Summary
本研究では、アグロバクテリウムを媒介とするオオバコの遺伝子発現と遺伝子編集法の新規手法を竹で開発した。この手法は、竹の遺伝子機能検証の効率を大幅に向上させ、竹の育種プロセスを加速する上で重要な意味を持ちます。
Abstract
竹では、時間と労力のかかるカルスの誘導と再生プロセスの必要性を回避する新しいプランタ遺伝子形質転換法が開発されました。この方法では、竹の苗木の傷付けと真空によるアグロバクテリウムを介した遺伝子発現が含まれます。笹の葉において、RUBYレポーターやCas9遺伝子などの外因性遺伝子の発現を実証することに成功しました。RUBY苗木におけるベタレインの蓄積に対する最高の形質転換効率は、GV3101株を用いて達成され、感染後の比率は85.2%であった。外来DNAは竹のゲノムに組み込まれなかったが、外因性遺伝子の発現には効率的であった。さらに、この手法を用いてネイティブレポーターを用いた遺伝子編集システムも開発し、そこから笹の葉で編集された竹のビオラキサンチン脱エポキシダーゼ遺伝子(PeVDE)によって生成されたin situ変異体から、突然変異率17.33%を達成しました。PeVDEの変異により、高光下での非光化学的消光(NPQ)値が低下しましたが、これは蛍光光度計で正確に検出できます。これにより、編集されたPeVDEは、竹の外因性遺伝子と内因性遺伝子の両方のネイティブレポーターになる可能性があります。PeVDEのレポーターにより、シナモイルCoAレダクターゼ遺伝子の編集に成功し、突然変異率は8.3%でした。この操作により、組織培養やカルス誘導のプロセスが回避され、竹の外因性遺伝子や内在性遺伝子編集を迅速かつ効率的に発現させることができます。この手法は、遺伝子機能検証の効率を向上させ、竹の主要な代謝経路の分子メカニズムを明らかにするのに役立ちます。
Introduction
竹の遺伝子機能の研究は、竹の高度な理解と遺伝子組み換えの可能性を解き放つ上で大きな期待を寄せています。そのための有効な方法は、外因性遺伝子を含むT-DNA断片を細胞内に導入し、葉の細胞内で遺伝子を発現させるア グロバクテリウム感染のプロセスです。
竹は貴重で再生可能な資源であり、製造、芸術、研究など幅広い用途があります。竹は、高い機械的強度、靭性、適度な剛性、柔軟性※1などの優れた木材特性を有しており、現在では、歯ブラシ、ストロー、ボタン、使い捨て食器、地下パイプライン、火力発電用冷却塔充填材など、さまざまな家庭用品や工業用品に広く使用されています。したがって、竹育種は、プラスチックの代替やプラスチック使用量の削減、環境保護、気候変動への取り組み、および大きな経済的価値を生み出すための優れた木材特性を備えた竹品種を取得する上で重要な役割を果たします。
しかし、従来の竹の育種は、栄養成長段階が長く、開花期が不確実であるため、課題に直面しています。分子育種技術が開発され、竹の育種に応用されていますが、竹の遺伝子形質転換のプロセスは、カルスの誘導と再生のプロセスのために時間と労力がかかり、複雑です2,3,4,5。安定した遺伝子形質転換には、カルスの誘導や再生などの組織培養プロセスを含むアグロバクテリウムを介した方法が必要になることがよくあります。しかし、竹はカルスの再生能力が低いため、竹の安定した遺伝子組み換えの適用は大きく制限されています。アグロバクテリウムが植物細胞に感染した後、T-DNA断片は植物細胞に侵入し、T-DNA断片の大部分は細胞内に未統合のままであり、一過性の発現をもたらします。T-DNA断片のごく一部のみが染色体にランダムに統合され、安定した発現につながります。一過性の発現レベルは、アグロバクテリウムが送達したT-DNAから発現する遺伝子ごとに異なる蓄積曲線を示しています。ほとんどの場合、最高の発現レベルは浸潤後3〜4日で発生し、5〜6日後に急速に低下します6,7。これまでの研究で、遺伝子編集された植物の変異の1/3以上はCRISPR/Cas9の一過性発現に由来し、残りの2/3未満はDNAをゲノムに組み込んだ後の安定発現に由来することが示されています8。このことは、T-DNAの植物ゲノムへの組み込みが遺伝子編集に必要ではないことを示しています。さらに、耐性の選択圧は、非トランスジェニック細胞の増殖を有意に阻害し、感染した外植片の再生プロセスに直接影響します。そこで、竹において抵抗性に対する選択圧を伴わない一過性発現を用いることで、外来性遺伝子の非統合的発現を実現し、植物器官における遺伝子機能を直接研究することが可能となります。したがって、竹9における外因性遺伝子発現および編集のための簡単で時間を節約する方法を開発できる。
開発された外因性遺伝子発現および遺伝子編集法は、その簡便性、費用対効果、および高価な機器または複雑な手順の不在によって特徴付けられる9。この方法では、竹の内在性ビオラキサンチン脱エポキシダーゼ遺伝子(PeVDE)を、選択圧なしで外因性遺伝子発現のレポーターとして使用しました。これは、笹の葉で編集された PeVDE が、強い光の下での光保護能力を低下させ、クロロフィル蛍光イメージングで検出できる非光化学的消光(NPQ)値の低下を示すためです。この手法の有効性を実証するために、別の竹内在性遺伝子であるシナモイルCoAレダクターゼ遺伝子(PeCCR5)9をノックアウトし、この遺伝子の変異体を作製することに成功しました。この手法は、笹の葉に機能を持つ遺伝子の機能解析に利用することができます。これらの遺伝子を笹の葉で一過性に過剰発現させることで、その発現レベルを高めたり、遺伝子編集によってその発現をノックダウンしたりして、下流の遺伝子発現レベル、葉の表現型、および製品の内容を調べることができます。これにより、竹の遺伝子機能研究のためのより効率的で実現可能なアプローチが提供されます。この手法は、笹の葉で機能する遺伝子の機能解析に応用できます。これらの遺伝子を笹の葉で一過性に過剰発現させることで、その発現レベルを高めたり、遺伝子編集によってその発現をノックダウンしたりして、下流の遺伝子発現レベル、葉の表現型、および製品の内容を調べることができます。さらに、広範な倍数化により、竹のゲノムにおける商業的に重要な遺伝子の大部分が複数のコピーに存在し、遺伝的冗長性が生じることに注意することが重要です。これは、竹で多重ゲノム編集を行う上で課題を提起します。安定した遺伝子組み換えや遺伝子編集技術を適用する前に、遺伝子機能を迅速に検証することが重要です。複数の遺伝子コピーの問題に対処する場合、トランスクリプトームの発現プロファイルを解析して、特定の段階で活発に発現する遺伝子を特定する方法の1つが挙げられます。さらに、これらの遺伝子コピーの保存された機能ドメインを標的とすることで、共通の標的配列を設計したり、複数の標的部位を同じCRISPR/Cas9ベクターに組み込んだりすることができ、これらの遺伝子の同時ノックアウトが可能になります。これにより、竹の遺伝子機能研究のためのより効率的で実現可能なアプローチが提供されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.竹の苗の準備
- 中国広西チワン族自治区桂林で収穫された種子を使用して、孟宗竹(Phyllostachys edulis)の苗を準備します。種子を2〜3日間水に浸すことから始め、毎日水を交換するようにしてください。次に、土とバーミキュライトを3:1の割合で混ぜて下地を作ります。
- 浸した種子を発芽のために基質に播種します。実験室条件下で苗木を維持し、温度を18〜25°Cに保ちます。 明期には、250-350 μmol/m2/sの光強度で16時間の明/8時間の暗長を確保してください。
- 相対湿度を約60%に維持します。 アグロバクテリウム感染の場合は、生後15日で高さが2〜10cmの苗を使用してください。
注:竹の開花は予測不可能なため、種子は毎年入手できるわけではありません。種子は通常、乾燥した環境で4°Cで2〜3年間保存され、それでも20%以上の生存率を維持できます。
2. プラスミドとアグロバクテリウムの調製
- プラスミド:一過性発現効果を検証するために、CaMV 35Sプロモーター10によって駆動される可視レポーター遺伝子を含むpHDE-35S::RUBYコンストラクトを採用する。遺伝子編集には、トウモロコシUbiプロモーター11によって駆動されるCas9遺伝子を運ぶpCambia1300-Ubi::Cas9コンストラクトを使用する。pCambia1300-Ubi::Cas9コンストラクト9の2つのAarI部位の間に、PeVDEおよびその他の標的遺伝子のsgRNAガイド配列を挿入します。
- pCambia1300-Ubi::Cas9コンストラクトの2つのAarI制限エンドヌクレアーゼ部位(PeVDEおよびPeCCR5標的遺伝子を含む)の間にCRISPR/Cas9ガイドRNA配列を挿入します。
- 20ヌクレオチド配列の5'末端にGGCAを付加し、一本鎖DNA配列を合成します。20ヌクレオチド配列を逆相補し、AAACを5'末端に付加してから、別の一本鎖DNA配列を合成します。
- 両方の一本鎖DNA配列を希釈水で10 nM/Lの濃度に希釈し、十分に混合し、95°Cで5分間加熱します。混合物を室温まで冷まし、二本鎖アダプターを形成します。
- T4 DNAリガーゼを用いてAarIエンドヌクレアーゼで消化された直鎖状pCambia1300-Ubi::Cas9フラグメントとアダプターを接続し、構築したCRISPR/Cas9ベクターを配列決定して、目的の遺伝子ターゲティングコンストラクトを取得します。
- プラスミドを アグロバクテリウムに変換するには、1 μLのプラスミド(濃度:10 - 1,000 ng/μL)と100 μLの アグロバクテリウムコンピテント細胞(翻訳効率:> 1 x 104 コロニー形成単位/μg)を混合し、穏やかに混合します。混合物を氷上に5分間置きます。混合物を液体窒素に5分間移します。
- 混合物を37°Cのウォーターバスで5分間解凍します。500 μLのLuria-Bertani(LB)培地を混合物に加え、28°C、200rpm、2〜3時間振とうインキュベーターでインキュベートします。pHDE-35S::RUBY プラスミドについては、 アグロバクテリウム・ツメファシエンス (A. tumefaciens)のAGL1、GV3101、LBA4044、およびEHA105株に個別に導入します12。CRISPR/Cas9プラスミドについては、 A. tumefaciensのGV3101株に導入します。
- 酵母抽出ペプトン(YEP)培地(1Lあたり10gの牛肉抽出物、10gの酵母抽出物、および5gのNaCl)で、対応する抗生物質(35S::RUBYの場合はスペクチノマイシン、CRISPR/Cas9の場合はカナマイシン)で28°Cでアグロバクテリウムを増殖させます。 単一のコロニーは、培養後36〜48時間で観察されました。
- コロニーを摘み取り、液体YEP培地(対応する抗生物質を含む)に移し、さらに増殖させます。24〜36時間後、RUBY-FおよびRUBY-Rのプライマー(表1)を使用してPCRを行い、プラスミドの アグロバクテリウムへの転写が成功したことを確認します。
- 形質転換に成功した アグロバクテリウム 1 mLを100 mLの新鮮な液体YEP培地(対応する抗生物質を含む)に移し、28°Cで一晩増殖させてOD600 0.8にします。
- 細菌懸濁液を4,000 x g で4°Cで5分間遠心分離し、懸濁液浸透培地(10 mM MgCl2 および10 mM MES-KOH [pH 5.6])で細菌ペレットを1回洗浄した後、再度遠心分離します。バクテリアペレットを懸濁液浸透培地に再懸濁し、外径600 から0.6に竹形質転換します。
3. アグロバクテリウム が媒介する プランタ 形質転換系
- 変革に備える。根が土に付着した苗木を基質から慎重に取り除き、根が無傷であることを確認します。苗木をスズ箔で包んで水分を維持し、土壌の剥離を防ぎます(図1A)。
- 包んだ苗木を、湿度が高く(相対湿度>90%)、照明が低い環境(強度50μmol/m 2/s未満)に2時間移します。
- 注射器の鋭利な針を使用して、竹の苗のカールした未熟な葉の上部(上部から約1〜2 cm)を1〜2回巻き付けます( 図1Aの赤い三角形で示されるように)。
- その後、傷ついた苗の上部を アグロバクテリウムの懸濁液に浸します。傷つけてから アグロバクテリウム に浸漬するまでの全工程を迅速に行うと、新鮮な傷口が接種効率を高めるため、迅速に行うことができます。
- すぐに苗木を25〜27mmHgの圧力の真空チャンバーに2分間移します(図1B)。
- 掃除機をかけた後、苗木を慎重に開封し、基材に植え直します。苗を薄暗い明暗(<50μmol/m 2/s)、高湿度(RH>90%)、室温(18〜25°C)で2日間置きます。その後、通常の成長条件下で苗木を培養し、5〜7日ごとに水をやります。それらの表現型を観察して、その後の実験の材料を提供します。
4. 遺伝子編集のためのシングルガイドRNA(sgRNA)の設計
- 標的遺伝子配列の特定の保存ドメインの近くにあるプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)部位を同定します。このCRISPR/Cas9システムでは、特定のPAM配列がNGGであることを確認してください。竹のゲノムデータベースに対してBlastN検索を行うことにより、選択した配列のオンターゲット特異性を検証します。sgRNAが、特に上流領域において、PAM 9,11に近い中で一意であることを確認してください。
注:この比較は、遺伝子編集プロセスの影響を受けるゲノムの潜在的なオフターゲット部位を効果的に減少させます。 - PeVDE遺伝子の最初のエクソン上に2つのsgRNA(sgRNA-1とsgRNA-2)を設計します13。sgRNA-1 の PAM の上流の AgeI 制限部位と、sgRNA-2 の PAM の上流の XbaI 制限部位を含めます。保存されたKNWYCYGKのモチーフをコードするPeCCR5遺伝子の4番目のエクソン上に1つのsgRNAを設計します。このモチーフは、CCR14の触媒作用に重要です。
- PAM部位に隣接する20ヌクレオチドスペーサー配列を設計します。このスペーサー配列は、Cas9酵素をDNA切断とその後の遺伝子編集の標的部位に導きます。
注:PAM部位内のエンドヌクレアーゼ酵素切断部位の上流の標的領域を選択することが望ましい。これにより、遺伝子編集効率の検証が容易になります。
5. プライマー設計とPCR
- PeVDEおよびPeCCR5フラグメントを増幅するための特異的プライマーを手動で設計します。上流および下流のプライマーは、電気泳動中に明確なバンド分離を可能にするために、ターゲット部位から少なくとも100 bp外側に配置され、長さの差が100 bpを超えるように設計します。遺伝子の最初の500 bp以内でRUBYを増幅するためのプライマーを設計します。使用したすべてのプライマーのリストを表1に示します。
- PCRにはハイフィデリティDNAポリメラーゼを使用してください。この場合、遺伝子クローニングにおいて、忠実度が高く効率的な増幅を行うDNAポリメラーゼを利用します。
- PCR反応混合物を次のように調製します:5xバッファー(Mg2+ Plus):4 μL;dNTP混合物(各2.5 mM):1.6 μL;順方向および逆方向のプライマー(各10pmol):各1μL;竹ゲノムDNA(約50ng);DNA ポリメラーゼ (2.5 U/μL): 0.2 μL;水を総量20μLに希釈します。
- PCRの実行条件に従ってください:98°Cで5分間の初期変性。98°Cで10秒間変性;56°Cで5秒間アニーリング。72°Cで30秒間伸長。変性から伸長までを32サイクル繰り返します。72°Cで5分間の最終伸長。4°Cで無期限に保持します。
注:PCR条件は例として提供されており、特定のアプリケーションまたはターゲット用に最適化する必要がある場合があります。
6. DNA抽出、エンドヌクレアーゼ酵素消化、シーケンシング
- イメージングPAM蛍光光度計で同定されたように、ハサミを使用して、NPQ値が低い領域を新鮮な竹の葉から分離します(ステップ7.4を参照)。葉のサンプルを液体窒素で凍結し、凍結した葉のサンプルを乳鉢に移します。乳棒を使用してサンプルを微粉末に粉砕し、粉砕プロセス中に十分な液体窒素を追加します。このステップは、DNAを含む細胞内容物を放出するのに役立ちます。
- セチルトリメチルアンモニウム臭化アンモニウム(CTAB)法を用いて、粉末状の葉からゲノムDNAを抽出します。50 mgの葉粉末サンプルを800 μLの2%CTAB溶液に加えます。サンプルを完全に混合し、65°Cで30分間インキュベートし、5分ごとに穏やかに振とうします。
- 等量のクロロホルム/イソアミルアルコール(24:1、v / v)を加え、混合物を激しく振とうします。8,000 gで8分間遠心分離した後、上清を新しいチューブに移します。
- 等量のクロロホルム/イソアミルアルコールを加え、手順6.3を繰り返します。等量の氷冷イソプロパノールを加え、チューブを数回反転させてから、-20°Cで30分間置きます。8,000 x g で5分間遠心分離した後、上清を廃棄します。
- DNAペレットを75%エタノールで4°Cで2回洗浄し、50μLの水に溶解します。
- ステップ5.4のプロトコルの野生型および アグロバクテリウム感染させたタケの葉からのターゲット遺伝子のターゲット部位を含んでいるgenomic DNAを増幅しなさい。
- PCR産物のエンドヌクレアーゼ酵素消化を行います。増幅されたDNA断片内の目的の制限部位を認識する特定の酵素を選択します。消化には AgeIおよび XbaIエンドヌクレアーゼを使用します。
- AgeIまたはXbaI(20ユニット/μL)-1 μL、1 μgのPCR産物、10xバッファー-5 μLからなる反応混合物を調製し、水を加えて総容量50 μLにします。 37°Cで1時間インキュベートします。
- ゲル電気泳動を用いて消化されたDNA断片の割合を分析します。野生型サンプルと アグロバクテリウム感染サンプルの消化断片を比較して、遺伝子編集効率を評価します。
- PeVDEおよびPeCCR5フラグメントの増幅のために、トランスポザーゼアダプターTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGおよびGTCTCGTGGGCTCGGGAGATGTGTATAAGAGACAG配列をそれぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーの5'末端にタグ付けします9,15。増幅には、ステップ 5.4 で説明したプロトコルを使用します。ディープシーケンシングのためにPCR産物を(消化前に)調製します。
7. 葉のNPQ値のクロロフィル蛍光の測定
- 測定の前に、竹の苗木を1200μmol/m 2/sの高光強度条件に2時間さらします。この露光により、吸収される光量子の量が増加し、葉の光保護システムが活性化されます。
- イメージングPAM蛍光光度計を使用して、笹の葉の in vivo PS IIクロロフィル蛍光を測定します。活性光強度を800 μmol/m2/sに設定し、6分間の蛍光測定を行います。この間、30秒ごとに飽和パルスを印加して、クロロフィル蛍光曲線を取得します。曲線の安定した値は、計算に使用されます13.
- 次式を使用して、非光化学クエンチング(NPQ)を計算します。
NPQ = (F m - F m') / F m'
ここで、Fmは暗順応状態における最大蛍光を表し、Fm'は任意の光順応状態における最大蛍光を表す。 - イメージングソフトウェアのビジュアルインターフェースからNPQ値を監視します。このソフトウェアでは、NPQ値を含む蛍光データのリアルタイム分析と表示が可能です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
アグロバクテリウムを介した笹葉のオオバコ遺伝子発現
RUBYレポーター遺伝子は、チロシン10から鮮やかな赤色ベタレインを産生する能力により、一過性の遺伝子発現の可視化に有効であることが実証されています。本研究では、アグロバクテリウムを介した形質転換を利用して、笹の葉に外因性RUBY遺伝子を一過性に発現させました(図1)。感染後3日目には、未熟な折り畳み葉に赤色発色が見られ、5日目には葉が展開すると、より鮮やかになりました(図1C、青色の三角形)。これらの結果は、アグロバクテリウムが笹の葉における外因性RUBY遺伝子の発現を媒介することに成功し、ベタレイン合成が起こったことを実証した。
さらに、 アグロバクテリウム の4つの株(AGL1、LBA4404、EHA105、GV3101)を比較したところ、GV3101株が感染後のタケレインの蓄積率が最も高く、感染後にベタレインを蓄積した苗木の割合が85.2%と最も高く、次いでAGL1(76.9%)、EHA105(49.1%)、LBA4404(31.3%)の順でした。 図1D)。このことから、GV3101がこの目的に最も適した菌株であることが示唆されます。 アグロバクテリウム媒介性T-DNA断片が竹染色体に組み込まれているかどうかを検出するために、ハイフィデリティPCRを実施しました。40サイクルのPCR後、 RUBY 遺伝子のバンドは検出されず、T-DNA断片が組み込まれていないか、または検出できないほど少ない数で組み込まれていることが示されました。したがって、これらの結果は、この遺伝子発現が一過性であると結論付けています。
全体として、これらの知見は、RUBYレポーター遺伝子を用いた竹のオオバコ遺伝子発現におけるアグロバクテリウムを介した一過性の実現可能性を示しています。しかし、赤色のベタレインの色は不安定で、感染後3ヶ月で消失することがわかり、一過性発現系が長期観察に安定していないことが示唆された。
竹ビオラキサンチン脱エポキシダーゼ遺伝子(PeVDE)のプランタ遺伝子編集
アグロバクテリウムを介したオオバコ遺伝子発現は、竹における遺伝子発現の一過性の方法である。一過性のCRISPR/Cas9システムが笹の葉で遺伝子編集を達成できるかどうかを調べるために、竹のキサントフィル回路の鍵となる酵素であるビオラキサンチン脱エポキシダーゼ(PeVDE)を試験遺伝子編集のターゲットとして選択しました。シングルガイドRNA(sgRNA)は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の上流にAgeIの制限部位を含むPeVDE遺伝子(sgRNA-1)の最初のエクソン上に設計され、遺伝子編集の検証を容易にしました(図2A)。
sgRNA-1を運ぶCRISPR/Cas9コンストラクトをアグロバクテリウムにトランスフェクションし、笹の葉を形質転換した。sgRNA-1を運ぶCRISPR/Cas9コンストラクトを含むアグロバクテリウムを5日間感染させた後、竹の苗木に高光処理を行い、その後、クロロフィル蛍光パラメータ検出を行った。葉身の特定の領域では、非光化学的消光(NPQ)値が低いことがわかり(図2B)、これらの領域の光保護能力が強い光の下で低下していることが示されました。PeVDE遺伝子は過剰に吸収された光エネルギーを放散する能力を持っているため13、NPQ値が低いこれらの領域は、PeVDE遺伝子が編集された領域である可能性が高い。次に、葉身のこれらの領域でPeVDE遺伝子断片の酵素消化とシーケンシング解析を行ったところ(図2C-D)、sgRNA-1の突然変異率は17.33%であり、PeVDE遺伝子のこれらの領域でゲノム編集が成功していることが示されました。
さらに、 XbaI制限部位を含む別のsgRNA標的部位であるsgRNA-2が 、PeVDEの最初のエクソン上に設計されました。デュアルsgRNAターゲティングによる長い断片欠失の可能性を調べるために、両方の標的部位で遺伝子編集を行い、長い断片欠失をもたらしました(図2E)。
一過性遺伝子編集系でレポーターとして使用される編集 済みPeVDE 変異体
PeVDE sgRNAが一過性遺伝子編集系のレポーターとして機能できるかどうかを調べました。シナモイルCoAレダクターゼ(PeCCR5)遺伝子(Gene ID:PH02Gene42984.t1)を無作為に選択し、PeVDEレポーターを評価しました。PeCCR5のsgRNA標的の1つは、第4エクソンの保存されたモチーフで設計されました。sgRNA、PeVDEとPeCCR5の両方を持つCRISPR/Cas9コンストラクトを笹の葉に形質転換しました(図3A)。
アグロバクテリウム感染を30日間行った後、苗木を高輝度光で20分間処理した。PeCCR5遺伝子用に編集された葉領域のみがNPQ値に影響を与えないことが観察されましたが、PeVDEとPeCCR5の両方のsgRNAによってトランスフェクションされた葉領域はより低いNPQ値を示しました(図3B)。
その後、NPQ値の低い葉の領域から PeCCR5 フラグメントを増幅して配列決定し、ディープシーケンシングを使用して8.3%の突然変異効率を発見しました。したがって、 PeVDE レポーターは一過性の遺伝子編集レポーターとしての役割に成功し、他の内在性竹遺伝子の遺伝子編集のスクリーニングに使用できます。
全体として、これらの結果は、竹のCRISPR/Cas9を用いた竹の遺伝子編集の実現可能性を示しています。
図1:RUBY遺伝子のプランタ発現と孟宗竹葉のベタレイン蓄積 (A)錫箔に包まれ、アグロバクテリウム感染の準備ができている孟宗竹の苗木で、赤い三角形は注射器の鋭利な針で傷つけられた位置を示しています。(B)竹苗の真空浸透プロセス。(C)表現型の変化によって観察された感染の3日後の笹の葉へのベタレインの蓄積。(D)ここでは、AGL1、LBA4404、EHA105、GV3101の4つのアグロバクテリウム株を媒介として、笹の葉におけるRUBY遺伝子形質転換を行った。GFPコンストラクトを有するGV3101をネガティブコントロールとして使用した。この図は9 から変更されています。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:笹葉におけるPeVDE遺伝子のプランタ発現と遺伝子編集。 (A)PeVDE遺伝子におけるsgRNAの位置と標的配列情報。赤い三角形は、フラグメント増幅の順方向および逆方向のプライマーの位置を示します。(B)感染後の笹の葉のNPQと生画像。NPQ画像の数字は、イメージングソフトウェアモニターのNPQ値を表します。(C)AgeI 消化前後の PeVDE フラグメントの電気泳動結果。WTは野生型の非感染葉を示し、+および-はそれぞれAgeI消化の有無にかかわらずPeVDE断片を表します。(D)NPQ値の低い葉におけるPeVDEフラグメントのディープシーケンシング結果。シーケンス内の赤、青、および灰色のフォントは、それぞれターゲット サイト、PAM、および挿入を表します。赤い破線は、削除されたヌクレオチドを示します。(E)sgRNA-1とsgRNA-2の両方による編集後のPeVDEフラグメントのサンガーシーケンシング結果。この図は9 から変更されています。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:PeCCR5の遺伝子編集をスクリーニングするためのレポーターとしてのPeVDE sgRNA。 (A)PeVDEおよびPeCCR5 sgRNAを含むCRISPR/Cas9コンストラクトの模式図。(B)NPQと(A)のコンストラクトに感染した後の笹の葉の生画像。白い三角形は、NPQ 値が低いエリアを示します。虹色はNPQ/4の値を表し、赤は最小値、紫は1に対応します。(C)シーケンス中の赤、青、および灰色のフォントは、それぞれターゲット部位、PAM、および挿入を表します。赤い破線は、削除されたヌクレオチドを示します。この図は9 から変更されています。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 遺伝子名 | プライマー配列 (5'-3') | アプリケーション | ||
| ルビー | F:ATGGATCATGCGACCCTCG | 感染した笹の葉のPCR増幅に | ||
| R:GTACTCGTAGAGCTGCTGCAC | ||||
| PeVDEの | F:TGTGGCTTCTAAAGCTCTGCAATCT | 遺伝子クローニングおよびシーケンシング用 | ||
| R:TGTCAATGCTACAAGTCCTGGCA | ||||
| PeVDEターゲット1 | F:GGCATAGCCCTCACGCAGCACCGG | PeVDE sgRNA-1ターゲットの設計に | ||
| R:AAACCCGGTGCTGCGTGAGGGCTA | ||||
| PeVDEターゲット2 | F:GGCACTCCACGGTCCCAAATCTAG | PeVDE sgRNA-2ターゲットの設計に | ||
| 研究:AAACCTAGATTTGGGACCGTGGAG | ||||
| PeCCR5-ターゲット | F:GGCACTGGTACTGCTACGCTAAGA | PeCCR5 sgRNAターゲットの設計に | ||
| 研究:AAACTCTTAGCGTAGCAGTACCAG | ||||
表1:プライマーの配列情報。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
この手法は、通常1〜2年かかる従来の遺伝子組み換え法と比較して、所要時間を大幅に短縮し、外因性遺伝子の一過性発現と内在性遺伝子のゲノム編集を5日以内に実現します。しかし、この方法では、ごく一部の細胞しか形質転換できず、遺伝子編集された葉はキメラ性であり、完全な植物に再生する能力に欠けるため、限界があります。しかし、オ オバコ の遺伝子発現と遺伝子編集技術は、内在性竹遺伝子の機能検証に強力なアプローチを提供します。
現在、オオバコでは、遺伝子発現と遺伝子編集技術は、成熟した葉ではなく、未熟な(カールした)葉でしか行うことができません。葉が展開して大きくなると、分裂する遺伝子編集細胞の数が増え、特定の葉の領域で遺伝子編集が可能になります。しかし、アグロバクテリウムを介した形質転換法では、外因性T-DNAが竹染色体に挿入されないため、竹の安定したマーカー遺伝子を使用することは困難である6,9。したがって、これらの領域の正確な位置を特定することは困難です。これに対処するために、PeVDE遺伝子を編集したところ、編集された領域は、クロロフィル蛍光光光度計イメージング-PAMを使用して簡単に検出できるNPQ値の低下によって示されるように、高光処理下で光保護能の低下を示しました。そこでPeVDEは、外因性遺伝子発現や遺伝子編集の発生を検出するための竹のマーカーとして開発されました。この遺伝子は異なる種間で高い保存性を持っているため13、他の植物にも広く適用できます。
笹の葉の表皮にクチクラワックス層が堆積し、未熟な葉の特徴的なカールしてしっかりと包まれた形態と相まって、 アグロバクテリウム の葉細胞へのアクセスが著しく妨げられます。 アグロバクテリウム の感染効果を高めるために、創傷や真空浸潤などの物理的アプローチを利用して、囲まれた丸まった笹の葉への アグロバクテリウム の侵入を促進しています。このプロセスにより、 アグロバクテリウム と葉細胞が近接し、遺伝子組み換えの効率が高まります。一方、この遺伝子編集システムは、これまで笹の葉に限られており、種子や側芽など、次世代に受け継がれる生殖能力のある器官では発現することができませんでした。今後は、本技術の応用を最適化し、生殖能力を有する臓器における植物体内遺伝子発現や遺伝子編集技術を実現し、安定的に遺伝可能な再生 植物 の獲得を目指します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、競合する利害関係はないと宣言しています。
Acknowledgments
著者らは、中国国家重点研究開発プログラム(助成金番号2021YFD2200502)、中国国家自然科学基金会(助成金番号31971736)の財政的支援に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35S::RUBY | Addgene, United States | 160908 | Plamid construct |
| Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1 | Biomed, China | BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01 | For Agrobacterium infection |
| CTAB | Sigma-Aldrich, United States | 57-09-0 | DNA extraction |
| Imaging-PAM fluorometer | Walz, Effeltrich, Germany | Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves | |
| ImagingWin | Walz, Effeltrich, Germany | Software for Imaging-PAM fluorometer | |
| Paq CI or Aar I | NEB, United States | R0745S | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
| PrimeSTAR Max DNA polymerase | Takara, Japan | R045Q | For gene cloning |
| T4 DNA ligase | NEB, United States | M0202V | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
References
- Jiang, Z. H. World Bamboo and Rattan (in Chinese). , Liaoning Science and Technology Publishing House. Shenyang, China. (2002).
- Ye, S., et al. An efficient plant regeneration and transformation system of ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) started from young shoot as explant. Frontiers in Plant Science. 8, 1298 (2017).
- Ye, S., et al. Robust CRISPR/Cas9 mediated genome editing and its application in manipulating plant height in the first generation of hexaploid Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro). Plant Biotechnology Journal. 18 (7), 1501-1503 (2020).
- Xiang, M., et al. Production of purple Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) with enhanced drought and cold stress tolerance by engineering anthocyanin biosynthesis. Planta. 254 (3), 50 (2021).
- Huang, B., et al. An efficient genetic transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing system for moso bamboo (Phyllostachys edulis). Frontiers in Plant Science. 13, 822022 (2022).
- Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods in Molecular Biology. 323, 225-229 (2006).
- Canto, T. Transient expression systems in plants: potentialities and constraints. Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).
- Chen, L., et al. A method for the production and expedient screening of CRISPR/Cas9-mediated non-transgenic mutant plants. Horticulture Research. 5, 13 (2018).
- Sun, H., et al. A new biotechnology for in-planta gene editing and its application in promoting flavonoid biosynthesis in bamboo leaves. Plant Methods. 19 (1), 20 (2023).
- He, Y., Zhang, T., Sun, H., Zhan, H., Zhao, Y. A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation. Horticulture Research. 7 (1), 152 (2020).
- Wang, C., Shen, L., Fu, Y., Yan, C., Wang, K. A simple CRISPR/Cas9 system for multiplex genome editing in rice. Journal of Genetics and Genomics. 42 (12), 703-706 (2015).
- McCormick, S., et al. Leaf disc transformation of cultivated tomato (L. esculentum) using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Reports. 5 (2), 81-84 (1986).
- Lou, Y., et al. a violaxanthin de-epoxidase gene from moso bamboo, confers photoprotection ability in transgenic Arabidopsis under high light. Frontiers in Plant Science. 13, 927949 (2022).
- Zhou, R., et al. Distinct cinnamoyl CoA reductases involved in parallel routes to lignin in Medicago truncatula. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17803-17808 (2010).
- De Roeck, A., et al. Deleterious ABCA7 mutations and transcript rescue mechanisms in early onset Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 134 (3), 475-487 (2017).
