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Biology

प्लांटा में। मोसो बांस की पत्तियों में जीन अभिव्यक्ति और जीन संपादन

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65799
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Key Laboratory of State Forestry and Grassland Administration/Beijing on Bamboo & Rattan Science and Technology, 2Institute of Gene Science and Industrialization for Bamboo and Rattan Resources, International Centre for Bamboo and Rattan

Summary

इस अध्ययन में, बांस में एग्रोबैक्टीरियम द्वारा मध्यस्थता में प्लांटा जीन अभिव्यक्ति और जीन संपादन विधि में एक उपन्यास विकसित किया गया था। इस विधि ने बांस में जीन फ़ंक्शन सत्यापन की दक्षता में काफी सुधार किया, जिसमें बांस प्रजनन की प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं।

Abstract

बांस के लिए प्लांटा जीन परिवर्तन विधि में एक नया विकसित किया गया था, जो समय लेने वाली और श्रम-गहन कैलस प्रेरण और पुनर्जनन प्रक्रियाओं की आवश्यकता से बचता है। इस विधि में बांस के पौधों के लिए घाव और वैक्यूम के माध्यम से एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता जीन अभिव्यक्ति शामिल है। इसने बांस के पत्तों में बहिर्जात जीन, जैसे रूबी रिपोर्टर और कैस 9 जीन की अभिव्यक्ति का सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया। रूबी रोपाई में बीटालेन के संचय के लिए उच्चतम परिवर्तन दक्षता जीवी 3101 तनाव का उपयोग करके हासिल की गई थी, जिसमें संक्रमण के बाद 85.2% का प्रतिशत था। हालांकि विदेशी डीएनए बांस जीनोम में एकीकृत नहीं था, लेकिन विधि बहिर्जात जीन को व्यक्त करने में कुशल थी। इसके अलावा, इस विधि का उपयोग करके एक देशी रिपोर्टर के साथ एक जीन संपादन प्रणाली भी विकसित की गई है, जिसमें से बांस के पत्तों में संपादित बांस वायोलाक्सैंथिन डी-एपोऑक्सीडेज जीन (पीईवीडीई) द्वारा उत्पन्न एक सीटू उत्परिवर्ती, 17.33% की उत्परिवर्तन दर के साथ। पीईवीडीई के उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप उच्च प्रकाश के तहत गैर-फोटोकैमिकल शमन (एनपीक्यू) मूल्यों में कमी आई, जिसे फ्लोरोमीटर द्वारा सटीक रूप से पता लगाया जा सकता है। यह संपादित पीईवीडीई को बांस में बहिर्जात और अंतर्जात जीन दोनों के लिए एक संभावित देशी रिपोर्टर बनाता है। पीईवीडीई के रिपोर्टर के साथ, एक सिनामॉयल-सीओए रिडक्टेस जीन को 8.3% की उत्परिवर्तन दर के साथ सफलतापूर्वक संपादित किया गया था। यह ऑपरेशन ऊतक संवर्धन या कैलस प्रेरण की प्रक्रिया से बचता है, जो बांस में बहिर्जात जीन और अंतर्जात जीन संपादन को व्यक्त करने के लिए त्वरित और कुशल है। यह विधि जीन फ़ंक्शन सत्यापन की दक्षता में सुधार कर सकती है और बांस में प्रमुख चयापचय मार्गों के आणविक तंत्र को प्रकट करने में मदद करेगी।

Introduction

बांस में जीन फ़ंक्शन की जांच बांस की उन्नत समझ और आनुवंशिक संशोधन के लिए इसकी क्षमता को अनलॉक करने के लिए बहुत वादा करती है। इसका एक प्रभावी तरीका बांस के पत्तों में एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता संक्रमण की प्रक्रिया के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, जिससे बहिर्जात जीन युक्त टी-डीएनए टुकड़ा कोशिकाओं में पेश किया जाता है, बाद में पत्ती कोशिकाओं के भीतर जीन की अभिव्यक्ति होती है।

बांस विनिर्माण, कला और अनुसंधान में अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ एक मूल्यवान और नवीकरणीय संसाधन है। बांस में उच्च यांत्रिक शक्ति, क्रूरता, मध्यम कठोरता और लचीलापन1 जैसे उत्कृष्ट लकड़ी के गुण होते हैं, जो अब विभिन्न प्रकार की घरेलू और औद्योगिक आपूर्ति में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, जिसमें टूथब्रश, स्ट्रॉ, बटन, डिस्पोजेबल टेबलवेयर, भूमिगत पाइपलाइन और थर्मल पावर उत्पादन के लिए कूलिंग टॉवर फिलर्स शामिल हैं। इसलिए, प्लास्टिक को बदलने और प्लास्टिक के उपयोग को कम करने, पर्यावरण की रक्षा करने और जलवायु परिवर्तन से निपटने के साथ-साथ महत्वपूर्ण आर्थिक मूल्य उत्पन्न करने के लिए उत्कृष्ट लकड़ी के गुणों के साथ बांस की किस्मों को प्राप्त करने में बांस प्रजनन महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

हालांकि, पारंपरिक बांस प्रजनन को लंबे वनस्पति विकास चरण और अनिश्चित फूलों की अवधि के कारण चुनौतियों का सामना करना पड़ता है। यद्यपि आणविक प्रजनन तकनीकों को विकसित किया गया है और बांस प्रजनन पर लागू किया गया है, बांस जीन परिवर्तन की प्रक्रिया समय लेने वाली, श्रम-गहन और कैलस प्रेरण और पुनर्जननप्रक्रियाओं 2,3,4,5 के कारण जटिल है। स्थिर आनुवंशिक परिवर्तन के लिए अक्सर एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता विधियों की आवश्यकता होती है, जिसमें कैलस प्रेरण और पुनर्जनन जैसी ऊतक संवर्धन प्रक्रियाएं शामिल होती हैं। हालांकि, बांस में कैलस पुनर्जनन की कम क्षमता होती है, जो बांस में स्थिर आनुवंशिक परिवर्तन के आवेदन को बहुत सीमित करती है। एग्रोबैक्टीरियम पौधों की कोशिकाओं को संक्रमित करने के बाद, टी-डीएनए टुकड़ा पौधे की कोशिकाओं में प्रवेश करता है, जिसमें अधिकांश टी-डीएनए टुकड़े कोशिकाओं में गैर-एकीकृत रहते हैं, जिसके परिणामस्वरूप क्षणिक अभिव्यक्ति होती है। टी-डीएनए टुकड़ों का केवल एक छोटा सा हिस्सा यादृच्छिक रूप से अपने गुणसूत्र में एकीकृत होता है, जिससे स्थिर अभिव्यक्ति होती है। क्षणिक अभिव्यक्ति स्तर एक संचय वक्र दिखाते हैं जो एग्रोबैक्टीरियम-वितरित टी-डीएनए से व्यक्त प्रत्येक जीन के लिए भिन्न हो सकता है। ज्यादातर मामलों में, उच्चतम अभिव्यक्ति स्तर घुसपैठ के 3-4 दिन बाद होता है और 5-6 दिनों के बाद जल्दी से कम होजाता है 6,7। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि प्रतिरोध के लिए चयन दबाव के बिना प्राप्त जीन-संपादित पौधों में 1/3 से अधिक उत्परिवर्तन सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 की क्षणिक अभिव्यक्ति से आते हैं, जबकि शेष 2/3 से कम जीनोम8 में डीएनए एकीकरण के बाद स्थिर अभिव्यक्ति से आते हैं। यह इंगित करता है कि जीन संपादन के लिए पौधे जीनोम में टी-डीएनए एकीकरण आवश्यक नहीं है। इसके अलावा, प्रतिरोध के लिए चयन दबाव गैर-ट्रांसजेनिक कोशिकाओं के विकास को काफी हद तक रोकता है, सीधे संक्रमित खोजों की पुनर्जनन प्रक्रिया को प्रभावित करता है। इसलिए, बांस में प्रतिरोध के लिए चयन दबाव के बिना क्षणिक अभिव्यक्ति का उपयोग करके, बहिर्जात जीन की गैर-एकीकृत अभिव्यक्ति प्राप्त करना और पौधे के अंगों में सीधे जीन फ़ंक्शन का अध्ययन करना संभव है। इसलिए, बांस9 में बहिर्जात जीन अभिव्यक्ति और संपादन के लिए एक आसान और समय की बचत विधि विकसित की जा सकती है।

विकसित बहिर्जात जीन अभिव्यक्ति और जीन संपादन विधि को इसकी सादगी, लागत-प्रभावशीलता और महंगे उपकरण याजटिल प्रक्रियाओं की अनुपस्थिति की विशेषता है। इस विधि में, बांस अंतर्जात वियोलैक्सैंथिन डी-एपोऑक्सीडेज जीन (पीईवीडीई) का उपयोग चयन दबाव के बिना बहिर्जात जीन अभिव्यक्ति के लिए रिपोर्टर के रूप में किया गया था। ऐसा इसलिए है क्योंकि बांस के पत्तों में संपादित पीईवीडीई उच्च प्रकाश के तहत फोटोप्रोटेक्शन क्षमता को कम करता है और गैर-फोटोकैमिकल शमन (एनपीक्यू) मूल्य में कमी को दर्शाता है, जिसे क्लोरोफिल फ्लोरेसेंस इमेजिंग के माध्यम से पता लगाया जा सकता है। इस पद्धति की प्रभावशीलता को प्रदर्शित करने के लिए, एक और बांस अंतर्जात जीन, सिनामॉयल-सीओए रिडक्टेस जीन (पेसीसीआर 5)9, को इस प्रणाली का उपयोग करके बाहर कर दिया गया और सफलतापूर्वक इस जीन के उत्परिवर्ती उत्पन्न हुए। इस तकनीक का उपयोग उन जीनों के कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए किया जा सकता है जिनके बांस के पत्तों में कार्य होते हैं। बांस की पत्तियों में इन जीनों को क्षणिक रूप से अतिरंजित करके, उनकी अभिव्यक्ति के स्तर को बढ़ाया जा सकता है, या जीन संपादन द्वारा, उनकी अभिव्यक्ति को नीचे गिराया जा सकता है, जिससे डाउनस्ट्रीम जीन अभिव्यक्ति स्तर, पत्ती फेनोटाइप और उत्पाद सामग्री के अध्ययन की अनुमति मिलती है। यह बांस में जीन फ़ंक्शन अनुसंधान के लिए एक अधिक कुशल और व्यवहार्य दृष्टिकोण प्रदान करता है। इस तकनीक को बांस के पत्तों में कार्य करने वाले जीन के कार्यात्मक लक्षण वर्णन पर लागू किया जा सकता है। बांस की पत्तियों में इन जीनों को क्षणिक रूप से अतिरंजित करके, उनकी अभिव्यक्ति के स्तर को बढ़ाया जा सकता है, या जीन संपादन द्वारा, उनकी अभिव्यक्ति को नीचे गिराया जा सकता है, जिससे डाउनस्ट्रीम जीन अभिव्यक्ति स्तर, पत्ती फेनोटाइप और उत्पाद सामग्री के अध्ययन की अनुमति मिलती है। इसके अतिरिक्त, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि, व्यापक पॉलीप्लोइडाइजेशन के कारण, बांस जीनोम में व्यावसायिक रूप से महत्वपूर्ण जीन के बहुमत कई प्रतियों में मौजूद होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप आनुवंशिक अतिरेक होता है। यह बांस में मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन करने के लिए एक चुनौती है। स्थिर आनुवंशिक परिवर्तन या जीन संपादन तकनीकों के आवेदन से पहले, जीन कार्यों को जल्दी से मान्य करना महत्वपूर्ण है। कई जीन प्रतियों के मुद्दे को संबोधित करने में, एक दृष्टिकोण विशिष्ट चरणों के दौरान सक्रिय रूप से व्यक्त किए जाने वाले जीन की पहचान करने के लिए ट्रांसस्क्रिप्टम अभिव्यक्ति प्रोफाइल का विश्लेषण करना है। इसके अलावा, इन जीन प्रतियों के संरक्षित कार्यात्मक डोमेन को लक्षित करने से सामान्य लक्ष्य अनुक्रमों के डिजाइन या एक ही सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 वेक्टर में कई लक्ष्य साइटों को शामिल करने की अनुमति मिलती है, जिससे इन जीनों के एक साथ नॉकआउट को सक्षम किया जा सकता है। यह बांस में जीन फ़ंक्शन अनुसंधान के लिए एक अधिक कुशल और व्यवहार्य दृष्टिकोण प्रदान करता है।

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Protocol

1. बांस के पौधों की तैयारी

  1. गुइलिन, गुआंग्शी, चीन में काटे गए बीजों का उपयोग करके मोसो बांस (फाइलोस्टेचिस एडुलिस) के पौधे तैयार करें। बीज को 2-3 दिनों के लिए पानी में भिगोकर शुरू करें, रोजाना पानी बदलना सुनिश्चित करें। इसके बाद, 3: 1 के अनुपात में मिट्टी और वर्मीक्यूलाइट को मिलाकर एक सब्सट्रेट बनाएं।
  2. अंकुरण के लिए भीगे हुए बीजों को सब्सट्रेट में बोएं। तापमान को 18-25 डिग्री सेल्सियस के बीच रखते हुए, प्रयोगशाला स्थितियों के तहत रोपाई बनाए रखें। प्रकाश चरण के दौरान 250-350 μmol/m2/s की प्रकाश तीव्रता के साथ 16 घंटे प्रकाश /8 घंटे की अंधेरे फोटोअवधि सुनिश्चित करें।
  3. लगभग 60% की सापेक्ष आर्द्रता बनाए रखें। एग्रोबैक्टीरियम-संक्रमण के लिए, उन रोपाई का उपयोग करें जो 15 दिन पुराने हैं और जिनकी ऊंचाई 2-10 सेमी है, जो परिवर्तन के लिए सबसे अच्छा चरण है।
    नोट: क्योंकि बांस का फूल अप्रत्याशित है, बीज हर साल उपलब्ध नहीं होते हैं। बीज आमतौर पर शुष्क वातावरण में 4 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 साल तक संग्रहीत किए जाते हैं और अभी भी 20% से अधिक की व्यवहार्यता बनाए रख सकते हैं।

2. प्लास्मिड और एग्रोबैक्टीरियम की तैयारी

  1. प्लास्मिड: क्षणिक अभिव्यक्ति प्रभाव को मान्य करने के लिए, पीएचडीई -35 एस को नियोजित करें:: रूबी निर्माण जिसमें सीएएमवी 35 एस प्रमोटर10 द्वारा संचालित एक दृश्यमान रिपोर्टर जीन होता है। जीन संपादन के लिए, pCambia1300-Ubi::Cas9 निर्माण का उपयोग करें, जो मक्का यूबी प्रमोटर11 द्वारा संचालित कैस 9 जीन को वहन करता है। pCambia1300-Ubi में दो ArI साइटों के बीच PEVDE और अन्य लक्ष्य जीन ों के sgRNA मार्गदर्शक अनुक्रम डालें:: Cas9 निर्माण9.
  2. CRISPR/Cas9 गाइड आरएनए अनुक्रमों को pCambia1300-Ubi के दो ArI प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिज़ साइटों के बीच डालें:: Cas9 निर्माण, जिसमें PeVDE और PeCCR5 लक्ष्य जीन शामिल हैं।
  3. 20-न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के 5 'अंत में जीजीसीए जोड़ें और एकल-फंसे डीएनए अनुक्रम को संश्लेषित करें। रिवर्स 20-न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम को पूरक करें और एएएसी को 5 'अंत में जोड़ें, फिर एक और एकल-फंसे डीएनए अनुक्रम को संश्लेषित करें।
  4. दोनों एकल-फंसे हुए डीएनए अनुक्रमों को पतला पानी में 10 एनएम / एल की एकाग्रता तक पतला करें, अच्छी तरह मिलाएं, और 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें। मिश्रण को कमरे के तापमान पर ठंडा होने दें, जिसके परिणामस्वरूप डबल-फंसे हुए एडेप्टर का निर्माण होता है।
  5. एडेप्टर को रैखिक pCambia1300-Ubi के साथ कनेक्ट करें:: Cas9 टुकड़ा T4 DNA लिगेज का उपयोग करके ArI एंडोन्यूक्लिज़ द्वारा पचाया जाता है और वांछित जीन-लक्ष्यीकरण निर्माण प्राप्त करने के लिए निर्मित CRISPR / Cas9 वेक्टर को अनुक्रमित करता है।
  6. प्लास्मिड को एग्रोबैक्टीरियम में बदलने के लिए, फ्रीज-पिघलाव विधि का उपयोग निम्नानुसार करें: प्लास्मिड के 1 μL (एकाग्रता: 10 - 1,000 ng / μL) को 100 μL एग्रोबैक्टीरियम-सक्षम कोशिकाओं (अनुवाद दक्षता: > 1 x 104 कॉलोनी-फॉर्मिंग-यूनिट / μg) के साथ मिलाएं और धीरे से मिलाएं। मिश्रण को 5 मिनट के लिए बर्फ पर रखें। मिश्रण को 5 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।
  7. मिश्रण को 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पिघलाएं। मिश्रण में 500 μL लुरिया-बर्टानी (एलबी) माध्यम जोड़ें और इसे 2-3 घंटे के लिए 200 आरपीएम पर 28 डिग्री सेल्सियस पर हिलाने वाले इनक्यूबेटर पर इनक्यूबेट करें। पीएचडीई -35 एस के लिए: रूबी प्लास्मिड, उन्हें एजीएल 1, जीवी 3101, LBA4044, और ईएचए 105 उपभेदों में एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेसिएन्स (ए। CRISPR / Cas9 प्लास्मिड के लिए, उन्हें A. tumefaceans के GV3101 स्ट्रेन में पेश करें।
  8. 28 डिग्री सेल्सियस पर संबंधित एंटीबायोटिक दवाओं (35 एस के लिए स्पेक्टिनोमाइसिन: : सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 के लिए रूबी और कैनामाइसिन) के साथ खमीर निकालने वाले पेप्टोन (वाईईपी) माध्यम (10 ग्राम गोमांस अर्क, 10 ग्राम खमीर अर्क, और 5 ग्राम एनएसीएल प्रति एल) में एग्रोबैक्टीरियम उगाएं। खेती के 36-48 घंटे बाद एकल कॉलोनियों को देखा गया।
  9. आगे के विकास के लिए कॉलोनियों को तरल वाईईपी माध्यम (संबंधित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ) में चुनें और स्थानांतरित करें। 24-36 घंटे के बाद, एग्रोबैक्टीरियम में प्लास्मिड के सफल हस्तांतरण की पुष्टि करने के लिए पीसीआर करने के लिए रूबी-एफ और रूबी-आर (तालिका 1) के प्राइमरों का उपयोग करें।
  10. सफलतापूर्वक रूपांतरित एग्रोबैक्टीरियम के 1 एमएल को 100 एमएल ताजा तरल वाईईपी माध्यम (संबंधित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ) में स्थानांतरित करें और फिर 28 डिग्री सेल्सियस पर 0.8 के ओडी600 तक रात भर बढ़ें।
  11. बैक्टीरियल सस्पेंशन को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 4,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, बैक्टीरियल गोली को एक बार सस्पेंशन घुसपैठ माध्यम (10 mM MgCl2 और 10 mM MES-KOH [pH 5.6]) से धोएं, और फिर फिर से सेंट्रीफ्यूज करें। बांस परिवर्तन के लिए निलंबन घुसपैठ माध्यम में बैक्टीरियल गोली को 0.6 के ओडी600 तक पुन: निलंबित करें।

3. एग्रोबैक्टीरियम-प्लांटा परिवर्तन प्रणाली में मध्यस्थता।

  1. परिवर्तन के लिए तैयार रहें; सब्सट्रेट से मिट्टी से जुड़ी जड़ों के साथ रोपाई को सावधानीपूर्वक हटा दें, यह सुनिश्चित करें कि जड़ें बरकरार रहें। नमी बनाए रखने और मिट्टी की टुकड़ी को रोकने के लिए रोपाई को टिन पन्नी के साथ लपेटें (चित्रा 1 ए)।
  2. लपेटे हुए पौधों को 2 घंटे की अवधि के लिए उच्च आर्द्रता (सापेक्ष वायु आर्द्रता >90%) और कम रोशनी (50 μmol / m2 / s से कम तीव्रता) वाले वातावरण में स्थानांतरित करें।
  3. एक सिरिंज से एक तेज सुई का उपयोग करके, बांस के पौधों के घुंघराले अपरिपक्व पत्तों (ऊपर से लगभग 1-2 सेमी) के ऊपरी हिस्से को एक या दो बार घाव करें (जैसा कि चित्र 1 ए में लाल त्रिकोण द्वारा दर्शाया गया है)।
  4. बाद में, रोपाई के घायल ऊपरी हिस्से को एग्रोबैक्टीरियम के निलंबन में डुबोएं। घाव से लेकर एग्रोबैक्टीरियम में तेजी से डुबोने तक की पूरी प्रक्रिया करें, क्योंकि ताजा घाव टीकाकरण दक्षता में वृद्धि करेगा।
  5. रोपाई को तुरंत 2 मिनट के लिए 25-27 मिमीएचजी के दबाव के साथ वैक्यूम चैंबर में स्थानांतरित करें (चित्रा 1 बी)।
  6. वैक्यूम करने के बाद, रोपाई को ध्यान से अनरैप करें और उन्हें सब्सट्रेट में फिर से लगाएं। रोपाई को 2 दिनों के लिए कमरे के तापमान (18-25 डिग्री सेल्सियस) पर उच्च आर्द्रता (आरएच >90%) के साथ मंद प्रकाश या अंधेरे (<50 μmol / m2/s) में रखें। इसके बाद, रोपाई को सामान्य विकास स्थितियों के तहत कल्चर करें, उन्हें हर 5-7 दिनों में पानी दें। बाद के प्रयोगों के लिए सामग्री प्रदान करने के लिए उनके फेनोटाइप का निरीक्षण करें।

4. जीन संपादन के लिए एकल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) डिजाइन करना।

  1. लक्ष्य जीन अनुक्रम के एक विशिष्ट और संरक्षित डोमेन के पास स्थित एक प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (पीएएम) साइट की पहचान करें। सुनिश्चित करें कि इस CRISPR / Cas9 सिस्टम में विशिष्ट PAM अनुक्रम NGG है। बांस जीनोम डेटाबेस के खिलाफ ब्लास्टएन खोज करके चयनित अनुक्रम की ऑन-टारगेट विशिष्टता की पुष्टि करें। सुनिश्चित करें कि एसजीआरएनए अद्वितीय है, खासकर अपस्ट्रीम क्षेत्र में और पीएएम 9,11 के करीब।
    नोट: यह तुलना जीन-संपादन प्रक्रिया से प्रभावित जीनोम में संभावित ऑफ-टारगेट साइटों को प्रभावी ढंग से कम कर देगी।
  2. पीईवीडीई जीन13 के पहले एक्सॉन पर दो एसजीआरएनए (एसजीआरएनए -1 और एसजीआरएनए -2) डिजाइन करें। एसजीआरएनए -1 में पीएएम के अपस्ट्रीम और एसजीआरएनए-2 में पीएएम के अपस्ट्रीम एक्सबीए आई प्रतिबंध साइटों में आयु 1 प्रतिबंधसाइटें शामिल हैं। PeCCR5 जीन के चौथे एक्सॉन पर एक एसजीआरएनए डिजाइन करें, जो KNWYCYGK के संरक्षित आकृति को एन्कोड करता है। यह आकृतिCCRs 14 के उत्प्रेरण के लिए महत्वपूर्ण है।
  3. पीएएम साइट से सटे 20 न्यूक्लियोटाइड स्पेसर अनुक्रम डिजाइन करें। यह स्पेसर अनुक्रम कैस 9 एंजाइम को डीएनए दरार और बाद में जीन संपादन के लिए लक्ष्य स्थल पर मार्गदर्शन करेगा।
    नोट: पीएएम साइट के भीतर एंडोन्यूक्लिज़ एंजाइम क्लीवेज साइट के अपस्ट्रीम एक लक्ष्य क्षेत्र का चयन करना उचित है। यह जीन संपादन दक्षता के सत्यापन की सुविधा प्रदान करेगा।

5. प्राइमर डिजाइन और पीसीआर

  1. पीईवीडीई और पेसीसीआर 5 टुकड़ों के प्रवर्धन के लिए विशिष्ट प्राइमरों को मैन्युअल रूप से डिजाइन करें। अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम प्राइमरों को लक्ष्य स्थल के बाहर कम से कम 100 बीपी स्थित होने के लिए डिज़ाइन करें, जिसमें 100 बीपी से अधिक की लंबाई का अंतर हो ताकि वैद्युतकणसंचलन के दौरान अलग-अलग बैंड पृथक्करण की अनुमति मिल सके। जीन के पहले 500 बीपी के भीतर रूबी के प्रवर्धन के लिए प्राइमरों को डिजाइन करें। उपयोग किए गए सभी प्राइमरों की एक सूची तालिका 1 में प्रदान की गई है।
  2. पीसीआर के लिए एक उच्च-निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करें। इस मामले में, जीन क्लोनिंग में उच्च निष्ठा और कुशल प्रवर्धन के साथ डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करें।
  3. पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण निम्नानुसार तैयार करें: 5x बफर (Mg2 + Plus): 4 μL; डीएनटीपी मिश्रण (2.5 एमएम प्रत्येक): 1.6 μL; आगे और रिवर्स प्राइमर (प्रत्येक 10 pmol): 1 μL प्रत्येक; बांस जीनोम डीएनए (लगभग 50 एनजी); डीएनए पोलीमरेज़ (2.5 यू / μL): 0.2 μL; पानी को 20 μL की कुल मात्रा में पतला करें।
  4. पीसीआर चलने की शर्तों का पालन करें: 5 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक विकृतीकरण; 10 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण; 5 सेकंड के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग; 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार; 32 चक्रों के लिए विस्तार के लिए विकृतीकरण दोहराएं; 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार; अनिश्चित काल तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: पीसीआर स्थितियों को एक उदाहरण के रूप में प्रदान किया जाता है और विशिष्ट अनुप्रयोगों या लक्ष्यों के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।

6. डीएनए निष्कर्षण, एंडोन्यूक्लिज़ एंजाइम पाचन, और अनुक्रमण।

  1. इमेजिंग-पीएएम फ्लोरोमीटर (चरण 7.4 देखें) द्वारा पहचाने गए कैंची का उपयोग करके ताजा बांस पत्ती ब्लेड से कम एनपीक्यू मूल्यों वाले क्षेत्र को अलग करें। पत्ती के नमूनों को तरल नाइट्रोजन के साथ फ्रीज करें और जमे हुए पत्ती के नमूनों को मोर्टार में स्थानांतरित करें। पीस ने की प्रक्रिया के दौरान पर्याप्त तरल नाइट्रोजन जोड़ते हुए, मूसल का उपयोग करके नमूनों को एक महीन पाउडर में पीस लें। यह कदम डीएनए सहित सेलुलर सामग्री को जारी करने में मदद करता है।
  2. सेटाइलट्राइमिथाइलअमोनियम अमोनियम ब्रोमाइड (सीटीएबी) विधि का उपयोग करके पाउडर पत्ती से जीनोमिक डीएनए निकालें। 2% सीटीएबी समाधान के 800 μL में 50 मिलीग्राम पत्ती पाउडर के नमूने जोड़ें। नमूने को अच्छी तरह से मिलाएं और 30 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, हर 5 मिनट में हल्के झटकों के साथ।
  3. समान मात्रा में क्लोरोफॉर्म/आइसोमाइल अल्कोहल (24:1, v/v) जोड़ें और मिश्रण को जोर से हिलाएं। 8 मिनट के लिए 8,000 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. आइसोमाइल अल्कोहल की एक समान मात्रा जोड़ें और चरण 6.3 दोहराएं। बर्फ-ठंडा आइसोप्रोपेनोल की एक समान मात्रा जोड़ें, और 30 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखने से पहले ट्यूब को कई बार उलटा करें। 5 मिनट के लिए 8,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें।
  5. डीएनए गोली 2x को 4 डिग्री सेल्सियस पर 75% इथेनॉल के साथ धोएं, फिर 50 μL पानी में घुल जाएं।
  6. चरण 5.4 में प्रोटोकॉल के साथ जंगली-प्रकार और एग्रोबैक्टीरियम-संक्रमित बांस के पत्तों दोनों से लक्ष्य जीन के लक्ष्य स्थल वाले जीनोमिक डीएनए को बढ़ाएं।
  7. पीसीआर उत्पादों के एंडोन्यूक्लिज़ एंजाइम पाचन करें। एक विशिष्ट एंजाइम का चयन करें जो प्रवर्धित डीएनए टुकड़ों के भीतर वांछित प्रतिबंध साइटों को पहचानता है। पाचन के लिए आयुI और XbaI एंडोन्यूक्लियूज़ का उपयोग करें।
  8. आयुI या XbaI (20 इकाइयाँ/μL) - 1 μL, 1 μg PCR उत्पादों, 10x बफर- 5 μL से युक्त एक अभिक्रिया मिश्रण तैयार करें, और 50 μL की कुल मात्रा में पानी जोड़ें। 1 घंटे के लिए 37 °C पर इनक्यूबेट करें।
  9. जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके पचे हुए डीएनए टुकड़ों के अनुपात का विश्लेषण करें। जीन संपादन दक्षता का आकलन करने के लिए जंगली-प्रकार और एग्रोबैक्टीरियम-संक्रमित नमूनों से पचे हुए टुकड़ों की तुलना करें।
  10. पीईवीडीई और पेसीसीआर 5 टुकड़े 9,15 के प्रवर्धन के लिए ट्रांसपोसेस एडाप्टर टीसीजीटीसीजीसीएजीसीजीटीसीजीटीजीएटीजीएटीएजीएटीएजी प्रवर्धन के लिए चरण 5.4 में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करें। गहरी अनुक्रमण के लिए पीसीआर उत्पादों (पाचन से पहले) तैयार करें।

7. पत्तियों में एनपीक्यू मूल्यों के क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति का माप।

  1. माप से पहले, बांस के पौधों को 2 घंटे के लिए 1200 μmol / m2/s की उच्च प्रकाश तीव्रता की स्थिति में उजागर करें। यह एक्सपोजर अवशोषित प्रकाश क्वांटम की मात्रा को बढ़ाता है और पत्तियों में फोटोप्रोटेक्शन सिस्टम को सक्रिय करता है।
  2. बांस के पत्तों के विवो पीएस II क्लोरोफिल फ्लोरेसेंस को मापने के लिए एक इमेजिंग-पीएएम फ्लोरोमीटर का उपयोग करें। 6 मिनट प्रतिदीप्ति माप के लिए एक्टिनिक प्रकाश तीव्रता को 800 μmol / m2 / s पर सेट करें। इस अवधि के दौरान, क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति वक्र प्राप्त करने के लिए हर 30 सेकंड में एक संतृप्त नाड़ी लागू करें। वक्रों के स्थिर मूल्यों का उपयोग गणना13 के लिए किया जाएगा।
  3. सूत्र का उपयोग करके गैर-फोटोकैमिकल शमन (एनपीक्यू) की गणना करें:
    NPQ = (F m - F m') / F m '
    जहां एफ एम अंधेरे-अनुकूलित अवस्था में अधिकतम प्रतिदीप्ति का प्रतिनिधित्व करता है, और एफएम 'किसी भी प्रकाश-अनुकूलित अवस्था में अधिकतम प्रतिदीप्ति का प्रतिनिधित्व करता है।
  4. इमेजिंग सॉफ़्टवेयर के दृश्य इंटरफ़ेस से NPQ मानों की निगरानी करें। सॉफ्टवेयर एनपीक्यू मूल्यों सहित प्रतिदीप्ति डेटा के वास्तविक समय विश्लेषण और प्रदर्शन की अनुमति देता है।

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Representative Results

बांस की पत्तियों में प्लांटा जीन अभिव्यक्ति में एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता
रूबी रिपोर्टर जीन को टायरोसिन10 से ज्वलंत लाल बीटालेन का उत्पादन करने की क्षमता के कारण क्षणिक जीन अभिव्यक्ति को देखने में प्रभावी साबित किया गया है। इस अध्ययन में, बांस के पत्तों में बहिर्जात रूबी जीन को क्षणिक रूप से व्यक्त करने के लिए एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता परिवर्तन का उपयोग किया गया था (चित्र 1)। संक्रमण के बादतीसरे दिनों में, अपरिपक्व मुड़ी हुई पत्तियों में लाल रंग देखा गया था, जो पत्तियों के सामने आने के बाद 5वें दिन अधिक ज्वलंत हो गया था (नीला त्रिकोण, चित्र 1 सी)। इन परिणामों से पता चलता है कि एग्रोबैक्टीरियम ने बांस के पत्तों में बहिर्जात रूबी जीन की अभिव्यक्ति में सफलतापूर्वक मध्यस्थता की और बीटालैन संश्लेषण हुआ।

इसके अलावा, एग्रोबैक्टीरियम के चार उपभेदों (एजीएल 1, LBA4404, ईएचए 105, और जीवी 3101) की तुलना की गई और पाया गया कि जीवी 3101 स्ट्रेन ने संक्रमित बांस के पत्तों में सबसे महत्वपूर्ण बीटालेन संचय का कारण बना, जिसमें संक्रमित होने के बाद 85.2% रोपाई जमा हुई, इसके बाद एजीएल 1 (76.9%) और फिर ईएचए 105 (49.1%) और LBA4404 (31.3%); चित्रा 1 डी)। इससे पता चलता है कि जीवी 3101 इस उद्देश्य के लिए सबसे उपयुक्त तनाव है। उच्च-निष्ठा पीसीआर यह पता लगाने के लिए आयोजित किया गया था कि क्या एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता टी-डीएनए टुकड़ा बांस गुणसूत्र में एकीकृत हो गया था। पीसीआर के 40 चक्रों के बाद, रूबी जीन के किसी भी बैंड का पता नहीं चला, यह दर्शाता है कि टी-डीएनए टुकड़ा एकीकृत नहीं था या इतनी कम संख्या में एकीकृत था कि इसका पता नहीं लगाया जा सकता था। इस प्रकार, इन परिणामों का निष्कर्ष है कि यह जीन अभिव्यक्ति क्षणिक है।

कुल मिलाकर, ये निष्कर्ष रूबी रिपोर्टर जीन का उपयोग करके बांस में प्लांटा जीन अभिव्यक्ति में एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता क्षणिक की व्यवहार्यता को प्रदर्शित करते हैं। हालांकि, लाल बीटालेन रंग अस्थिर पाया गया और संक्रमण के 3 महीने बाद गायब हो गया, यह दर्शाता है कि क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली दीर्घकालिक अवलोकन के लिए स्थिर नहीं है।

बांस के वायोलाक्सैंथिन डी-एपोऑक्सीडेज जीन (पीईवीडीई) के प्लांटा जीन संपादन में।
प्लांटा जीन अभिव्यक्ति में एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता बांस में जीन अभिव्यक्ति की एक क्षणिक विधि है। यह जांचने के लिए कि क्या एक क्षणिक सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 प्रणाली बांस के पत्तों में जीन संपादन प्राप्त कर सकती है, बांस के ज़ैंथोफिल चक्र में प्रमुख एंजाइम, वायोलाक्सैंथिन डी-एपोऑक्सीडेज (पीईवीडीई), को परीक्षण जीन संपादन के लिए एक लक्ष्य के रूप में चुना गया था। सिंगल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) को पीईवीडीई जीन (एसजीआरएनए -1) के पहले एक्सॉन पर डिजाइन किया गया था, जिसमें जीन संपादन सत्यापन (चित्रा 2 ए) की सुविधा के लिए प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (पीएएम) के ऊपर आयु1 के प्रतिबंध स्थल शामिल हैं।

CRISPR/Cas9 निर्माण में एसजीआरएनए -1 को बांस की पत्तियों को बदलने के लिए एग्रोबैक्टीरियम में स्थानांतरित किया गया था। 5 दिनों के लिए एसजीआरएनए -1 ले जाने वाले सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 संरचनाओं वाले एग्रोबैक्टीरियम के संक्रमण के बाद, बांस के पौधों को उच्च प्रकाश उपचार के अधीन किया गया था, और बाद में, क्लोरोफिल फ्लोरेसेंस पैरामीटर का पता लगाया गया था। पत्ती ब्लेड के कुछ क्षेत्र पाए गए जिनमें गैर-फोटोकैमिकल शमन (एनपीक्यू) मान कम थे (चित्रा 2 बी), यह दर्शाता है कि इन क्षेत्रों की फोटोप्रोटेक्शन क्षमता तीव्र प्रकाश के तहत कम हो गई थी। चूंकि पीईवीडीई जीन में अतिरिक्त अवशोषित प्रकाश ऊर्जा13 को नष्ट करने की क्षमता है, इसलिए कम एनपीक्यू मूल्यों वाले इन क्षेत्रों में उन क्षेत्रों के होने की संभावना है जहां पीईवीडीई जीन को संपादित किया गया था। फिर, पत्ती ब्लेड (चित्रा 2 सी-डी) के इन क्षेत्रों में पीईवीडीई जीन टुकड़े का एंजाइम पाचन और अनुक्रमण विश्लेषण किया गया और यह पाया गया कि एसजीआरएनए -1 की उत्परिवर्तन दर 17.33% थी, यह दर्शाता है कि जीन संपादन पीईवीडीई जीन के इन क्षेत्रों में सफल था।

इसके अलावा, एक और एसजीआरएनए लक्ष्यीकरण साइट, एसजीआरएनए -2, जिसमें एक्सबीएआई प्रतिबंध साइट शामिल है, को पीईवीडीई के पहले एक्सॉन पर डिज़ाइन किया गया था। दोहरे एसजीआरएनए लक्ष्यीकरण के साथ लंबे टुकड़े विलोपन की संभावना की जांच करने के लिए, दोनों लक्ष्य साइटों पर जीन संपादन किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप लंबे टुकड़े विलोपन (चित्रा 2 ई) हुआ।

संपादित पीईवीडीई उत्परिवर्ती क्षणिक जीन संपादन प्रणाली में एक रिपोर्टर के रूप में उपयोग किया जाता है।
क्या पीवीडीई एसजीआरएनए क्षणिक जीन संपादन प्रणाली में एक रिपोर्टर के रूप में काम कर सकता है, इसकी जांच की गई थी। PeVDE रिपोर्टर का मूल्यांकन करने के लिए सिनामॉयल-सीओए रिडक्टेस (PeCCR5) जीन (जीन ID: PH02Gene42984.t1) को यादृच्छिक रूप से चुना गया था। पेसीआर 5 के लिए एक एसजीआरएनए लक्ष्य चौथे एक्सॉन पर अपने संरक्षित आकृति में डिज़ाइन किया गया था। CRISPR/Cas9 निर्माण जिसमें SGRNA, PEVDE और PECCR5 दोनों शामिल थे, बांस की पत्तियों में बदल गए (चित्र 3A)।

30 दिनों के लिए एग्रोबैक्टीरियम संक्रमण के बाद, रोपाई को 20 मिनट के लिए उच्च तीव्रता वाले प्रकाश के साथ इलाज किया गया था। यह देखा गया कि केवल पीईसीसीआर 5 जीन के लिए संपादित पत्ती क्षेत्रों का एनपीक्यू मूल्यों पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा, जबकि पीईवीडीई और पीईसीसीआर 5 दोनों के एसजीआरएनए द्वारा स्थानांतरित पत्ती क्षेत्रों ने कम एनपीक्यू मूल्यों का प्रदर्शन किया (चित्रा 3 बी)।

इसके बाद, कम एनपीक्यू मूल्यों वाले पत्ती क्षेत्रों से पीईसीसीआर 5 टुकड़े को प्रवर्धित और अनुक्रमित किया गया और गहरी अनुक्रमण का उपयोग करके 8.3% की उत्परिवर्तन दक्षता पाई गई। इसलिए, पीईवीडीई रिपोर्टर ने सफलतापूर्वक एक क्षणिक जीन संपादन रिपोर्टर के रूप में कार्य किया और इसका उपयोग अन्य अंतर्जात बांस जीनों के जीन संपादन के लिए स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है।

कुल मिलाकर, ये परिणाम बांस में CRISPR / Cas9 का उपयोग करके बांस जीन संपादन की व्यवहार्यता को प्रदर्शित करते हैं।

Figure 1
चित्र 1: मोसो बांस की पत्तियों में रूबी जीन और बीटालेन संचय की प्लांटा अभिव्यक्ति में। (ए) मोसो बांस के पौधे टिन पन्नी में लपेटे जाते हैं और एग्रोबैक्टीरियम संक्रमण के लिए तैयार होते हैं, जिसमें लाल त्रिकोण होते हैं जो सिरिंज से तेज सुई से घायल होने वाली स्थितियों को दर्शाते हैं। (बी) बांस के पौधों की वैक्यूम घुसपैठ प्रक्रिया। (सी) फेनोटाइपिक परिवर्तनों के माध्यम से देखे गए संक्रमण के 3 दिनों के बाद बांस के पत्तों में बेतालेन का संचय। (घ) यहां, बांस के पत्तों में चार एग्रोबैक्टीरियम उपभेदों, एजीएल 1, LBA4404, ईएचए 105 और जीवी 3101 मध्यस्थता रूबी जीन परिवर्तन किया गया था। GFP निर्माण को आश्रय देने वाले GV3101 का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। इस आंकड़े को9 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: बांस के पत्तों में पीईवीडीई जीन की प्लांटा अभिव्यक्ति और जीन संपादन में। (ए) पीईवीडीई जीन में एसजीआरएनए का स्थान और लक्ष्य अनुक्रम जानकारी। लाल त्रिकोण टुकड़े प्रवर्धन के लिए आगे और पीछे प्राइमरों की स्थिति को इंगित करते हैं। (बी) एनपीक्यू और संक्रमण के बाद बांस के पत्तों की कच्ची इमेजिंग। एनपीक्यू छवि में संख्याइमेजिंग सॉफ्टवेयर मॉनिटर में एनपीक्यू मानों का प्रतिनिधित्व करती है। (सी) आयु1 पाचन से पहले और बाद में पीईवीडीई टुकड़े के वैद्युतकणसंचलन परिणाम। डब्ल्यूटी जंगली प्रकार के गैर-संक्रमित पत्तियों को दर्शाता है, और + और - क्रमशः आयु1 पाचन के साथ या बिना पीईवीडीई टुकड़ों का प्रतिनिधित्व करता है। (डी) कम एनपीक्यू मान पत्तियों में पीईवीडीई टुकड़े के गहरे अनुक्रमण परिणाम। अनुक्रमों में लाल, नीले और ग्रे फोंट क्रमशः लक्ष्य साइटों, पीएएम और सम्मिलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। लाल चकत्ते हटाए गए न्यूक्लियोटाइड का संकेत देते हैं। (ई) एसजीआरएनए -1 और एसजीआरएनए -2 दोनों द्वारा संपादन के बाद पीईवीडीई टुकड़े के सेंगर अनुक्रमण परिणाम। इस आंकड़े को9 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: PeCCR5 के जीन संपादन की स्क्रीनिंग के लिए एक रिपोर्टर के रूप में PeVDE sgRNA. (A) CRISPR/Cas9 संरचनाओं का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व जिसमें PeVDE और PECCR5 sgRNA शामिल हैं। (बी) एनपीक्यू और (ए) में संरचनाओं के साथ संक्रमण के बाद बांस के पत्तों की कच्ची छवियां। सफेद त्रिकोण कम एनपीक्यू मूल्यों वाले क्षेत्रों को इंगित करते हैं। इंद्रधनुष रंग एनपीक्यू / 4 के मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है, जहां लाल न्यूनतम मूल्य से मेल खाता है और बैंगनी 1 से मेल खाता है। (सी) अनुक्रमों में लाल, नीले और भूरे रंग के फोंट क्रमशः लक्ष्य साइटों, पीएएम और सम्मिलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। लाल चकत्ते हटाए गए न्यूक्लियोटाइड का संकेत देते हैं। इस आंकड़े को9 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

जीन का नाम प्राइमर अनुक्रम (5'-3') अनुप्रयोग
लाल एफ: एटीजीजीएटीसीएटीजीसीजीसीसीसीसीसीसीसीजी संक्रमित बांस के पत्तों में पीसीआर प्रवर्धन के लिए
R: GTACTCGTAGAGCTGCTGCAC
PeVDE एफ: टीजीटीजीसीटीटीएएजीसीटीजीसीएएएटीसीटी जीन क्लोनिंग और अनुक्रमण के लिए
आर: टीजीटीसीएएएटीजीसीटीएसीएजीसीटीजीजीसीए
PeVDE-Target1 एफ: GGCATAGCCCCCCGCAGCACCGG PeVDE sgRNA-1 लक्ष्य डिजाइन करने के लिए
आर: एएसीसीसीजीजीटीजीसीटीजीजीजीजीटीजीएजीसीटीए
PeVDE-Target2 एफ: GGCACTCCACGGTCCCCCACACACACACACACACACACACACACACACACACACAATCTAG PeVDE sgRNA-2 लक्ष्य डिजाइन करने के लिए।
आर: AAACCaCTATTTGGGGGGGGG
PECCR5-लक्ष्य एफ: GGCACTGGTACTGCTACGCTAAGA PeCCR5 sgRNA लक्ष्य डिजाइन करने के लिए
आर: AAACTCTTAGCGTAGCAGTACCAG

तालिका 1: प्राइमरों की अनुक्रम जानकारी।

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Discussion

यह विधि पारंपरिक आनुवंशिक परिवर्तन विधियों की तुलना में आवश्यक समय को काफी कम कर देती है, जिसमें आमतौर पर 1-2 साल लगते हैं, और 5 दिनों के भीतर बहिर्जात जीन की क्षणिक अभिव्यक्ति और अंतर्जात जीन के जीन संपादन को प्राप्त करता है। हालांकि, इस विधि की सीमाएं हैं क्योंकि यह केवल कोशिकाओं के एक छोटे से अनुपात को बदल सकती है, और जीन-संपादित पत्तियां चिमेरिक होती हैं और पूर्ण पौधों में पुनर्जीवित करने की क्षमता की कमी होती है। फिर भी, प्लांटा जीन अभिव्यक्ति और जीन संपादन तकनीक में यह अंतर्जात बांस जीन के कार्यात्मक सत्यापन के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण प्रदान करता है।

वर्तमान में, प्लांटा जीन अभिव्यक्ति और जीन संपादन तकनीक में केवल अपरिपक्व (घुंघराले) पत्तियों में प्रदर्शन किया जा सकता है, परिपक्व पत्तियों में नहीं। जैसे-जैसे पत्तियां फैलती हैं और बढ़ती हैं, विभाजन से गुजरने वाली जीन-संपादित कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती है, जिससे विशिष्ट पत्ती क्षेत्रों में जीन संपादन की अनुमति मिलती है। हालांकि, उपयोग की जाने वाली एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता परिवर्तन विधि के परिणामस्वरूप बांस गुणसूत्र में बहिर्जात टी-डीएनए का सम्मिलन नहीं होता है, जिससे बांस 6,9 में स्थिर मार्कर जीन का उपयोग करना मुश्किल हो जाता है। इसलिए, इन क्षेत्रों के सटीक स्थानों को निर्धारित करना चुनौतीपूर्ण है। इसे संबोधित करने के लिए, पीईवीडीई जीन को संपादित किया गया था, और संपादित क्षेत्र ने उच्च प्रकाश उपचार के तहत कम फोटोप्रोटेक्शन क्षमता का प्रदर्शन किया, जैसा कि कम एनपीक्यू मूल्यों द्वारा इंगित किया गया है, जिसे क्लोरोफिल फ्लोरोमीटर इमेजिंग-पीएएम का उपयोग करके आसानी से पता लगाया जा सकता है। इस प्रकार, एक्सोजेनस जीन अभिव्यक्ति और जीन संपादन की घटना का पता लगाने के लिए पीवीडीई को बांस में एक मार्कर के रूप में विकसित किया गया था। विभिन्न प्रजातियों में इस जीन के उच्च संरक्षण के कारण, इसे अन्य पौधों पर भी व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है।

बांस की पत्तियों के एपिडर्मिस पर एक कटिकुलर मोम परत के जमाव के कारण, अपरिपक्व पत्तियों की विशिष्ट घुंघराले और कसकर लिपटी आकृति विज्ञान के साथ मिलकर, पत्ती कोशिकाओं के लिए एग्रोबैक्टीरियम की पहुंच में काफी बाधा आती है। एग्रोबैक्टीरियम संक्रमण की प्रभावशीलता में सुधार करने के लिए, घाव और वैक्यूम घुसपैठ सहित भौतिक दृष्टिकोण का उपयोग संलग्न घुंघराले बांस के पत्तों में एग्रोबैक्टीरियम के प्रवेश को बढ़ावा देने के लिए किया गया है। यह प्रक्रिया एग्रोबैक्टीरियम और पत्ती कोशिकाओं के बीच निकटता को सक्षम करती है, जिससे आनुवंशिक परिवर्तन की दक्षता बढ़ जाती है। इस बीच, यह जीन संपादन प्रणाली अब तक बांस के पत्तों तक सीमित रही है और इसे प्रजनन क्षमता वाले अंगों में व्यक्त नहीं किया जा सकता है, जैसे कि बीज और पार्श्व कलियां जो अगली पीढ़ी को विरासत में मिल सकती हैं। तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों को प्रजनन क्षमता वाले अंगों में इन-प्लांटा जीन अभिव्यक्ति और जीन संपादन तकनीक को प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाएगा, जिसका उद्देश्य स्थिर रूप से विरासत में मिलने वाले पुनरुत्पादन पौधों को प्राप्त करना है।

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Disclosures

लेखक ों ने घोषणा की कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।

Acknowledgments

लेखक वित्तीय सहायता के लिए चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (अनुदान संख्या 2021 वाईएफडी 2200502), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 31971736) को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35S::RUBY Addgene, United States 160908 Plamid construct
Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1 Biomed, China BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01 For Agrobacterium infection
CTAB Sigma-Aldrich, United States 57-09-0 DNA extraction
Imaging-PAM fluorometer Walz, Effeltrich, Germany Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves
ImagingWin Walz, Effeltrich, Germany Software for Imaging-PAM fluorometer
Paq CI or Aar I NEB, United States R0745S Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.
PrimeSTAR Max DNA polymerase Takara, Japan R045Q For gene cloning
T4 DNA ligase NEB, United States M0202V Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.

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References

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प्लांटा जीन अभिव्यक्ति में जीन संपादन मोसो बांस के पत्ते एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता जीन परिवर्तन रूबी रिपोर्टर कैस 9 जीन परिवर्तन दक्षता बेटालैन संचय जीवी 3101 तनाव विदेशी डीएनए एकीकरण जीन संपादन प्रणाली बांस वियोलैक्सैंथिन डी-एपोऑक्सीडेज जीन उत्परिवर्तन दर गैर-फोटोकैमिकल शमन (एनपीक्यू) मूल्य फ्लोरोमीटर डिटेक्शन नेटिव रिपोर्टर सिनामोयल-सीओए रिडक्टेस जीन
<em>प्लांटा में।</em> मोसो बांस की पत्तियों में जीन अभिव्यक्ति और जीन संपादन
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Sun, H., Wang, S., Gao, Z. In… More

Sun, H., Wang, S., Gao, Z. In Planta Gene Expression and Gene Editing in Moso Bamboo Leaves. J. Vis. Exp. (198), e65799, doi:10.3791/65799 (2023).

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