Summary
I denna studie utvecklades en ny metod för planta-genuttryck och genredigering som medierats av Agrobacterium i bambu. Denna metod förbättrade avsevärt effektiviteten av genfunktionsvalidering i bambu, vilket har betydande konsekvenser för att påskynda processen för bambuförädling.
Abstract
En ny metod för gentransformation av planta har utvecklats för bambu, vilket gör att man slipper behovet av tidskrävande och arbetsintensiva processer för induktion och regenerering av förhårdnader. Denna metod involverar Agrobacterium-medierat genuttryck via sår och vakuum för bambuplantor. Den visade framgångsrikt uttrycket av exogena gener, såsom RUBY-reportern och Cas9-genen , i bambublad. Den högsta omvandlingseffektiviteten för ackumulering av betalain i RUBY-plantor uppnåddes med hjälp av GV3101-stammen, med en procentandel på 85,2 % efter infektion. Även om det främmande DNA:t inte integrerades i bambugenomet var metoden effektiv när det gällde att uttrycka de exogena generna. Dessutom har ett genredigeringssystem också utvecklats med en infödd reporter som använder denna metod, från vilken en in situ-mutant genereras av den redigerade bambuviolaxantinde-epoxidasgenen (PeVDE) i bambublad, med en mutationshastighet på 17,33%. Mutationen av PeVDE resulterade i minskade värden för icke-fotokemisk kylning (NPQ) under starkt ljus, vilket kan detekteras exakt med en fluorometer. Detta gör den redigerade PeVDE till en potentiell infödd rapportör för både exogena och endogena gener i bambu. Med reportern av PeVDE redigerades framgångsrikt en cinnamoyl-CoA-reduktasgen med en mutationshastighet på 8,3 %. Denna operation undviker processen med vävnadsodling eller induktion av förhårdnader, vilket är snabbt och effektivt för att uttrycka exogena gener och endogen genredigering i bambu. Denna metod kan förbättra effektiviteten av verifiering av genfunktioner och kommer att hjälpa till att avslöja de molekylära mekanismerna för viktiga metaboliska vägar i bambu.
Introduction
Undersökningen av genfunktionen i bambu är mycket lovande för den avancerade förståelsen av bambu och för att låsa upp dess potential för genetisk modifiering. Ett effektivt sätt att uppnå detta kan uppnås genom processen med Agrobacterium-medierad infektion i bambublad, varigenom T-DNA-fragmentet som innehåller exogena gener förs in i cellerna, vilket därefter leder till att generna uttrycks i bladcellerna.
Bambu är en värdefull och förnybar resurs med ett brett användningsområde inom tillverkning, konst och forskning. Bambu har utmärkta träegenskaper såsom hög mekanisk hållfasthet, seghet, måttlig styvhet och flexibilitet1, som nu används i stor utsträckning i en mängd olika hushålls- och industriförnödenheter, inklusive tandborstar, sugrör, knappar, engångsserviser, underjordiska rörledningar och kyltornsfyllmedel för termisk kraftproduktion. Därför spelar bambuförädling en avgörande roll för att få fram bambusorter med utmärkta träegenskaper för att ersätta plast och minska plastanvändningen, skydda miljön och ta itu med klimatförändringarna, samt generera betydande ekonomiskt värde.
Traditionell bambuförädling står dock inför utmaningar på grund av det långa vegetativa tillväxtstadiet och den osäkra blomningsperioden. Även om molekylära förädlingstekniker har utvecklats och tillämpats på bambuförädling, är processen för bambugentransformation tidskrävande, arbetsintensiv och komplicerad på grund av kallusinduktions- och regenereringsprocesserna 2,3,4,5. Stabil genetisk transformation kräver ofta Agrobacterium-medierade metoder, som involverar vävnadsodlingsprocesser som induktion och regenerering av förhårdnader. Bambu har dock en låg förmåga till regenerering av förhårdnader, vilket kraftigt begränsar tillämpningen av stabil genetisk transformation i bambu. Efter att Agrobacterium infekterat växtceller kommer T-DNA-fragmentet in i växtcellerna, och majoriteten av T-DNA-fragmenten förblir icke-integrerade i cellerna, vilket resulterar i övergående uttryck. Endast en liten del av T-DNA-fragmenten integreras slumpmässigt i kromosomen, vilket leder till ett stabilt uttryck. De transienta uttrycksnivåerna visar en ackumuleringskurva som kan variera för varje gen som uttrycks från ett T-DNA som levereras av Agrobacterium. I de flesta fall uppträder de högsta uttrycksnivåerna 3-4 dagar efter infiltration och minskar snabbt efter 5-6 dagar 6,7. Tidigare studier har visat att mer än 1/3 av mutationerna i genredigerade växter som erhålls utan selektionstryck för resistens kommer från det övergående uttrycket av CRISPR/Cas9, medan de återstående mindre än 2/3 kommer från stabilt uttryck efter DNA-integration i genomet8. Detta indikerar att T-DNA-integration i växtgenomet inte är nödvändig för genredigering. Dessutom hämmar selektionstrycket för resistens avsevärt tillväxten av icke-transgena celler, vilket direkt påverkar regenereringsprocessen hos infekterade explantat. Därför, genom att använda transient uttryck utan selektionstryck för resistens i bambu, är det möjligt att uppnå icke-integrerat uttryck av exogena gener och studera genfunktion direkt i växtorgan. Därför kan en enkel och tidsbesparande metod utvecklas för exogent genuttryck och redigering i bambu9.
Den utvecklade exogena genuttrycks- och genredigeringsmetoden kännetecknas av sin enkelhet, kostnadseffektivitet och frånvaron av dyr utrustning eller komplexa procedurer9. I denna metod användes den endogena violaxantin-epoxidasgenen (PeVDE) för exogent genuttryck utan selektionstryck. Detta beror på att den redigerade PeVDE i bambublad minskar ljusskyddsförmågan under starkt ljus och visar en minskning av det icke-fotokemiska släckningsvärdet (NPQ), vilket kan detekteras genom klorofyllfluorescensavbildning. För att demonstrera effektiviteten av denna metod slogs en annan endogen gen av bambu, cinnamoyl-CoA-reduktasgenen (PeCCR5)9, ut med hjälp av detta system och genererade framgångsrikt mutanter av denna gen. Denna teknik kan användas för funktionell karakterisering av gener som har funktioner i bambublad. Genom att överuttrycka dessa gener tillfälligt i bambublad kan deras uttrycksnivåer förbättras, eller genom genredigering kan deras uttryck slås ner, vilket möjliggör studier av nedströms genuttrycksnivåer, bladfenotyper och produktinnehåll. Detta ger ett mer effektivt och genomförbart tillvägagångssätt för forskning om genfunktioner i bambu. Denna teknik kan tillämpas på funktionell karakterisering av gener som fungerar i bambublad. Genom att överuttrycka dessa gener tillfälligt i bambublad kan deras uttrycksnivåer förbättras, eller genom genredigering kan deras uttryck slås ner, vilket möjliggör studier av nedströms genuttrycksnivåer, bladfenotyper och produktinnehåll. Dessutom är det viktigt att notera att på grund av omfattande polyploidisering finns majoriteten av kommersiellt viktiga gener i bambugenom i flera kopior, vilket resulterar i genetisk redundans. Detta utgör en utmaning för att utföra multiplex genomredigering i bambu. Innan man tillämpar stabil genetisk transformation eller genredigeringstekniker är det viktigt att snabbt validera genfunktioner. För att ta itu med problemet med multipla genkopior är ett tillvägagångssätt att analysera transkriptomuttrycksprofiler för att identifiera gener som uttrycks aktivt under specifika stadier. Att rikta in sig på de bevarade funktionella domänerna för dessa genkopior gör det dessutom möjligt att utforma gemensamma målsekvenser eller införliva flera målplatser i samma CRISPR/Cas9-vektor, vilket möjliggör samtidig knockout av dessa gener. Detta ger ett mer effektivt och genomförbart tillvägagångssätt för forskning om genfunktioner i bambu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av bambuplantor
- Förbered mosobambuplantor (Phyllostachys edulis) med frön skördade i Guilin, Guangxi, Kina. Börja med att blötlägga fröna i vatten i 2-3 dagar, se till att byta vatten dagligen. Skapa sedan ett substrat genom att blanda jord och vermikulit i förhållandet 3:1.
- Så de blötlagda fröna i substratet för groning. Behåll plantorna under laboratorieförhållanden och håll temperaturen mellan 18-25 °C. Säkerställ en ljusperiod på 16 timmar/8 timmar mörk med en ljusintensitet på 250-350 μmol/m2/s under ljusfasen.
- Håll en relativ luftfuktighet på cirka 60 %. För Agrobacterium-infektion, använd plantor som är 15 dagar gamla och har en höjd på 2-10 cm, vilket är det bästa stadiet för transformation.
OBS: Eftersom bambublomningen är oförutsägbar finns frön inte tillgängliga varje år. Fröna lagras vanligtvis i 2-3 år vid 4 °C i en torr miljö och kan fortfarande upprätthålla en livskraft på över 20 %.
2. Beredning av plasmider och Agrobacterium
- Plasmider: För att validera den transienta uttryckseffekten, använd pHDE-35S::RUBY-konstruktionen som innehåller en synlig reportergen som drivs av CaMV 35S-promotorn 10. För genredigering, använd konstruktionen pCambia1300-Ubi::Cas9, som bär Cas9-genen som drivs av majsens Ubi-promotor 11. Sätt in de sgRNA-styrande sekvenserna av PeVDE och andra målgener mellan de två AarI-platserna i pCambia1300-Ubi::Cas9-konstruktionen 9.
- Sätt in CRISPR/Cas9-guide-RNA-sekvenserna mellan de två AarI-restriktionsendonukleasställena i pCambia1300-Ubi::Cas9-konstruktionen , inklusive PeVDE - och PeCCR5-målgener .
- Tillsätt GGCA till 5'-änden av 20-nukleotidsekvensen och syntetisera en enkelsträngad DNA-sekvens. Omvänt komplementära 20-nukleotidsekvensen och tillsätt AAAC till 5'-änden, syntetisera sedan en annan enkelsträngad DNA-sekvens.
- Späd båda enkelsträngade DNA-sekvenserna till en koncentration av 10 nM/L i utspätt vatten, blanda noggrant och värm vid 95 °C i 5 minuter. Låt blandningen svalna till rumstemperatur, vilket resulterar i bildandet av dubbelsträngade adaptrar.
- Anslut adaptrarna med det linjära pCambia1300-Ubi::Cas9-fragmentet som smälts av AarI-endonukleas med T4 DNA-ligas och sekvensera den konstruerade CRISPR/Cas9-vektorn för att erhålla den önskade genriktade konstruktionen.
- För att omvandla plasmider till Agrobacterium, använd frys-upptiningsmetoden enligt följande: Blanda 1 μl plasmider (koncentration: 10 - 1 000 ng/μL) med 100 μL Agrobacterium-kompetenta celler (translationseffektivitet: > 1 x 10 4 kolonibildande enheter/μg) och blanda dem försiktigt. Lägg blandningen på is i 5 min. Överför blandningen till flytande kväve i 5 minuter.
- Tina blandningen i ett 37 °C vattenbad i 5 min. Tillsätt 500 μl Luria-Bertani (LB) medium till blandningen och inkubera den i en skakinkubator vid 28 °C vid 200 rpm i 2–3 timmar. För plasmiderna pHDE-35S::RUBY introduceras de individuellt i AGL1-, GV3101-, LBA4044- och EHA105-stammarna av Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens)12. För CRISPR/Cas9-plasmiderna, introducera dem i GV3101-stammen av A. tumefaciens.
- Odla Agrobacterium i jästextrakt pepton (YEP) medium (10 g nötköttsextrakt, 10 g jästextrakt och 5 g NaCl per L) med motsvarande antibiotika (spektinomycin för 35S::RUBY och kanamycin för CRISPR/Cas9) vid 28 °C. De enskilda samhällena observerades 36-48 timmar efter odling.
- Plocka och överför kolonierna till flytande YEP-medium (med motsvarande antibiotika) för vidare tillväxt. Efter 24-36 timmar, använd primrarna RUBY-F och RUBY-R (tabell 1) för att utföra PCR för att bekräfta framgångsrik överföring av plasmider till Agrobacterium.
- Överför 1 ml av den framgångsrikt omvandlade Agrobacterium till 100 ml färskt flytande YEP-medium (med motsvarande antibiotika) och odla sedan över natten vid 28 °C till en OD600 på 0,8.
- Centrifugera bakteriesuspensionen vid 4 000 x g i 5 minuter vid 4 °C, tvätta bakteriepelleten en gång med suspensionsinfiltrationsmedium (10 mM MgCl2 och 10 mM MES-KOH [pH 5,6]) och centrifugera sedan igen. Återsuspendera bakteriepelleten i ett suspensionsinfiltrationsmedium till en OD600 på 0,6 för bambuomvandling.
3. Agrobacterium -medierad i plantatransformationssystem
- Förbered dig för omvandling; Ta försiktigt bort plantorna med jordbundna rötter från substratet och se till att rötterna förblir intakta. Linda in plantorna med aluminiumfolie för att bibehålla fukten och förhindra att jorden lossnar (Figur 1A).
- Överför de inslagna plantorna till en miljö med högre luftfuktighet (relativ luftfuktighet >90 %) och lägre belysning (intensitet mindre än 50 μmol/m 2/s) under2 timmar.
- Använd en vass nål från en spruta och linda den övre delen av böjda omogna blad (cirka 1-2 cm från toppen) på bambuplantorna en eller två gånger (som indikeras av de röda trianglarna i figur 1A).
- Doppa sedan den skadade övre delen av plantorna i suspensioner av Agrobacterium. Utför hela processen, från sår till dopp i Agrobacterium snabbt, eftersom det färska såret kommer att öka inokuleringseffektiviteten.
- Överför omedelbart plantorna till en vakuumkammare med ett tryck på 25-27 mmHg i 2 minuter (Figur 1B).
- Efter dammsugning, packa försiktigt upp plantorna och plantera om dem i substratet. Placera plantorna i svagt ljus eller mörker (<50 μmol/m 2/s) med hög luftfuktighet (RH>90%) i rumstemperatur (18-25 °C) i2 dagar. Odla sedan plantorna under normala tillväxtförhållanden och vattna dem var 5-7:e dag. Observera deras fenotyper för att tillhandahålla material för efterföljande experiment.
4. Designa single guide RNA (sgRNA) för genredigering
- Identifiera en plats för intilliggande protospacermotiv (PAM) som ligger nära en specifik och bevarad domän av målgensekvensen. Se till att den specifika PAM-sekvensen är NGG i detta CRISPR/Cas9-system. Verifiera målspecificiteten för den valda sekvensen genom att utföra en BlastN-sökning mot bambugenomdatabasen. Se till att sgRNA är unikt, särskilt i uppströmsregionen och nära PAM 9,11.
OBS: Denna jämförelse kommer effektivt att minska potentiella off-target-platser i genomet som påverkas av genredigeringsprocessen. - Designa två sgRNA (sgRNA-1 och sgRNA-2) på den första exonen av PeVDE-genen 13. Inkludera restriktionsställen för ålder I uppströms PAM i sgRNA-1 och Xba I-restriktionsställenuppströms PAM i sgRNA-2. Designa ett sgRNA på den fjärde exonen av PeCCR5-genen, som kodar för det bevarade motivet KNWYCYGK. Detta motiv är avgörande för katalysen av CCR14.
- Planera en sekvens med 20 nukleotiddistanser i anslutning till PAM-platsen. Denna spacer-sekvens kommer att styra Cas9-enzymet till målplatsen för DNA-klyvning och efterföljande genredigering.
OBS: Det är tillrådligt att välja en målregion uppströms endonukleasenzymklyvningsstället inom PAM-stället. Detta kommer att underlätta valideringen av genredigeringens effektivitet.
5. Primerdesign och PCR
- Manuellt designa specifika primers för amplifiering av PeVDE - och PeCCR5-fragmenten . Utforma uppströms och nedströms primers så att de placeras minst 100 bp utanför målplatsen, med en längdskillnad på över 100 bp för att möjliggöra distinkt bandseparation under elektrofores. Designa primers för amplifiering av RUBY inom de första 500 bp av genen. En förteckning över alla primers som används finns i tabell 1.
- Använd ett DNA-polymeras med hög kvalitet för PCR. I det här fallet använder du DNA-polymeras med hög trohet och effektiv amplifiering vid genkloning.
- Bered PCR-reaktionsblandningen enligt följande: 5x buffert (Mg2+ Plus): 4 μL; dNTP-blandning (2,5 mM vardera): 1,6 μL; Framåt- och bakåtprimers (10 pmol vardera): 1 μL vardera; bambu genom-DNA (cirka 50 ng); DNA-polymeras (2,5 U/μL): 0,2 μL; Späd vatten till en total volym på 20 μL.
- Följ PCR-driftsförhållandena: Initial denaturering vid 98 °C i 5 minuter; Denaturering vid 98 °C i 10 s. Glödgning vid 56 °C i 5 s. Förlängning vid 72 °C i 30 s; Upprepa denatureringen till förlängning i 32 cykler; Slutlig förlängning vid 72 °C i 5 min. Håll vid 4 °C på obestämd tid.
PCR-förhållanden tillhandahålls som ett exempel och kan behöva optimeras för specifika applikationer eller mål.
6. DNA-extraktion, nedbrytning av endonukleasenzymer och sekvensering
- Separera området med lägre NPQ-värden från färska bambubladblad med en sax, som identifieras av bildbehandlings-PAM-fluorometern (se steg 7.4). Frys bladproverna med flytande kväve och överför de frysta bladproverna till en mortel. Mal proverna till ett fint pulver med hjälp av en mortelstöt och tillsätt tillräckligt med flytande kväve under malningsprocessen. Detta steg hjälper till att frigöra det cellulära innehållet, inklusive DNA.
- Extrahera genomiskt DNA från det pulveriserade bladet med hjälp av metoden Cetyltrimetylammoniumammoniumbromid (CTAB). Tillsätt 50 mg bladpulverprover till 800 μl av en 2% CTAB-lösning. Blanda provet noggrant och inkubera vid 65 °C i 30 minuter, skaka försiktigt var 5:e minut.
- Tillsätt en lika stor volym kloroform/isoamylalkohol (24:1, v/v) och skaka blandningen kraftigt. Efter centrifugering vid 8 000 g i 8 minuter överförs supernatanten till ett nytt rör.
- Tillsätt en lika stor volym kloroform/isoamylalkohol och upprepa steg 6.3. Tillsätt en lika stor volym iskall isopropanol och vänd upp och ner på röret flera gånger innan det placeras vid -20 °C i 30 minuter. Efter centrifugering vid 8 000 x g i 5 minuter kasseras supernatanten.
- Tvätta DNA-pelleten 2 gånger med 75 % etanol vid 4 °C och lös sedan upp i 50 μL vatten.
- Amplifiera det genomiska DNA:t som innehåller målplatsen för målgenerna från både vildtyps- och Agrobacterium-infekterade bambublad med protokollet i steg 5.4.
- Utför nedbrytning av endonukleasenzymer av PCR-produkterna. Välj ett specifikt enzym som känner igen de önskade restriktionsställena i de amplifierade DNA-fragmenten. Använd AgeI- och XbaI-endonukleaser för matsmältningen.
- Bered en reaktionsblandning bestående av AgeI eller XbaI (20 enheter/μL)-1 μL, 1 μg PCR-produkter, 10x buffert-5 μL, och tillsätt vatten till en total volym av 50 μL. Inkubera vid 37 °C i 1 timme.
- Analysera andelen nedsmälta DNA-fragment med hjälp av gelelektrofores. Jämför de smälta fragmenten från vildtyps- och Agrobacterium-infekterade prover för att bedöma genredigeringseffektiviteten.
- Tag transposasadaptern TCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGACAG och GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTATAAGAGAAG-sekvenserna till 5'-änden av de främre respektive bakåtriktade primerrna för amplifiering av PeVDE- och PeCCR5-fragment 9,15. Använd protokollet som beskrivs i steg 5.4 för amplifiering. Förbered PCR-produkterna (före matsmältningen) för djupsekvensering.
7. Mätning av klorofyllfluorescens av NPQ-värden i blad
- Före mätningarna, utsätt bambuplantorna för höga ljusintensitetsförhållanden på 1200 μmol/m 2/s i2 timmar. Denna exponering ökar mängden absorberat ljuskvantum och aktiverar ljusskyddssystemet i bladen.
- Använd en bildbehandlings-PAM-fluorometer för att mäta in vivo PS II-klorofyllfluorescensen hos bambublad. Ställ in den aktiniska ljusintensiteten på 800 μmol/m2/s för 6 minuters fluorescensmätningar. Under denna period, applicera en mättnadspuls var 30:e s för att få klorofyllfluorescenskurvor. De stabila värdena på kurvorna kommer att användas för beräkningar13.
- Beräkna den icke-fotokemiska kylningen (NPQ) med hjälp av formeln:
NPQ = (F m - F m') / F m'
där F m representerar den maximala fluorescensen i det mörkeranpassade tillståndet, och Fm' representerar den maximala fluorescensen i alla ljusanpassade tillstånd. - Övervaka NPQ-värdena från bildbehandlingsprogrammets visuella gränssnitt. Programvaran möjliggör realtidsanalys och visning av fluorescensdata, inklusive NPQ-värdena.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Agrobacterium-medierad i planta-genuttryck i bambublad
RUBY-reportergenen har visat sig vara effektiv för att visualisera övergående genuttryck på grund av dess förmåga att producera levande rött betalain från tyrosin10. I denna studie användes Agrobacterium-medierad transformation för att tillfälligt uttrycka den exogena RUBY-genen i bambublad (Figur 1). Vid den 3:e dagen efter infektionen observerades röd färgning i de omogna veckade bladen, som blev mer levande på den 5:e dagen när bladen hade vecklats ut (blå triangel, figur 1C). Dessa resultat visar att Agrobacterium framgångsrikt medierade uttrycket av den exogena RUBY-genen i bambublad och att betalainsyntes ägde rum.
Dessutom jämfördes fyra stammar av Agrobacterium (AGL1, LBA4404, EHA105 och GV3101) och fann att GV3101-stammen orsakade den mest betydande betalainackumuleringen i infekterade bambublad, med den högsta andelen på 85,2 % av plantorna ackumulerade betalain efter att ha infekterats, följt av AGL1 (76,9 %) och sedan EHA105 (49,1 %) och LBA4404 (31,3 %; Figur 1D). Detta tyder på att GV3101 är den mest lämpliga stammen för detta ändamål. High-fidelity PCR utfördes för att upptäcka om det Agrobacterium-medierade T-DNA-fragmentet hade integrerats i bambukromosomen. Efter 40 PCR-cykler upptäcktes inga band av RUBY-genen , vilket tyder på att T-DNA-fragmentet inte integrerades eller integrerades i ett så lågt antal att det inte kunde detekteras. Således drar dessa resultat slutsatsen att detta genuttryck är övergående.
Sammantaget visar dessa fynd genomförbarheten av Agrobacterium-medierad transient i planta-genuttryck i bambu med hjälp av RUBY-reportergenen . Den röda betalainfärgen visade sig dock vara instabil och försvann efter 3 månaders infektion, vilket tyder på att det transienta expressionssystemet inte är stabilt för långtidsobservation.
I planta genredigering av bambuviolaxantin de-epoxidas-gen (PeVDE)
Agrobacterium-medierad i planta-genuttryck är en övergående metod för genuttryck i bambu. För att undersöka om ett transient CRISPR/Cas9-system kunde uppnå genredigering i bambublad, valdes nyckelenzymet i bambuns xantofyllcykel, violaxantinde-epoxidas (PeVDE), som ett mål för genredigering. Enstaka guide-RNA (sgRNA) designades på den första exonen av PeVDE-genen (sgRNA-1), som innehåller restriktionsställen för ålderI uppströms om det intilliggande protospacermotivet (PAM) för att underlätta genredigeringsvalidering (Figur 2A).
CRISPR/Cas9-konstruktionen som bär sgRNA-1 transfekterades till Agrobacterium för att omvandla bambublad. Efter infektion av Agrobacterium innehållande CRISPR/Cas9-konstruktionerna som bär sgRNA-1 i 5 dagar, utsattes bambuplantor för hög ljusbehandling, och därefter utfördes detektion av klorofyllfluorescensparametrar. Vissa områden av bladbladen hittades som hade lägre värden för icke-fotokemisk släckning (NPQ) (figur 2B), vilket indikerar att ljusskyddsförmågan hos dessa områden var nedsatt under intensivt ljus. Eftersom PeVDE-genen har förmågan att avleda överskott av absorberad ljusenergi13, är det troligt att dessa områden med lägre NPQ-värden är de regioner där PeVDE-genen redigerades. Därefter utfördes enzymnedbrytning och sekvenseringsanalys av PeVDE-genfragmentet i dessa områden av bladbladen (Figur 2C-D) och det visade sig att mutationshastigheten för sgRNA-1 var 17,33 %, vilket indikerar att genredigeringen var framgångsrik i dessa områden av PeVDE-genen.
Dessutom designades ett annat sgRNA-målställe, sgRNA-2, som innehåller ett XbaI-restriktionsställe, på den första exonen av PeVDE. För att undersöka möjligheten till lång fragmentdeletion med dubbel sgRNA-målinriktning utfördes genredigering på båda målställena, vilket resulterade i lång fragmentdeletion (Figur 2E).
Redigerad PeVDE-mutant som används som rapportör i det transienta genredigeringssystemet
Huruvida PeVDE sgRNA kunde fungera som rapportör i det transienta genredigeringssystemet undersöktes. Cinnamoyl-CoA-reduktasgenen (PeCCR5) (gen-ID: PH02Gene42984.t1) valdes slumpmässigt ut för att utvärdera PeVDE-reportern . Ett sgRNA-mål för PeCCR5 designades i sitt konserverade motiv på den fjärde exonen. CRISPR/Cas9-konstruktionen som bär båda sgRNA, PeVDE och PeCCR5, omvandlades till bambublad (Figur 3A).
Efter Agrobacterium-infektion i 30 dagar behandlades plantorna med högintensivt ljus i 20 minuter. Det observerades att endast de bladområden som redigerats för PeCCR5-genen inte hade någon effekt på NPQ-värdena, medan bladområdena som transfekterades av sgRNA av både PeVDE och PeCCR5 uppvisade lägre NPQ-värden (Figur 3B).
Därefter amplifierades och sekvenserades PeCCR5-fragmentet från bladområdena med lägre NPQ-värden och fann en mutationseffektivitet på 8,3 % med hjälp av djupsekvensering. Därför har PeVDE-reportern framgångsrikt fungerat som en transient genredigeringsrapportör och kan användas för att screena för genredigering av andra endogena bambugener.
Sammantaget visar dessa resultat att det är möjligt att genredigera bambu med hjälp av CRISPR/Cas9 i bambu.
Figur 1: I planta uttryck av RUBY-genen och betalainackumulering i mosobambublad . A) Mosobambuplantor inlindade i aluminiumfolie och redo för Agrobacterium-infektion , med röda trianglar som indikerar positioner som skadats av en vass nål från en spruta. (B) Vakuuminfiltrationsprocess av bambuplantor. (C) Betalainackumulering i bambublad efter 3 dagars infektion observerad genom fenotypiska förändringar. (D) Här utfördes fyra Agrobacterium-stammar , AGL1, LBA4404, EHA105 och GV3101 medierad RUBY-gentransformation i bambublad. GV3101 som hyser GFP-konstruktionen användes som en negativ kontroll. Denna siffra har ändrats från9. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: I plantauttryck och genredigering av PeVDE-genen i bambublad. (A) Lokaliserings- och målsekvensinformation för sgRNA i PeVDE-genen. Röda trianglar indikerar framåt- och bakåt primers positioner för fragmentförstärkning. (B) NPQ och rå avbildning av bambublad efter infektion. Siffrorna i NPQ-bilden representerar NPQ-värden i bildbehandlingsprogrammets monitor. (C) Elektroforesresultat av PeVDE-fragment före och efter AgeI-uppslutning. WT betecknar de icke-infekterade bladen av vildtyp, och + och - representerar PeVDE-fragment med respektive utan AgeI-matsmältning. (D) Djupsekvenseringsresultat av PeVDE-fragmentet i blad med lägre NPQ-värde. De röda, blå och grå teckensnitten i sekvenserna representerar målplatserna, PAM respektive infogningar. De röda strecken indikerar borttagna nukleotider. (E) Sangersekvenseringsresultat av PeVDE-fragmentet efter redigering med både sgRNA-1 och sgRNA-2. Denna siffra har ändrats från9. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: PeVDE sgRNA som rapportör för screening av genredigering av PeCCR5. (A) Schematisk representation av CRISPR/Cas9-konstruktioner innehållande PeVDE och PeCCR5 sgRNA. (B) NPQ och råa bilder av bambublad efter infektion med konstruktionerna i (A). Vita trianglar indikerar områden med lägre NPQ-värden. Regnbågsfärgen representerar värdet på NPQ/4, där rött motsvarar minimivärdet och lila motsvarar 1. (C) De röda, blå och grå teckensnitten i sekvenserna representerar målplatserna, PAM respektive infogningar. De röda strecken indikerar borttagna nukleotider. Denna siffra har ändrats från9. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Gennamn | Primer-sekvens (5'-3') | Tillämpning | ||
| RUBIN | F: ATGGATCATGCGACCCTCG | För PCR-amplifiering i infekterade bambublad | ||
| R: GTACTCGTAGAGCTGCTGCAC | ||||
| PeVDE | F: TGTGGCTTCTAAAGCTCTGCAATCT | För genkloning och sekvensering | ||
| R: TGTCAATGCTACAAGTCCTGGCA | ||||
| PeVDE-Target1 | F: GGCATAGCCCTCACGCAGCACCGG | För design av PeVDE sgRNA-1-mål | ||
| R: AAACCCGGTGCTGCGTGAGGGCTA | ||||
| PeVDE-Target2 | F: GGCACTCCACGGTCCCAAATCTAG | För design av PeVDE sgRNA-2-mål | ||
| R: AAACCTAGATTTGGGACCGTGGAG | ||||
| PeCCR5-Mål | F: GGCACTGGTACTGCTACGCTAAGA | För design av PeCCR5 sgRNA-mål | ||
| R: AAACTCTTAGCGTAGCAGTACCAG | ||||
Tabell 1: Sekvensinformation för primers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod minskar avsevärt tidsåtgången jämfört med traditionella genetiska transformationsmetoder, som vanligtvis tar 1-2 år, och uppnår övergående uttryck av exogena gener och genredigering av endogena gener inom 5 dagar. Denna metod har dock begränsningar eftersom den bara kan omvandla en liten del av cellerna, och de genredigerade bladen är chimära och saknar förmåga att regenerera till kompletta plantor. Icke desto mindre ger detta i planta-genuttryck och genredigeringsteknik ett kraftfullt tillvägagångssätt för funktionell verifiering av endogena bambugener.
För närvarande kan genuttryck och genredigeringsteknik i planta endast utföras på omogna (krulliga) blad, inte på mogna blad. När bladen vecklar ut sig och förstoras ökar antalet genredigerade celler som genomgår delning, vilket möjliggör genredigering i specifika bladregioner. Den Agrobacterium-medierade transformationsmetoden som används resulterar dock inte i införande av det exogena T-DNA:t i bambukromosomen, vilket gör det svårt att använda stabila markörgener i bambu 6,9. Därför är det svårt att fastställa de exakta platserna för dessa regioner. För att ta itu med detta redigerades PeVDE-genen, och det redigerade området uppvisade en minskad ljusskyddsförmåga under hög ljusbehandling, vilket indikeras av lägre NPQ-värden, vilket lätt kan detekteras med hjälp av en klorofyllfluorometer-PAM. Således utvecklades PeVDE som en markör i bambu för att detektera förekomsten av exogent genuttryck och genredigering. På grund av det höga bevarandet av denna gen hos olika arter 13 kan den också användas i stor utsträckning på andra växter.
På grund av avsättningen av ett kutikulärt vaxskikt på epidermis av bambublad, i kombination med den karakteristiska krullade och tätt lindade morfologin hos omogna blad, hindras tillgängligheten av Agrobacterium till bladceller avsevärt. För att förbättra effektiviteten av Agrobacterium-infektion har fysiska metoder, inklusive sår- och vakuuminfiltration, använts för att främja inträngningen av Agrobacterium i de inneslutna krulliga bambubladen. Denna process möjliggör närhet mellan Agrobacterium och bladcellerna, vilket ökar effektiviteten i den genetiska transformationen. Samtidigt har detta genredigeringssystem hittills varit begränsat till bambublad och kan inte uttryckas i organ med reproduktionsförmåga, såsom frön och sidoknoppar som kan ärvas av nästa generation. Framtida tillämpningar av tekniken kommer att optimeras för att uppnå genuttryck och genredigeringsteknik i organ med reproduktionsförmåga, i syfte att erhålla stabilt ärftliga regenererande växter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några motstridiga intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2021YFD2200502), National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31971736) för det ekonomiska stödet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35S::RUBY | Addgene, United States | 160908 | Plamid construct |
| Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1 | Biomed, China | BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01 | For Agrobacterium infection |
| CTAB | Sigma-Aldrich, United States | 57-09-0 | DNA extraction |
| Imaging-PAM fluorometer | Walz, Effeltrich, Germany | Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves | |
| ImagingWin | Walz, Effeltrich, Germany | Software for Imaging-PAM fluorometer | |
| Paq CI or Aar I | NEB, United States | R0745S | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
| PrimeSTAR Max DNA polymerase | Takara, Japan | R045Q | For gene cloning |
| T4 DNA ligase | NEB, United States | M0202V | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
References
- Jiang, Z. H. World Bamboo and Rattan (in Chinese). , Liaoning Science and Technology Publishing House. Shenyang, China. (2002).
- Ye, S., et al. An efficient plant regeneration and transformation system of ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) started from young shoot as explant. Frontiers in Plant Science. 8, 1298 (2017).
- Ye, S., et al. Robust CRISPR/Cas9 mediated genome editing and its application in manipulating plant height in the first generation of hexaploid Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro). Plant Biotechnology Journal. 18 (7), 1501-1503 (2020).
- Xiang, M., et al. Production of purple Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) with enhanced drought and cold stress tolerance by engineering anthocyanin biosynthesis. Planta. 254 (3), 50 (2021).
- Huang, B., et al. An efficient genetic transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing system for moso bamboo (Phyllostachys edulis). Frontiers in Plant Science. 13, 822022 (2022).
- Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods in Molecular Biology. 323, 225-229 (2006).
- Canto, T. Transient expression systems in plants: potentialities and constraints. Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).
- Chen, L., et al. A method for the production and expedient screening of CRISPR/Cas9-mediated non-transgenic mutant plants. Horticulture Research. 5, 13 (2018).
- Sun, H., et al. A new biotechnology for in-planta gene editing and its application in promoting flavonoid biosynthesis in bamboo leaves. Plant Methods. 19 (1), 20 (2023).
- He, Y., Zhang, T., Sun, H., Zhan, H., Zhao, Y. A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation. Horticulture Research. 7 (1), 152 (2020).
- Wang, C., Shen, L., Fu, Y., Yan, C., Wang, K. A simple CRISPR/Cas9 system for multiplex genome editing in rice. Journal of Genetics and Genomics. 42 (12), 703-706 (2015).
- McCormick, S., et al. Leaf disc transformation of cultivated tomato (L. esculentum) using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Reports. 5 (2), 81-84 (1986).
- Lou, Y., et al. a violaxanthin de-epoxidase gene from moso bamboo, confers photoprotection ability in transgenic Arabidopsis under high light. Frontiers in Plant Science. 13, 927949 (2022).
- Zhou, R., et al. Distinct cinnamoyl CoA reductases involved in parallel routes to lignin in Medicago truncatula. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17803-17808 (2010).
- De Roeck, A., et al. Deleterious ABCA7 mutations and transcript rescue mechanisms in early onset Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 134 (3), 475-487 (2017).
