, S., et al. Leaf disc transformation of cultivated tomato (L. esculentum) using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Reports. 5 (2), 81-84 (1986).
- Lou, Y., et al. a violaxanthin de-epoxidase gene from moso bamboo, confers photoprotection ability in transgenic Arabidopsis under high light. Frontiers in Plant Science. 13, 927949 (2022).
- Zhou, R., et al. Distinct cinnamoyl CoA reductases involved in parallel routes to lignin in Medicago truncatula. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17803-17808 (2010).
- De Roeck, A., et al. Deleterious ABCA7 mutations and transcript rescue mechanisms in early onset Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 134 (3), 475-487 (2017).
