Summary
I denne studien ble en roman i planta genuttrykk og genredigeringsmetode mediert av Agrobacterium utviklet i bambus. Denne metoden forbedret effektiviteten av genfunksjonsvalidering i bambus, noe som har betydelige implikasjoner for å akselerere prosessen med bambusavl.
Abstract
En ny metode for transformasjon av planta-genet ble utviklet for bambus, som unngår behovet for tidkrevende og arbeidskrevende callus-induksjons- og regenereringsprosesser. Denne metoden innebærer Agrobacterium-mediert genuttrykk via sår og vakuum for bambusplanter. Det demonstrerte vellykket uttrykket av eksogene gener, som RUBY-reporteren og Cas9-genet , i bambusblader. Den høyeste transformasjonseffektiviteten for akkumulering av betalain i RUBY-frøplanter ble oppnådd ved bruk av GV3101-stammen, med en prosentandel på 85,2% etter infeksjon. Selv om det fremmede DNA ikke ble integrert i bamdegenomet, var metoden effektiv til å uttrykke de eksogene genene. Videre er det også utviklet et genredigeringssystem med en innfødt reporter som bruker denne metoden, hvorfra en in situ mutant generert av det redigerte bambus violaxanthin de-epoxidase-genet (PeVDE) i bambusblader, med en mutasjonsrate på 17,33%. Mutasjonen av PeVDE resulterte i reduserte ikke-fotokjemiske slukkeverdier (NPQ) under høyt lys, som nøyaktig kan detekteres av et fluorometer. Dette gjør den redigerte PeVDE til en potensiell innfødt reporter for både eksogene og endogene gener i bambus. Med reporteren av PeVDE ble et cinnamoyl-CoA-reduktasegenet vellykket redigert med en mutasjonsrate på 8,3%. Denne operasjonen unngår prosessen med vevskultur eller kallusinduksjon, noe som er raskt og effektivt for å uttrykke eksogene gener og endogen genredigering i bambus. Denne metoden kan forbedre effektiviteten av genfunksjonsverifisering og vil bidra til å avsløre molekylære mekanismer for viktige metabolske veier i bambus.
Introduction
Undersøkelsen av genfunksjonen i bambus holder stort løfte om den avanserte forståelsen av bambus og låse opp potensialet for genetisk modifisering. En effektiv måte på dette kan oppnås gjennom prosessen med Agrobacterium-mediert infeksjon i bambusblader, hvorved T-DNA-fragmentet som inneholder eksogene gener blir introdusert i cellene, og deretter fører til ekspresjon av gener i bladcellene.
Bambus er en verdifull og fornybar ressurs med et bredt spekter av applikasjoner innen produksjon, kunst og forskning. Bambus har utmerkede treegenskaper som høy mekanisk styrke, seighet, moderat stivhet og fleksibilitet1, som nå er mye brukt i en rekke husholdnings- og industrielle forsyninger, inkludert tannbørster, sugerør, knapper, engangsservise, underjordiske rørledninger og kjøletårnfyllstoffer for termisk kraftproduksjon. Derfor spiller bambusavl en avgjørende rolle i å skaffe bambusvarianter med gode treegenskaper for å erstatte plast og redusere plastbruk, beskytte miljøet og takle klimaendringer, samt generere betydelig økonomisk verdi.
Imidlertid står tradisjonell bambusavl overfor utfordringer på grunn av det lange vegetative vekststadiet og usikker blomstringsperiode. Selv om molekylære avlsteknikker har blitt utviklet og anvendt på bambusavl, er prosessen med bambusgentransformasjon tidkrevende, arbeidsintensiv og komplisert på grunn av callus-induksjons- og regenereringsprosessene 2,3,4,5. Stabil genetisk transformasjon krever ofte Agrobacterium-medierte metoder, som involverer vevskulturprosesser som kallusinduksjon og regenerering. Imidlertid har bambus en lav evne til kallusregenerering, noe som i stor grad begrenser anvendelsen av stabil genetisk transformasjon i bambus. Etter at Agrobacterium infiserer planteceller, kommer T-DNA-fragmentet inn i plantecellene, med flertallet av T-DNA-fragmenter som forblir ikke-integrert i cellene, noe som resulterer i forbigående ekspresjon. Bare en liten del av T-DNA-fragmentene integreres tilfeldig i kromosomet, noe som fører til stabilt uttrykk. De forbigående ekspresjonsnivåene viser en akkumuleringskurve som kan variere for hvert gen uttrykt fra et Agrobacterium-levert T-DNA. I de fleste tilfeller oppstår de høyeste uttrykksnivåene 3-4 dager etter infiltrasjon og reduseres raskt etter 5-6 dager 6,7. Tidligere studier har vist at mer enn 1/3 av mutasjonene i genredigerte planter oppnådd uten seleksjonspress for resistens kommer fra det forbigående uttrykket av CRISPR/Cas9, mens de resterende mindre enn 2/3 kommer fra stabilt uttrykk etter DNA-integrasjon i genomet8. Dette indikerer at T-DNA-integrasjon i plantegenomet ikke er nødvendig for genredigering. Videre hemmer seleksjonstrykk for resistens signifikant veksten av ikke-transgene celler, som direkte påvirker regenereringsprosessen av infiserte eksplanter. Ved å bruke transient ekspresjon uten seleksjonspress for resistens i bambus, er det derfor mulig å oppnå ikke-integrert ekspresjon av eksogene gener og studere genfunksjon direkte i planteorganer. Derfor kan en enkel og tidsbesparende metode utvikles for eksogent genuttrykk og redigering i bambus9.
Den utviklede eksogene genuttrykks- og genredigeringsmetoden er preget av dens enkelhet, kostnadseffektivitet og fravær av dyrt utstyr eller komplekse prosedyrer9. I denne metoden ble bambus endogent violaxanthin de-epoxidase genet (PeVDE) brukt som reporter for eksogent genuttrykk uten seleksjonstrykk. Dette skyldes at den redigerte PeVDE i bambusblader reduserer fotobeskyttelsesevnen under høyt lys og demonstrerer en reduksjon i ikke-fotokjemisk slukking (NPQ) -verdien, som kan detekteres gjennom klorofyllfluorescensavbildning. For å demonstrere effektiviteten av denne metoden ble et annet bambus endogent gen, cinnamoyl-CoA-reduktasegenet (PeCCR5) 9, slått ut ved hjelp av dette systemet og vellykket generert mutanter av dette genet. Denne teknikken kan brukes til funksjonell karakterisering av gener som har funksjoner i bambusblader. Ved å overuttrykke disse genene forbigående i bambusblader, kan deres uttrykksnivåer forbedres, eller ved genredigering kan uttrykket deres slås ned, noe som muliggjør studier av nedstrøms genuttrykksnivåer, bladfenotyper og produktinnhold. Dette gir en mer effektiv og gjennomførbar tilnærming til genfunksjonsforskning i bambus. Denne teknikken kan brukes til funksjonell karakterisering av gener som fungerer i bambusblader. Ved å overuttrykke disse genene forbigående i bambusblader, kan deres uttrykksnivåer forbedres, eller ved genredigering kan uttrykket deres slås ned, noe som muliggjør studier av nedstrøms genuttrykksnivåer, bladfenotyper og produktinnhold. I tillegg er det viktig å merke seg at, på grunn av omfattende polyploidisering, er flertallet av kommersielt viktige gener i bamdegenomer til stede i flere kopier, noe som resulterer i genetisk redundans. Dette utgjør en utfordring for å utføre multiplex genomredigering i bambus. Før bruk av stabil genetisk transformasjon eller genredigeringsteknikker, er det avgjørende å raskt validere genfunksjoner. Ved å ta opp spørsmålet om flere genkopier, er en tilnærming å analysere transkriptomuttrykksprofiler for å identifisere gener som uttrykkes aktivt under bestemte stadier. Videre tillater målretting av de konserverte funksjonelle domenene til disse genkopiene utforming av felles målsekvenser eller inkorporering av flere målsteder i samme CRISPR / Cas9-vektor, noe som muliggjør samtidig knockout av disse genene. Dette gir en mer effektiv og gjennomførbar tilnærming til genfunksjonsforskning i bambus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tilberedning av bambusplanter
- Forbered moso bambus (Phyllostachys edulis) frøplanter ved hjelp av frø høstet i Guilin, Guangxi, Kina. Begynn med å suge frøene i vann i 2-3 dager, og sørg for å bytte vann daglig. Deretter lager du et substrat ved å blande jord og vermikulitt i forholdet 3: 1.
- Så de gjennomvåt frøene i underlaget for spiring. Vedlikehold plantene under laboratorieforhold, og hold temperaturen mellom 18-25 °C. Sørg for en 16 timers lys / 8 t mørk fotoperiode med en lysintensitet på 250-350 μmol / m2 / s i lysfasen.
- Oppretthold en relativ fuktighet på ca. 60%. For Agrobacterium-infeksjon, bruk frøplanter som er 15 dager gamle og har en høyde på 2-10 cm, som er det beste stadiet for transformasjon.
MERK: Fordi bambusblomstring er uforutsigbar, er frø ikke tilgjengelig hvert år. Frøene lagres vanligvis i 2-3 år ved 4 °C i et tørt miljø og kan fortsatt opprettholde en levedyktighet på over 20%.
2. Fremstilling av plasmider og Agrobacterium
- Plasmider: For å validere den forbigående ekspresjonseffekten, bruk pHDE-35S::RUBY-konstruksjonen som inneholder et synlig reportergen drevet av CaMV 35S-promotoren 10. For genredigering, bruk pCambia1300-Ubi::Cas9-konstruksjonen, som bærer Cas9-genet drevet av maisen Ubi-promotoren 11. Sett inn sgRNA-styringssekvensene til PeVDE og andre målgener mellom de to AarI-stedene i pCambia1300-Ubi::Cas9-konstruksjonen 9.
- Sett inn RNA-sekvensene med CRISPR/Cas9-veiledning mellom de to endonukleasestedene med AarI-restriksjon i pCambia1300-Ubi::Cas9-konstruksjonen , inkludert PeVDE - og PeCCR5-målgener .
- Legg GGCA til 5'-enden av 20-nukleotidsekvensen og syntetiser en enkeltstrenget DNA-sekvens. Omvendt komplement 20-nukleotidsekvensen og legg AAAC til 5'-enden, og syntetiser deretter en annen enkeltstrenget DNA-sekvens.
- Fortynn begge enkeltstrengede DNA-sekvenser til en konsentrasjon på 10 nM/L i fortynnet vann, bland godt og varm opp ved 95 °C i 5 minutter. La blandingen avkjøles til romtemperatur, noe som resulterer i dannelse av dobbeltstrengede adaptere.
- Koble adapterne med den lineære pCambia1300-Ubi::Cas9-fragmentet fordøyd av AarI endonuklease ved hjelp av T4 DNA-ligase og sekvenser den konstruerte CRISPR / Cas9-vektoren for å oppnå den ønskede genmålrettingskonstruksjonen.
- For å transformere plasmider til Agrobacterium, bruk fryse-tine-metoden som følger: Bland 1 μL av plasmidene (konsentrasjon: 10 - 1000 ng / μL) med 100 μL Agrobacterium-kompetente celler (oversettelseseffektivitet: > 1 x 104 kolonidannende enheter / μg) og bland dem forsiktig. Legg blandingen på is i 5 min. Overfør blandingen til flytende nitrogen i 5 minutter.
- Tine blandingen i et vannbad på 37 °C i 5 minutter. Tilsett 500 μL Luria-Bertani (LB) medium til blandingen og inkuber den på en ristende inkubator ved 28 ° C ved 200 o / min i 2-3 timer. For pHDE-35S::RUBY-plasmidene, introduser dem individuelt i AGL1-, GV3101-, LBA4044- og EHA105-stammene av Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens)12. For CRISPR / Cas9-plasmidene, introduser dem i GV3101-stammen av A. tumefaciens.
- Dyrk Agrobacterium i gjærekstrakt pepton (YEP) medium (10 g biffekstrakt, 10 g gjærekstrakt og 5 g NaCl per L) med tilsvarende antibiotika (spectinomycin for 35S:: RUBY og kanamycin for CRISPR / Cas9) ved 28 ° C. Enkeltkoloniene ble observert 36-48 timer etter dyrking.
- Plukk og overfør koloniene til flytende YEP-medium (med tilhørende antibiotika) for videre vekst. Etter 24-36 timer, bruk primere av RUBY-F og RUBY-R (tabell 1) for å utføre PCR for å bekrefte vellykket overføring av plasmider til Agrobacterium.
- Overfør 1 ml av den vellykket transformerte Agrobacterium til 100 ml friskt flytende YEP-medium (med tilsvarende antibiotika) og vokse deretter over natten ved 28 ° C til en OD600 på 0,8.
- Sentrifuger bakteriesuspensjonen ved 4000 x g i 5 minutter ved 4 °C, vask bakteriepelleten én gang med suspensjonsinfiltrasjonsmedium (10 mM MgCl2 og 10 mM MES-KOH [pH 5,6]), og sentrifuge deretter igjen. Resuspender bakteriepelleten i et suspensjonsinfiltrasjonsmedium til en OD600 på 0,6 for bambustransformasjon.
3. Agrobacterium -mediert i planta transformasjonssystem
- Forbered deg på transformasjon; Fjern forsiktig plantene med jordfestede røtter fra underlaget, slik at røttene forblir intakte. Pakk plantene med tinnfolie for å opprettholde fuktighet og forhindre løsrivelse av jord (figur 1A).
- Overfør de innpakkede plantene til et miljø med høyere luftfuktighet (relativ luftfuktighet >90%) og lavere belysning (intensitet mindre enn 50 μmol / m 2 / s) i en varighet på2 timer.
- Bruk en skarp nål fra en sprøyte, vikle den øvre delen av krøllete umodne blader (ca. 1-2 cm fra toppen) av bambusplanter en eller to ganger (som indikert av de røde trekantene i figur 1A).
- Etterpå dypper du den sårede øvre delen av plantene i suspensjoner av Agrobacterium. Utfør hele prosessen, fra sår til dypping i Agrobacterium raskt, da det friske såret vil øke inokulasjonseffektiviteten.
- Overfør plantene umiddelbart til et vakuumkammer med et trykk på 25-27 mmHg i 2 minutter (figur 1B).
- Etter støvsuging, pakk forsiktig ut plantene og plant dem på nytt i underlaget. Plasser plantene i svakt lys eller mørke (<50 μmol/m 2/s) med høy luftfuktighet (RF>90%) ved romtemperatur (18-25 °C) i2 dager. Deretter dyrker plantene under normale vekstforhold, vanner dem hver 5-7 dager. Observer fenotypene deres for å gi materialer til påfølgende eksperimenter.
4. Designe single guide RNA (sgRNAs) for genredigering
- Identifiser et protospacer tilstøtende motiv (PAM) -sted som ligger i nærheten av et spesifikt og bevart domene av målgensekvensen. Forsikre deg om at den spesifikke PAM-sekvensen er NGG i dette CRISPR/Cas9-systemet. Bekreft målspesifisiteten til den valgte sekvensen ved å utføre et BlastN-søk mot bamdegenomdatabasen. Sørg for at sgRNA er unikt, spesielt i oppstrømsregionen og nær PAM 9,11.
MERK: Denne sammenligningen vil effektivt redusere potensielle off-target steder i genomet påvirket av genredigeringsprosessen. - Design to sgRNA (sgRNA-1 og sgRNA-2) på den første eksonen av PeVDE-genet 13. Inkluder alderI-begrensningssteder oppstrøms for PAM i sgRNA-1 og XbaI-begrensningssteder oppstrøms for PAM i sgRNA-2. Design ett sgRNA på den fjerde ekson av PeCCR5-genet , som koder for det konserverte motivet til KNWYCYGK. Dette motivet er kritisk for katalysen til CCR14.
- Design en 20 nukleotid avstandsstykkesekvens ved siden av PAM-stedet. Denne avstandssekvensen vil lede Cas9-enzymet til målstedet for DNA-spaltning og påfølgende genredigering.
MERK: Det anbefales å velge et målområde oppstrøms for endonukleaseenzymspaltningsstedet på PAM-stedet. Dette vil lette valideringen av genredigeringseffektivitet.
5. Primer design og PCR
- Manuelt designe spesifikke primere for forsterkning av PeVDE - og PeCCR5-fragmentene . Design oppstrøms og nedstrøms primere for å være plassert minst 100 bp utenfor målstedet, med en lengdeforskjell på over 100 bp for å muliggjøre tydelig båndseparasjon under elektroforese. Design primere for amplifisering av RUBY innen de første 500 bp av genet. En liste over alle primere som brukes er gitt i tabell 1.
- Bruk en hi-fidelity DNA-polymerase for PCR. I dette tilfellet bruker du DNA-polymerase med høy troskap og effektiv amplifisering i genkloning.
- Forbered PCR-reaksjonsblandingen som følger: 5x buffer (Mg2+ Plus): 4 μL; dNTP-blanding (2,5 mM hver): 1,6 μL; Forover- og bakoverprimere (10 pmol hver): 1 μL hver; bambus genom DNA (ca. 50 ng); DNA-polymerase (2,5 U / μL): 0,2 μL; Fortynn vann til et totalt volum på 20 μL.
- Følg PCR-kjøreforholdene: Initial denaturering ved 98 °C i 5 minutter; Denaturering ved 98 °C i 10 s; Annealing ved 56 ° C i 5 s; Forlengelse ved 72 °C i 30 s; Gjenta denaturering til forlengelse i 32 sykluser; Endelig forlengelse ved 72 °C i 5 minutter; Hold ved 4 °C på ubestemt tid.
MERK: PCR-betingelser er gitt som et eksempel og må kanskje optimaliseres for bestemte applikasjoner eller mål.
6. DNA-ekstraksjon, endonukleaseenzymfordøyelse og sekvensering
- Skill regionen med lavere NPQ-verdier fra ferske bambusbladblad ved hjelp av saks, som identifisert av bilde-PAM-fluorometeret (se trinn 7.4). Frys bladprøvene med flytende nitrogen og overfør de frosne bladprøvene til en mørtel. Mal prøvene til et fint pulver ved hjelp av en pistill, og tilsett nok flytende nitrogen under slipeprosessen. Dette trinnet hjelper til med å frigjøre det cellulære innholdet, inkludert DNA.
- Ekstraher genomisk DNA fra pulverisert blad ved hjelp av Cetyltrimethylammonium Ammonium Bromide (CTAB) metode. Tilsett 50 mg bladpulverprøver til 800 μL av en 2% CTAB-løsning. Bland prøven grundig og rug ved 65 °C i 30 minutter, med forsiktig risting hvert 5. minutt.
- Tilsett et likt volum kloroform/isoamylalkohol (24:1, v/v) og rist blandingen kraftig. Etter sentrifugering ved 8000 g i 8 minutter, overfør supernatanten til et nytt rør.
- Tilsett et likt volum kloroform/isoamylalkohol og gjenta trinn 6.3. Tilsett like mye iskald isopropanol, og snu røret flere ganger før det legges ved -20 °C i 30 minutter. Etter sentrifugering ved 8000 x g i 5 minutter, kast supernatanten.
- Vask DNA-pelleten 2x med 75% etanol ved 4 °C, og oppløs deretter i 50 μL vann.
- Forsterk det genomiske DNA som inneholder målstedet for målgenene fra både villtype og Agrobacterium-infiserte bambusblader med protokollen i trinn 5.4.
- Utfør endonuclease enzym fordøyelse av PCR-produktene. Velg et spesifikt enzym som gjenkjenner de ønskede restriksjonsstedene i de amplifiserte DNA-fragmentene. Bruk alderI og XbaI endonukleaser for fordøyelsen.
- Forbered en reaksjonsblanding bestående av alderI eller XbaI (20 enheter / μL) - 1 μL, 1 μg PCR-produkter, 10x buffer- 5 μL, og tilsett vann til et totalt volum på 50 μL. Inkuber ved 37 ° C i 1 time.
- Analyser andelen fordøyde DNA-fragmenter ved hjelp av gelelektroforese. Sammenlign de fordøyede fragmentene fra villtype- og Agrobacterium-infiserte prøver for å vurdere genredigeringseffektiviteten.
- Merk transposaseadapteren TCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGACAG og GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG-sekvensene til henholdsvis 5'-enden av forover- og bakoverprimerne for forsterkning av PeVDE- og PeCCR5-fragmentene 9,15. Bruk protokollen beskrevet i trinn 5.4 for forsterkning. Forbered PCR-produktene (før fordøyelsen) for dyp sekvensering.
7. Måling av klorofyllfluorescens av NPQ-verdier i blader
- Før målingene, utsett bambusplantene for høye lysintensitetsforhold på 1200 μmol / m 2 / s i2 timer. Denne eksponeringen øker mengden absorbert lyskvantum og aktiverer fotobeskyttelsessystemet i bladene.
- Bruk et imaging-PAM-fluorometer for å måle in vivo PS II klorofyllfluorescens av bambusblader. Sett aktinisk lysintensitet til 800 μmol/m2/s i 6 minutter fluorescensmålinger. I løpet av denne perioden, bruk en mettende puls hver 30. s for å oppnå klorofyllfluorescenskurver. De stabile verdiene på kurvene vil bli brukt til beregninger13.
- Beregn ikke-fotokjemisk slukking (NPQ) ved hjelp av formelen:
NPQ = (F m - F m') / Fm'
hvor F m representerer maksimal fluorescens i mørktilpasset tilstand, og Fm 'representerer maksimal fluorescens i enhver lystilpasset tilstand. - Overvåk NPQ-verdiene fra det visuelle grensesnittet til bildebehandlingsprogramvaren. Programvaren tillater sanntidsanalyse og visning av fluorescensdataene, inkludert NPQ-verdiene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Agrobacterium-mediert i planta genuttrykk i bambusblader
RUBY reporter-genet har vist seg å være effektivt for å visualisere forbigående genuttrykk på grunn av dets evne til å produsere levende rød betalain fra tyrosin10. I denne studien ble Agrobacterium-mediert transformasjon benyttet til å transient uttrykke det eksogene RUBY-genet i bambusblader (figur 1). På 3dager etter infeksjon ble rød farge observert i de umodne brettede bladene, som ble mer levende på den 5. dagen når bladene hadde utfoldet seg (blå trekant, figur 1C). Disse resultatene viser at Agrobacterium vellykket medierte uttrykket av det eksogene RUBY-genet i bambusblader, og at betalainsyntese skjedde.
Videre ble fire stammer av Agrobacterium (AGL1, LBA4404, EHA105 og GV3101) sammenlignet og funnet at GV3101-stammen forårsaket den mest signifikante betalainakkumuleringen i infiserte bambusblader, med den høyeste prosentandelen på 85,2% av plantene akkumulert betalain etter å ha blitt smittet, etterfulgt av AGL1 (76,9%) og deretter EHA105 (49,1%) og LBA4404 (31,3%; Figur 1D). Dette antyder at GV3101 er den mest egnede stammen for dette formålet. High-fidelity PCR ble utført for å oppdage om Agrobacterium-mediert T-DNA-fragment hadde integrert seg i bambuskromosomet. Etter 40 sykluser med PCR ble det ikke påvist noen bånd av RUBY-genet , noe som indikerer at T-DNA-fragmentet ikke ble integrert eller var integrert i et så lavt antall at det ikke kunne oppdages. Dermed konkluderer disse resultatene med at dette genuttrykket er forbigående.
Samlet sett viser disse funnene muligheten for Agrobacterium-mediert forbigående i planta-genuttrykk i bambus ved bruk av RUBY-reportergenet . Imidlertid ble den røde betalainfargen funnet å være ustabil og forsvant etter 3 måneders infeksjon, noe som indikerer at det forbigående ekspresjonssystemet ikke er stabilt for langtidsobservasjon.
I planta genet redigering av bambus violaxanthin de-epoxidase genet (PeVDE)
Agrobacterium-mediert i planta genuttrykk er en forbigående metode for genuttrykk i bambus. For å undersøke om et forbigående CRISPR / Cas9-system kunne oppnå genredigering i bambusblader, ble nøkkelenzymet i bambusens xantofyllsyklus, violaxanthin de-epoxidase (PeVDE), valgt som et mål for forsøksgenredigering. Single guide RNA (sgRNA) ble designet på den første ekson av PeVDE-genet (sgRNA-1), som inneholder restriksjonssteder for alderI oppstrøms for protospacer tilstøtende motiv (PAM) for å lette genredigeringsvalidering (figur 2A).
CRISPR / Cas9-konstruksjonen som bærer sgRNA-1 ble transfektet til Agrobacterium for å transformere bambusblader. Etter infeksjon av Agrobacterium som inneholdt CRISPR / Cas9-konstruksjonene som bærer sgRNA-1 i 5 dager, ble bambusplanter utsatt for høy lysbehandling, og deretter ble klorofyllfluorescensparameterdeteksjon utført. Visse områder av bladbladene ble funnet som hadde lavere ikke-fotokjemiske slukkeverdier (NPQ) (figur 2B), noe som indikerer at fotobeskyttelsesevnen til disse områdene ble redusert under intenst lys. Siden PeVDE-genet har kapasitet til å spre overflødig absorbert lysenergi13, vil disse områdene med lavere NPQ-verdier sannsynligvis være regionene der PeVDE-genet ble redigert. Deretter ble enzymfordøyelse og sekvenseringsanalyse utført av PeVDE-genfragmentet i disse områdene av bladbladene (figur 2C-D), og det ble funnet at mutasjonshastigheten til sgRNA-1 var 17,33%, noe som indikerer at genredigering var vellykket i disse områdene av PeVDE-genet.
I tillegg ble et annet sgRNA-målrettingssted, sgRNA-2, som inneholder et XbaI-begrensningssted, designet på den første eksonen av PeVDE. For å undersøke muligheten for lang fragmentdelesjon med dobbel sgRNA-målretting ble det utført genredigering på begge målstedene, noe som resulterte i lang fragmentdelesjon (figur 2E).
Redigert PeVDE-mutant brukt som reporter i det forbigående genredigeringssystemet
Hvorvidt PeVDE sgRNA kunne fungere som reporter i det forbigående genredigeringssystemet ble undersøkt. Cinnamoyl-CoA-reduktase (PeCCR5)-genet (gen-ID: PH02Gene42984.t1) ble tilfeldig valgt for å evaluere PeVDE-reporteren . Et sgRNA-mål for PeCCR5 ble designet i sitt konserverte motiv på den fjerde eksonen. CRISPR/Cas9-konstruksjonen som bærer begge sgRNAene, PeVDE og PeCCR5, ble omdannet til bambusblader (figur 3A).
Etter Agrobacterium-infeksjon i 30 dager ble plantene behandlet med høy intensitetslys i 20 minutter. Det ble observert at bare bladområdene redigert for PeCCR5-genet ikke hadde noen effekt på NPQ-verdier, mens bladområdene transfektet av sgRNA av både PeVDE og PeCCR5 viste lavere NPQ-verdier (figur 3B).
Deretter ble PeCCR5-fragmentet fra bladområdene med lavere NPQ-verdier forsterket og sekvensert og fant en mutasjonseffektivitet på 8,3% ved bruk av dyp sekvensering. Derfor fungerte PeVDE-reporteren vellykket som en forbigående genredigeringsreporter og kan brukes til å screene for genredigering av andre endogene bambusgener.
Samlet sett viser disse resultatene muligheten for bambusgenredigering ved bruk av CRISPR / Cas9 i bambus.
Figur 1: I planta-ekspresjon av RUBY-gen og betalainakkumulering i moso bambusblader. (A) Moso bambusplanter innpakket i tinnfolie og klar for Agrobacterium-infeksjon, med røde trekanter som indikerer stillinger som ble såret av en skarp nål fra en sprøyte. (B) Vakuuminfiltrasjonsprosess av bambusplanter. (C) Betalain akkumulering i bambusblader etter 3 dager med infeksjon observert gjennom fenotypiske endringer. (D) Her ble fire Agrobacterium-stammer, AGL1, LBA4404, EHA105 og GV3101-mediert RUBY-gentransformasjon i bambusblader utført. GV3101 som huser GFP-konstruksjonen ble brukt som en negativ kontroll. Dette tallet er endret fra9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: I planteuttrykk og genredigering av PeVDE-genet i bambusblader. (A) Plassering og målsekvensinformasjon av sgRNA i PeVDE-genet. Røde trekanter indikerer primernes posisjoner forover og bakover for fragmentforsterkning. (B) NPQ og rå avbildning av bambusblader etter infeksjon. Tall i NPQ-bildet representerer NPQ-verdier i bildebehandlingsprogramvaremonitoren. (C) Elektroforeseresultater av PeVDE-fragment før og etter alderI fordøyelse. WT betegner villtype ikke-infiserte blader, og + og - representerer PeVDE-fragmenter med eller uten alderI fordøyelse, henholdsvis. (D) Dype sekvenseringsresultater av PeVDE-fragmentet i lavere NPQ-verdi blader. De røde, blå og grå skriftene i sekvensene representerer henholdsvis målområdene, PAM og innsettinger. De røde strekene indikerer slettede nukleotider. (E) Sanger-sekvenseringsresultater av PeVDE-fragmentet etter redigering av både sgRNA-1 og sgRNA-2. Dette tallet er endret fra9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: PeVDE sgRNA som reporter for screening av genredigering av PeCCR5. (A) Skjematisk fremstilling av CRISPR/Cas9-konstruksjoner som inneholder PeVDE- og PeCCR5 sgRNAer. (B) NPQ og råbilder av bambusblader etter infeksjon med konstruksjonene i (A). Hvite trekanter indikerer områder med lavere NPQ-verdier. Regnbuefargen representerer verdien av NPQ/4, der rødt tilsvarer minimumsverdien og lilla tilsvarer 1. (C) De røde, blå og grå skriftene i sekvensene representerer henholdsvis målområdene, PAM og innsettinger. De røde strekene indikerer slettede nukleotider. Dette tallet er endret fra9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Gennavn | Primer-sekvens (5'-3') | Søknad | ||
| RUBIN | F: ATGGATCATGCGACCCTCG | For PCR-amplifikasjon i infiserte bambusblader | ||
| R: GTACTCGTAGAGCTGCTGCAC | ||||
| PeVDE | F: TGTGGCTTCTAAAGCTCTGCAATCT | For genkloning og sekvensering | ||
| R: TGTCAATGCTACAAGTCCTGGCA | ||||
| PeVDE-mål1 | F: GGCATAGCCCTCACGCAGCACCGG | For utforming av PeVDE sgRNA-1-mål | ||
| R: AAACCCGGTGCTGCGTGAGGGCTA | ||||
| PeVDE-mål2 | F: GGCACTCCACGGTCCCAAATCTAG | For utforming av PeVDE sgRNA-2-mål | ||
| R: AAACCTAGATTTGGGACCGTGGAG | ||||
| PeCCR5-mål | F: GGCACTGGTACTGCTACGCTAAGA | For utforming av PeCCR5 sgRNA-mål | ||
| R: AAACTCTTAGCGTAGCAGTACCAG | ||||
Tabell 1: Sekvensinformasjonen til primere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metoden reduserer tiden som kreves betydelig sammenlignet med tradisjonelle genetiske transformasjonsmetoder, som vanligvis tar 1-2 år, og oppnår forbigående ekspresjon av eksogene gener og genredigering av endogene gener innen 5 dager. Denne metoden har imidlertid begrensninger, da den bare kan transformere en liten andel celler, og de genredigerte bladene er kimære og mangler evnen til å regenerere til komplette planter. Likevel gir dette i planta genuttrykk og genredigeringsteknologi en kraftig tilnærming til funksjonell verifisering av endogene bambusgener.
For tiden kan genuttrykk og genredigeringsteknologi i planta bare utføres i umodne (krøllete) blader, ikke i modne blader. Etter hvert som bladene utfolder seg og forstørres, øker antallet genredigerte celler som gjennomgår deling, noe som muliggjør genredigering i bestemte bladregioner. Den anvendte Agrobacterium-medierte transformasjonsmetoden resulterer imidlertid ikke i innsetting av det eksogene T-DNA i bambuskromosomet, noe som gjør det vanskelig å bruke stabile markørgener i bambus 6,9. Derfor er det utfordrende å fastslå den nøyaktige plasseringen av disse regionene. For å løse dette ble PeVDE-genet redigert, og det redigerte området viste en redusert fotobeskyttelsesevne under høy lysbehandling, som indikert av lavere NPQ-verdier, som lett kan oppdages ved hjelp av et klorofyllfluorometer imaging-PAM. Dermed ble PeVDE utviklet som en markør i bambus for å oppdage forekomsten av eksogent genuttrykk og genredigering. På grunn av den høye bevaringen av dette genet på tvers av forskjellige arter 13, kan det også brukes mye på andre planter.
På grunn av avsetning av et kutikulært vokslag på epidermis av bambusblader, kombinert med den karakteristiske krøllede og tett innpakkede morfologien til umodne blader, hindres tilgjengeligheten av Agrobacterium til bladceller betydelig. For å forbedre effektiviteten av Agrobacterium-infeksjon, har fysiske tilnærminger, inkludert sår- og vakuuminfiltrasjon, blitt brukt for å fremme inntrengning av Agrobacterium i de lukkede krøllete bambusbladene. Denne prosessen muliggjør nærhet mellom Agrobacterium og bladcellene, og forbedrer dermed effektiviteten av genetisk transformasjon. I mellomtiden har dette genredigeringssystemet hittil vært begrenset til bambusblader og kan ikke uttrykkes i organer med reproduksjonsevne, for eksempel frø og laterale knopper som kan arves av neste generasjon. Fremtidige anvendelser av teknikken vil bli optimalisert for å oppnå in-planta genuttrykk og genredigeringsteknologi i organer med reproduktiv evne, med sikte på å oppnå stabilt arvelige regenererende planter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2021YFD2200502), National Natural Science Foundation of China (Grant nr. 31971736) for den økonomiske støtten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35S::RUBY | Addgene, United States | 160908 | Plamid construct |
| Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1 | Biomed, China | BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01 | For Agrobacterium infection |
| CTAB | Sigma-Aldrich, United States | 57-09-0 | DNA extraction |
| Imaging-PAM fluorometer | Walz, Effeltrich, Germany | Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves | |
| ImagingWin | Walz, Effeltrich, Germany | Software for Imaging-PAM fluorometer | |
| Paq CI or Aar I | NEB, United States | R0745S | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
| PrimeSTAR Max DNA polymerase | Takara, Japan | R045Q | For gene cloning |
| T4 DNA ligase | NEB, United States | M0202V | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
References
- Jiang, Z. H. World Bamboo and Rattan (in Chinese). , Liaoning Science and Technology Publishing House. Shenyang, China. (2002).
- Ye, S., et al. An efficient plant regeneration and transformation system of ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) started from young shoot as explant. Frontiers in Plant Science. 8, 1298 (2017).
- Ye, S., et al. Robust CRISPR/Cas9 mediated genome editing and its application in manipulating plant height in the first generation of hexaploid Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro). Plant Biotechnology Journal. 18 (7), 1501-1503 (2020).
- Xiang, M., et al. Production of purple Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) with enhanced drought and cold stress tolerance by engineering anthocyanin biosynthesis. Planta. 254 (3), 50 (2021).
- Huang, B., et al. An efficient genetic transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing system for moso bamboo (Phyllostachys edulis). Frontiers in Plant Science. 13, 822022 (2022).
- Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods in Molecular Biology. 323, 225-229 (2006).
- Canto, T. Transient expression systems in plants: potentialities and constraints. Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).
- Chen, L., et al. A method for the production and expedient screening of CRISPR/Cas9-mediated non-transgenic mutant plants. Horticulture Research. 5, 13 (2018).
- Sun, H., et al. A new biotechnology for in-planta gene editing and its application in promoting flavonoid biosynthesis in bamboo leaves. Plant Methods. 19 (1), 20 (2023).
- He, Y., Zhang, T., Sun, H., Zhan, H., Zhao, Y. A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation. Horticulture Research. 7 (1), 152 (2020).
- Wang, C., Shen, L., Fu, Y., Yan, C., Wang, K. A simple CRISPR/Cas9 system for multiplex genome editing in rice. Journal of Genetics and Genomics. 42 (12), 703-706 (2015).
- McCormick, S., et al. Leaf disc transformation of cultivated tomato (L. esculentum) using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Reports. 5 (2), 81-84 (1986).
- Lou, Y., et al. a violaxanthin de-epoxidase gene from moso bamboo, confers photoprotection ability in transgenic Arabidopsis under high light. Frontiers in Plant Science. 13, 927949 (2022).
- Zhou, R., et al. Distinct cinnamoyl CoA reductases involved in parallel routes to lignin in Medicago truncatula. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17803-17808 (2010).
- De Roeck, A., et al. Deleterious ABCA7 mutations and transcript rescue mechanisms in early onset Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 134 (3), 475-487 (2017).
