Summary
يقدم هذا البروتوكول طريقة اقتصادية وفعالة للتقييم الكمي للهندسة المعمارية الدقيقة للعظام في نموذج فأر لهشاشة العظام من خلال الجمع بين تلطيخ الهيماتوكسيلين-إيوسين (HE) وتقنيات التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (Micro-CT).
Abstract
تشير البنية المجهرية للعظام إلى ترتيب وجودة أنسجة العظام على المستوى المجهري. يعد فهم البنية المجهرية للعظام للهيكل العظمي أمرا بالغ الأهمية لاكتساب نظرة ثاقبة للفيزيولوجيا المرضية لهشاشة العظام وتحسين علاجها. ومع ذلك ، يمكن أن يكون التعامل مع عينات العظام معقدا بسبب خصائصها الصلبة والكثيفة. ثانيا ، تجعل البرامج المتخصصة معالجة الصور وتحليلها أمرا صعبا. في هذا البروتوكول ، نقدم حلا فعالا من حيث التكلفة وسهل الاستخدام لتحليل البنية المجهرية للعظام التربيقية . يتم توفير خطوات واحتياطات مفصلة. Micro-CT هي تقنية تصوير ثلاثية الأبعاد (3D) غير مدمرة توفر صورا عالية الدقة لبنية العظام التربيقية . يسمح بالتقييم الموضوعي والكمي لجودة العظام ، وهذا هو السبب في أنه ينظر إليه على نطاق واسع على أنه الطريقة القياسية الذهبية لتقييم جودة العظام. ومع ذلك ، لا يزال قياس الشكل النسيجي لا غنى عنه لأنه يوفر معلمات حاسمة على المستوى الخلوي ، مما يسد الفجوة بين التقييمات ثنائية الأبعاد (2D) و 3D لعينات العظام. أما بالنسبة للتقنيات النسيجية ، فقد اخترنا إزالة الكلس من أنسجة العظام ثم إجراء تضمين البارافين التقليدي. باختصار ، يمكن أن يوفر الجمع بين هاتين الطريقتين معلومات أكثر شمولا ودقة عن البنية المجهرية للعظام.
Introduction
هشاشة العظام هي مرض عظمي استقلابي منتشر ، خاصة بين كبار السن ، ويرتبط بزيادة خطر الإصابة بكسور الهشاشة. نظرا لأن هشاشة العظام أصبحت أكثر شيوعا في الصين1 ، سيكون هناك طلب متزايد على دراسة الهياكل العظمية للحيوانات الصغيرة 2,3. تعتمد الطرق السابقة لقياس فقدان العظام على نتائج قياس امتصاص الأشعة السينية ثنائي الطاقة ثنائي الأبعاد. ومع ذلك ، فإن هذا لا يلتقط التغيرات في البنية المجهرية المعمارية للعظم التربيقي ، وهو عامل رئيسي لقوة الهيكل العظمي4. تؤثر البنية المجهرية للعظام على قوتها وصلابتها ومقاومتها للكسر. من خلال مقارنة العمارة الدقيقة للعظام في الحالات الطبيعية والمرضية ، يمكن تحديد التغيرات في مورفولوجيا أنسجة العظام وهيكلها ووظيفتها الناتجة عن هشاشة العظام. تساهم هذه المعلومات في فهم تطور مرض هشاشة العظام وارتباطه بأمراض أخرى.
أصبح التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (Micro-CT) مؤخرا تقنية شائعة لتقييم مورفولوجيا العظام ، حيث يمكن أن يوفر بيانات دقيقة وشاملة عن بنية العظام ومعلمات الكثافة مثل جزء حجم العظام وسمكها وفصلها 5,6. في الوقت نفسه ، يمكن أن تتأثر نتائج Micro-CT ببرنامج التحليل7. يتم استخدام طرق مختلفة للحصول على الصور وتقييمها وإعداد التقارير من قبل العديد من أنظمة التصوير المقطعي المحوسب التجارية الدقيقة. هذا التناقض يجعل من الصعب مقارنة وتفسير النتائج التي أبلغت عنها الدراسات المختلفة5. أيضا ، لا يمكن أن يحل حاليا محل قياس الأنسجة العظمية في تزويد الباحثين بمعلومات حول المعلمات على المستوى الخلوي في نظام الهيكل العظمي8. وفي الوقت نفسه ، تسمح التقنيات النسيجية بالملاحظة المباشرة وقياس التشكل المجهري للعظام. تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (HE) هو تقنية تلطيخ شائعة تستخدم في علم الأنسجة لتصور البنية العامة للخلايا والأنسجة. يتم استخدامه لتحديد وجود أنسجة العظام وبنيتها الدقيقة.
تستخدم هذه المقالة Micro-CT جنبا إلى جنب مع تقنية تقطيع الأنسجة (تلطيخ الهيماتوكسيلين-Eosin [HE]) لجمع صور أنسجة العظام وإجراء تحليل كمي للعظم التربيقي لتقييم التغيرات في البنية المجهرية للعظام في نموذج فأر هشاشة العظام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على بروتوكول من قبل لجنة أخلاقيات بجامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي (رقم السجل: 2020-34). تم تقسيم إناث الفئران C57BL / 6J (12 أسبوعا ، ن = 14) إلى مجموعتين عشوائيا ، مجموعة تعمل بشكل وهمي (مجموعة الشام ، ن = 7) ومجموعة نموذجية (مجموعة OVX ، ن = 7). تم شراء من مورد تجاري (انظر جدول المواد). تم الاحتفاظ بجميع الفئران في أقفاص فردية عند 22-26 درجة مئوية مع رطوبة 45٪ -55٪ ، وسمح لها بالتكيف مع بيئتها الجديدة لمدة أسبوع واحد ، ووفرت الوصول المجاني إلى الماء والنظام الغذائي. أجريت جميع الدراسات التجريبية على في جامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي ، وبذلت كل الجهود لتقليل معاناة.
1. إعداد نموذج
- تخدير الفأر البالغ من العمر 12 أسبوعا عن طريق الحقن داخل الصفاق بنسبة 1.25٪ Avertin (ثلاثي برومو إيثانول في كحول ثلاثي الأميل ، انظر جدول المواد) بجرعة 0.02 مل / جم. ضع الفأر عرضة على طاولة عمليات جراحية معقمة ، وشل حركة أطرافه عن طريق تسجيلها بإحكام.
- استخدم المقص (انظر جدول المواد) لقص أي شعر قد يؤثر على العملية الجراحية.
ملاحظة: يوصى بتجنب تلف الجلد أثناء تحضير موقع الجراحة. - اغسل يديك جيدا وارتدي قفازات جراحية. قم بتطهير ظهر الفأر ثلاث مرات باستخدام البوفيدون اليود (انظر جدول المواد) ، واستخدم الشاش الطبي (انظر جدول المواد) لتجفيفه.
ملاحظة: كن حذرا. قد يؤدي تبلل الشعر أثناء التطهير إلى انخفاض حرارة الجسم بعد العملية الجراحية في الفئران. - قم بعمل شق بطول 0.5-1.0 سم تقريبا ، ويقع على بعد 1 سم من ثلث خط الوسط لظهر الفأر ، باستخدام مشرط (انظر جدول المواد). افصل اللفافة برفق وقطع العضلات بمقص الأنسجة (انظر جدول المواد) حتى يصبح المبيض مرئيا. اربط الأوعية الدموية المحيطة بخيوط غير قابلة للامتصاص (انظر جدول المواد) وأزل المبيض.
- اشطف التجويف باستخدام محلول ملحي بنسبة 0.9٪ ، ثم خيط الجلد والعضلات واللفافة بشكل منفصل (انظر جدول المواد).
- كرر نفس تسلسل الخطوات على الجانب الآخر.
- قم بإزالة الدهون المحيطة بالمبيض من نفس حجم المبيض ، وقم بإجراء نفس الإجراء الجراحي المذكور أعلاه للخطوات المتبقية لإنشاء النموذج الذي يتم تشغيله بشكل وهمي.
- السماح لفترة نقاهة من 1 أسبوع بعد الجراحة. بعد 8 أسابيع ، سيتم إنشاء نماذج الماوس هشاشة العظام بنجاح 9,10.
2. التصوير المقطعي المحوسب الدقيق
- القتل الرحيم للفأر عن طريق استنشاق CO2 الزائد. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة الرخوة من عظم الفخذ بعد القتل الرحيم واحصل على عينة جديدة للمسح الضوئي.
ملاحظة: على الرغم من عدم وجود حل مثالي لحفظ العينة، يمكن اتخاذ خطوات معينة لزيادة جودة نتائج التصوير المقطعي المحوسب الدقيق إلى أقصى حد. قبل التثبيت ، احرص على إزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة المحيطة. الفورمالين أو الفورمالين المخزن هو الطريقة الأكثر تفضيلا للتثبيت مع التخزين في PBS11,12. - انقر نقرا مزدوجا فوق رمز برنامج نظام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق على سطح المكتب لبدء تشغيل النظام (انظر جدول المواد). حدد عينة سرير متوافقة مع مجال رؤية العينة (FOV) البالغ 18 مم × 18 مم. قم بتحميل سرير العينة المناسب في الجهاز وأغلق الفتحة.
- انقر فوق الزر إحماء في لوحة التحكم.
ملاحظة: كان مطلوبا وقت إحماء قصير. لا تحاول فتح الفتحة عند إنشاء الأشعة السينية. تحقق من ضوء X-Ray On على اللوحة الأمامية وشاشة الكمبيوتر للتأكد مما إذا كان يتم إنشاء الأشعة السينية. - انقر فوق زر القائمة لتعيين قاعدة بيانات جديدة ، ثم قم بإنشاء عينة ودراسة جديدة.
- حدد يدوي من القائمة المنسدلة القائمة وأدخل قيم الجهد والتيار المخصصة في لوحة التحكم. اضبط الجهد (kV ) على 90 ، والتيار (μA ) على 80 ، ووضع المسح الضوئي على دقة عالية ، 14 دقيقة ، و FOV (مم) إلى 18 مم × 18 مم.
ملاحظة: راجع الدليل الخاص بأنظمة التصوير المقطعي المحوسب الدقيقة المختلفة لتعيين المعلمات المناسبة. - ضع العظم بإحكام باستخدام فيلم بلاستيكي في سرير العينة. أغلق الفتحة. تأكد من توسيط الهدف بدقة في نافذة X-capture عن طريق الضغط على أزرار الضبط الموجودة في الجهاز.
ملاحظة: يجب أن يكون ضبط العينة بطيئا ولطيفا لتجنب سقوطها في الجهاز عن طريق الصدفة. - انقر فوق الزر ابدأ لبدء الفحص بالأشعة المقطعية.
3. تحليل بيانات التصوير المقطعي المحوسب
- أدخل البرنامج (انظر جدول المواد) ، وحدد البيانات المراد تحليلها. انقر فوق Sub واضبط حجم البكسل على 10 ميكرومتر. حرك منطقة الاهتمام (ROI) وقم بتغيير حجمها لتشمل عظم الفخذ البعيد فوق لوحة النمو. انقر فوق ابدأ (انظر الشكل 1).
ملاحظة: تم اختيار حجم بكسل إعادة بناء الحجم الفرعي عند 10 ميكرومتر حيث قدر سمك ترابيق التصوير بحوالي 20-30 ميكرومتر بناء على البيانات النسيجية من الدراسات السابقة13. إذا كانت نسبة الإشارة إلى الضوضاء غير كافية لمعالجة البيانات ، فيجب إجراء فحص عالي الدقة لمدة 1 ساعة. - انقر فوق الزر Analysis 3D للحصول على إعادة البناء ثلاثية الأبعاد الناتجة.
- تصدير البيانات من نظام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق إلى الكمبيوتر لتحليلها.
- استيراد بيانات التصوير المقطعي المحوسب المعاد بناؤها. انقر على معالجة > حاسبة الصور، ثم انقر على لوحة المنطقة > تفاعلية. اضبط مربع الاختيار الأصفر على عائد الاستثمار المناسب.
ملاحظة: تبدأ منطقة الاهتمام (ROI) بحوالي 540 ميكرومتر بالقرب من صفيحة النمو وتمتد 1600 ميكرومتر بالقرب من تقييم التمثيل الغذائي الفعلي للعظام وإعادة تشكيلها. - حدد الوظيفة الإضافية لتحليل العمارة الدقيقة للعظام (BMA) (انظر جدول المواد). انقر فوق مقطع القشرة ثم مقطع الترابيق.
ملاحظة: يتم اختيار كل من العظم التربيقي والقشري تلقائيا. عادة لا يلزم إجراء تعديل يدوي. - انقر فوق حفظ خريطة الكائن النهائي ثم انقر فوق قياس العظام لحساب المؤشرات المورفومترية للعظام.
ملاحظة: تم حساب الكثافة المعدنية النسبية للعظام (BMD) فقط هنا حيث لم تتم إضافة أي عنصر تحكم.
4. إزالة الكلس من أنسجة العظام
- ثبت عينات العظام في 4٪ بارافورمالدهيد (انظر جدول المواد) لمدة 24 ساعة. اغسل العينات ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني (انظر جدول المواد) لمدة 20 دقيقة في كل مرة.
- شطف الأنسجة ثلاث مرات بالماء المقطر لمدة 20 دقيقة في كل مرة. انقل الأنسجة إلى محلول إزالة الكلس الذي يحتوي على EDTA (انظر جدول المواد) وقم بإزالة الكلس لمدة 30 يوما مع تغيير المحلول أسبوعيا حتى نقطة النهاية.
ملاحظة: يتم استخدام وخز الإبرة وقرص اليد والتثبيت لإنهاء إزالة الكلس عندما تصبح أنسجة العظام ناعمة ، أو لا يوجد شعور بالمقاومة عند الوخز بالإبر. يمكن أن تسبب الطريقة الفيزيائية للكشف بعض الضرر لبنية الأنسجة ، لذا حاول تجنب القوة المفرطة أو الاختبارات المتكررة. - أخرج المنديل من المثبت واستخدم مشرطا لتقليم الأنسجة في غطاء الدخان. ضع المنديل المشذب والملصق المقابل في صندوق الجفاف.
- ضع صندوق التجفيف في سلة وقم بتجفيفه في معالج الأنسجة (انظر جدول المواد) مع الكحول المتدرج (75٪ إيثانول لمدة 4 ساعات ، 85٪ إيثانول لمدة 2 ساعة ، 90٪ إيثانول لمدة 2 ساعة ، 95٪ إيثانول لمدة 1 ساعة ، إيثانول لا مائي لمدة 30 دقيقة ، إيثانول لا مائي II لمدة 30 دقيقة ، زيلين I لمدة 5-10 دقائق ، زيلين II لمدة 5-10 دقائق ، الشمع الأول لمدة 1 ساعة ، الشمع الثاني لمدة 1 ساعة ، الشمع الثالث لمدة 1 ساعة).
- استخدم آلة التضمين (انظر جدول المواد) لتضمين الأنسجة المبللة بالشمع. صب الشمع المذاب في صندوق التضمين وضع المنديل من صندوق التجفيف قبل أن يصلب الشمع.
- قم بتوجيه الأنسجة وفقا لسطح التضمين وأرفق الملصق المقابل. تبرد على طاولة تجميد -20 درجة مئوية (انظر جدول المواد). قم بإزالة كتلة الشمع من صندوق التضمين بعد التصلب وتقليم كتلة الشمع حسب الحاجة (انظر جدول المواد).
- قطع كتلة الشمع المشذبة إلى شرائح بسمك 3 ميكرومتر على ميكروتوم (انظر جدول المواد). قم بتعويم الشرائح على ماء دافئ 40 درجة مئوية على آلة نشر الأنسجة (انظر جدول المواد) لتسطيح الأنسجة وجرفها بشريحة.
- تخبز في فرن على حرارة 60 درجة مئوية (انظر جدول المواد) حتى يتبخر الماء ويذوب الشمع. أخرجها واحفظها في درجة حرارة الغرفة (RT) لاستخدامها لاحقا.
5. انه تلطيخ
- ضع الشرائح في الزيلين I لمدة 20 دقيقة ، ثم في الزيلين II لمدة 20 دقيقة. علاوة على ذلك ، ضع الشرائح في الإيثانول اللامائي I والإيثانول اللامائي II لمدة 5 دقائق لكل منهما ، و 75٪ كحول لمدة 5 دقائق ، ثم اغسل الشرائح بماء الصنبور (انظر جدول المواد).
- احتضان في الهيماتوكسيلين (انظر جدول المواد) لمدة 3-5 دقائق. قم بتفريق العينات بمحلول حمض الهيدروكلوريك (انظر جدول المواد). عالج الشرائح بمحلول الأمونيا (انظر جدول المواد) للازرقاق ، ثم اغسل الشرائح بالماء.
- ضع الشرائح في 85٪ ، 95٪ كحول متدرج للجفاف ، وصمة عار بمحلول eosin (انظر جدول المواد) لمدة 5 دقائق.
- ضع الشرائح في الإيثانول اللامائي I لمدة 5 دقائق ، والإيثانول اللامائي II لمدة 5 دقائق ، والإيثانول اللامائي III لمدة 5 دقائق. عالج الشرائح بالزيلين I لمدة 5 دقائق ، والزيلين II لمدة 5 دقائق ، وقم بتركيبها باستخدام بلسم محايد (انظر جدول المواد).
- افحص كل شريحة تحت المجهر. ثم اختر الشرائح التمثيلية للمسح البانورامي (راجع جدول المواد).
ملاحظة: يلزم وجود ثلاث شرائح متتالية على الأقل لكل عينة. قبل المسح البانورامي ، يجب فحص الشرائح تحت المجهر للتأكد من أنها كاملة وواضحة. تأكد من أن تجويف نخاع العظم والعظم القشري والعظم الملغي معروض بالكامل وأنه يمكن رؤية أنواع مختلفة من خلايا العظام.
6. تحليل الصور سعادة
- افتح صور HE باستخدام برنامج CaseViewer (انظر جدول المواد). حدد منطقة الاهتمام (ROI) على الشريحة، واحفظها كصورة ملونة.
ملاحظة: يتوافق اختيار عائد الاستثمار مع البرنامج المذكور أعلاه. - افتح الصورة في ImageJ (انظر جدول المواد). حدد أداة العصا من شريط الأدوات. انقر على العظم التربيقي.
- اضبط التفاوت والإعدادات المتجاورة حسب الحاجة. انتقل إلى تعديلات > الصورة > أبيض وأسود وانقر فوق موافق. كرر الخطوات لمناطق أخرى من العظام.
- عكس التحديد واملأه باللون الأبيض. احفظ الصورة كقناع للتحليل (انظر الشكل 2).
ملاحظة: للاطلاع على المنهجية التفصيلية، يرجى الرجوع إلى العمل المنشورسابقا 14. - افتح القناع في برنامج التحليل15,16 (انظر جدول المواد). قم بتشغيل العملية > Binary > Make Binary لتحويل الصورة الملونة إلى صورة ثنائية.
- استخدم المكون الإضافي 17 (انظر جدول المواد) في البرنامج لتحليل المعلمات الهيكلية: مساحة التشغيل / جزء الحجم لحساب حجم العظام إلى الحجم الكلي للعظام (BV / TV [٪])18,19.
ملاحظة: تنطبق هذه الطريقة على الترابيق العظمي ونخاع العظام ، مما يملأ عائد الاستثمار بالكامل في صور HE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحليل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق
قمنا بقياس المعلمات المعمارية الدقيقة التربيقية في الفئران من كلا المجموعتين وأبلغنا عن متوسط قيمها و SDs في الجدول 1. يوضح الشكل 3 توزيع بعض المعلمات (أي نسبة حجم العظام إلى إجمالي حجم الأنسجة ، وسمك التربيق ، والفصل التربيقي) داخل كل مجموعة.
تشير هذه النتائج إلى وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين فئران OVX ومجموعة الشام لعدد من المعلمات التي تم تقديرها من التصوير المقطعي الدقيق. أي أن نسبة حجم العظام إلى إجمالي حجم الأنسجة (BV / TV) في مجموعة OVX كانت أقل بنسبة 3٪ من تلك الموجودة في مجموعة الشام. كان سمك التربيقية في الفئران من OVX أقل من تلك الموجودة في مجموعة الشام ، مع نسبة فرق نسبي بلغت 39.3٪. كان الفصل التربيقي في فئران OVX أكبر من ذلك في فئران الشام. يوضح الشكل 4 عروض ثلاثية الأبعاد لعائد الاستثمار التربيقي المستخرج من حجم العظام المعاد بناؤه لكل مجموعة. بالمقارنة مع مجموعة الشام (الشكل 4 أ) ، كثافة عظام الفئران بعد استئصال المبيض ، كانت الترابيق متناثرة وأظهرت هشاشة العظام (الشكل 4 ب).
تحليل تلطيخ HE
بالإضافة إلى ذلك ، أكد التحليل النسيجي المرضي التغييرات الموجودة في تحليل التصوير المقطعي الدقيق. بعد 8 أسابيع ، أظهر تلطيخ HE أن العظم التربيقي (الأحمر) تحت صفيحة نمو عظم الفخذ البعيد للفئران بعد OVX قد انخفض مقارنة بمجموعة الشام ، ولم يكن هناك تقريبا أي بنية تربيقية سميكة واضحة ، وظهر عدد كبير من الحبيبات الشبيهة بالدهون (الشكل 5 أ). بناء على التحليل الكمي لأقسام الأنسجة ، كان لدى فئران OVX مساحة عظمية تربيقية أقل من مساحة الشام (الشكل 5 ب).
الشكل 1: لقطة شاشة لواجهة إعادة بناء المجلد الفرعي. إعادة بناء حجم فرعي في المستطيل الأخضر للوصول إلى 10 ميكرومتر في مجال رؤية 5.12 مم × 5.12 مم (FOV). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: بناء قناع الصورة بالأبيض والأسود. (A1-A3): صور HE من مجموعة الشام (شريط المقياس = 200 ميكرومتر). تظهر الترابيق العظمي باللون الأسود داخل المنطقة المحددة والأنسجة الأخرى باللون الأبيض. (B1-B3) صور مجموعة OVX (شريط المقياس = 200 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنة المعلمات المجهرية للتربيق الفخذي البعيد بين مجموعتي OVX و Sham . (أ) كانت نسبة حجم العظام إلى إجمالي حجم الأنسجة (BV / TV [٪]) في مجموعة OVX أقل من تلك الموجودة في مجموعة الشام. (ب) كان سمك التربيقية (TB.Th [ميكرومتر]) في الفئران من OVX أقل منه في مجموعة الشام. (ج) كان الفصل التربيقي (TB.sp [μm]) في فئران OVX أكبر منه في فئران الشام. * P < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صور تمثيلية للتصوير المقطعي المحوسب الدقيق للعظم التربيقي في عظم الفخذ البعيد. بالمقارنة مع مجموعة الشام (A) ، أظهرت كثافة عظام الفئران بعد استئصال المبيض (B) ترابيق متناثر وأظهرت هشاشة العظام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التحليل النسيجي لمنطقة العظم التربيقي في عظم الفخذ البعيد لمجموعات OVX و Sham. (أ) صور تمثيلية مصبوغة ب HE-hem لعظم الفخذ البعيد في كل مجموعة (شريط المقياس = 500 ميكرومتر). الأسهم السوداء تظهر الترابيق. (ب) التحليل الكمي لمنطقة العظم التربيقي لإجمالي حجم الأنسجة في عائد الاستثمار المحدد. * P < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| البارامتر | مجموعة تديرها الشام (شام) (ن = 5). |
مجموعة استئصال المبيض (OVX) (ن = 5). |
قيمة P |
| نسبة حجم العظام إلى إجمالي حجم الأنسجة (٪) | 7.3 ± 0.9 | 4.2 ± 0.5 | 0.012* |
| سمك التربيق (ميكرومتر) | 79.5 ± 5.5 | 53.4 ± 6.0 | 0.013* |
| الفصل التربيقي (ميكرومتر) | 212.5 ± 8.7 | 249.4 ± 8.3 | 0.015* |
| القيم هي متوسط ± SD. * اختلاف كبير (P<0 .05). |
|||
الجدول 1: معلمات العظام التربيقية المقدرة من التصوير المقطعي الدقيق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن أن تؤدي هشاشة العظام إلى كسور متكررة ، وهي مكلفة ، ويمكن أن تسبب الألم أو الإعاقة أو حتى الموت ، وتؤثر بشكل خطير على نوعية حياة المرضى20. على مر السنين ، تم التعرف على نموذج استئصال المبيض كأحد الطرق القياسية لدراسة هشاشة العظام21. النموذج الحيواني قبل السريري الأكثر شيوعا لهشاشة العظام هو فأر المبيض (OVX). على الرغم من ذلك ، فقد أجريت غالبية الأبحاث حول آليات اضطرابات العظام ، بما في ذلك هشاشة العظام ، باستخدام الفئران22. لإنشاء نموذج هشاشة العظام في الفئران الإناث البالغات C57 / BL6J ، يتم إجراء استئصال المبيض في عمر 12 أسبوعا ، وهو الوقت الأمثل لهذا الإجراء. الفئران ناضجة وخصبة من 8-12 أسبوعا من العمر ، واستئصال المبيض له تأثير كبير على كتلة عظامها في هذا الوقت10. تظهر الدراسات السابقة أنه قبل 12 أسبوعا ، تنمو عظام الفئران بسرعة ، وتزداد مؤشرات مورفولوجيا العظام ، و BMD ، والميكانيكا الحيوية للعظام بسرعة. يرتبط إجمالي كثافة المعادن بالعظام وكثافة المعادن العظمية القشرية بشكل كبير بعمر الفئران. ومع ذلك ، بعد 12 أسبوعا ، يدخل التمثيل الغذائي للعظام في الفئران فترة مستقرة ، وتميل المؤشرات المذكورة أعلاه إلى أن تكون مستقرة23,24.
تم اقتراح العمارة المجهرية للعظام كعامل أساسي يؤثر على هشاشة العظام ، بغض النظر عن BMD. لا يتم تفسير هشاشة العظام لمرض هشاشة العظام بشكل كامل من خلال العجز في كتلة العظام. يمكن أن يفسر BMD فقط 60٪ -70٪ من قوة العظام25. من حيث التركيب الهيكلي ، يشكل العظم القشري 80٪ من كتلة العظام ، في حين أن العظم الملغي يظهر 10٪ فقط من القياسات بعد فقدان 50٪ من كتلة العظام ، مما يشير إلى أن قياسات كتلة العظام وحدها ليست كافية لتقييم فقدان كتلة العظام. بالإضافة إلى حجم العظام ، فإن التغيرات الهيكلية في الترابيق العظمي ضرورية لقوة العظام. يحتوي العظم النخاعي على نسيج نخاع العظم المكونة للدم أو الأنسجة الدهنية. سطحه كبير جدا ، حوالي ثماني مرات أكبر من سطح العظم القشري. تسمح مساحة السطح الكبيرة هذه المتصلة بنخاع العظم للعظم الملغي بالحصول على معدل تحويل عظمي مرتفع إلى حد ما. هذا هو السبب في أننا اخترنا البنية المجهرية للترابيق العظمي كمؤشر رئيسي لمراقبة تغيرات هشاشة العظام. يخضع النسيج العظمي التربيقي في الهيكل العظمي باستمرار لإعادة تشكيل أثناء النمو ، حيث تحل الترابيق العظمية المشكلة حديثا محل الأنسجة الموجودة وتشكل عظما إسفنجيا ثانويا. لذلك ، في الظروف العادية ، يركز التحليل المورفومتري للعظم التربيقي بشكل أساسي على منطقة العظام الإسفنجية الثانوية. من ناحية أخرى ، فإن الأنسجة العظمية الإسفنجية الأولية هي بنية موجودة خلقيا ومستقرة نسبيا لم يتم إعادة تشكيلها وبالتالي يجب استبعادها من التحليل. بشكل عام ، يمكن اعتبار العظم الموجود على مسافة معينة من صفيحة النمو بمثابة إعادة تشكيل الأنسجة بنشاط. لذلك ، اخترنا منطقة الاهتمام (ROI) التي تبدأ من 540 ميكرومتر فوق لوحة النمو وتمتد 1600 ميكرومتر في الاتجاه القريب للتحليل. وفقا للنتائج التي توصلنا إليها ، تظهر الفئران خصائص هيكلية مجهرية مختلفة جدا في المناطق التربيقية بعد استئصال المبيض.
تقنية Micro-CT المستخدمة في هذه الدراسة هي تقنية تصوير 3D غير مدمرة تم تطويرها في العقود الأخيرة ويتم تطبيقها تدريجيا على الدراسة الدوائية للأعشاب الطبية العرقية. يوفر فهما واضحا للبنية المجهرية الداخلية للعينة دون تدميرها. أما بالنسبة للفحص النسيجي المرضي ، فإن طريقة تضمين الراتنج تدمر نشاط الإنزيم ومستضد البروتين ولا يمكن استخدامها بشكل موثوق في الكيمياء النسيجية أو الكيمياء الهيستولوجيةالمناعية 26. يمكن دمج تضمين البارافين التقليدي مع تقنيات مثل الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) ، والتهجين الفلوري في الموقع (FISH) ، ومجهر المسح بالليزر متحد البؤر (CLSM) للكشف الكمي عن المواد منخفضة الوفرة في أنسجة العظام على المستوى الجزيئي ، وبالتالي اكتساب فهم أعمق لآليات وتنظيم استقلاب العظام. يمكن لماسح الشرائح البانورامي تحويل الشرائح بسرعة إلى صور رقمية عالية الدقة ، مما يجعل من الممكن تحليل بيانات الأنسجة العظمية كميا باستخدام برامج الكمبيوتر. باختصار ، يمكن أن يوفر الجمع بين التصوير المقطعي المحوسب الدقيق وعلم الأنسجة العظمي تقييما أكثر تفصيلا ودقة للبنية المجهرية للعظام.
تقليديا ، اقتصر تقييم جودة العظام إلى حد كبير على قياس امتصاص الأشعة السينية ثنائي الطاقة (DXA) ، أو التصوير المقطعي المحوسب محدود الدقة ، أو التصوير بالرنين المغناطيسي الصعبتقنيا 27. على الرغم من أن الجمع بين التقنيتين له مزاياه الفريدة ، إلا أن له أيضا حدوده. أولا ، على الرغم من أن التصوير المقطعي المحوسب الدقيق يسمح بالمراقبة المستمرة طويلة الأجل لنفس ، إلا أن التصوير في الجسم الحي للهياكل المجهرية الهيكلية في الصغيرة الحية ، وخاصة الفئران ، لا يزال يمثل تحديا تقنيا28. ثانيا، إن عدم وجود بروتوكول منظم ومعترف به دوليا للحصول على البيانات وتحليلها من أدوات أو مستخدمين مختلفين يجعل من الصعب مقارنة مجموعات البيانات وإعادة إنتاج نتائج البحوث عبر الدراسات. ثالثا ، نظرا لخصائص التصوير المقطعي المحوسب الدقيق ، فإن التعرض للإشعاع المؤين أمر لا مفر منه. رابعا ، على الرغم من أن بروتوكولنا البسيط والاقتصادي يمكن أن يوفر تحليلا كميا لصور العظام الملطخة ب HE، إلا أنه يعتمد بشكل أساسي على استراتيجية تجزئة شبه تلقائية، وهي أكثر شاقة من الطرق الآلية المعقدة.
في الختام ، فإن تطبيق هذه التكنولوجيا سيجلب بلا شك زخما كبيرا لأبحاث هشاشة العظام في الطب العرقي أثناء عملية الاستكشاف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل إدارة مقاطعة سيتشوان للطب الصيني التقليدي (2021YJ0175) ومشروع ابتكار أبحاث الدراسات العليا لكلية الطب السريري (LCYJSKT2023-11) ، جامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
| Ammonia Solution | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anatomical Forceps | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J3C030 | |
| Anhydrous Ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Automatic Dyeing Machine | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
| Bone Microarchitecture Analysis Add-on | AnalyzeDirect, Inc | ||
| C57BL/6J mice | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Carrier Slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Coverslips | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Decalcification Solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Delicate Scissors | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | ZJA010 | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fiji: ImageJ | National Institutes of Health, USA | ||
| Film Sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| Freezing Table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| H&E Staining Kit | Leagene | DH0020 | |
| Hydrochloric Acid Solution | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| ImageJ2 Plugin | BoneJ 7.0.16 | ||
| Medical Gauze | Shandong Ang Yang Medical Technology Co. | ||
| Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures | Ethicon, Inc. | SA84G | |
| Needle Holder | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J32010 | |
| Neutral Balsam | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| PANNORAMIC Digital Slide Scanners | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Povidone-iodine solution 5% | Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Quantum GX2 microCT Imaging System | PerkinElmer, Inc. | ||
| Rotary Microtome | Thermo scientific | HM325 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Scan & Browse Software | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
| Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves | Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd | 22B141EO | |
| Sodium Chloride Solution 0.9% | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Sterile Hypodermic Syringes for Single Use | Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd | ||
| Sterile Medical Suture Needles | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | PW8068 | |
| Tissue Processor | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Tissue Spreading and Baking Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Tribromoethanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M2920 | |
| Wax Trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Wang, J., et al. The prevalence of osteoporosis in China, a community based cohort study of osteoporosis. Frontiers in Public Health. 11, 1084005 (2023).
- Stein, M., et al. Why animal experiments are still indispensable in bone research: A statement by the European Calcified Tissue Society. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (8), 1045-1061 (2023).
- Kerschan-Schindl, K., Papageorgiou, M., Föger-Samwald, U., Butylina, M., Weber, M., Pietschmann, P. Assessment of bone microstructure by micro CT in C57BL/6J mice for sex-specific differentiation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 14585 (2022).
- Fonseca, H., Moreira-Gonçalves, D., Coriolano, H. J. A., Duarte, J. A. Bone quality: the determinants of bone strength and fragility. Sports Medicine. 44, 37-53 (2014).
- Bouxsein, M. L., Boyd, S. K., Christiansen, B. A., Guldberg, R. E., Jepsen, K. J., Müller, R. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Akhter, M. P., Recker, R. R. High resolution imaging in bone tissue research-review. Bone. 143, 115620 (2021).
- Mys, K., et al. Quantification of 3D microstructural parameters of trabecular bone is affected by the analysis software. Bone. 142, 115653 (2021).
- Chavassieux, P., Chapurlat, R. Interest of bone histomorphometry in bone pathophysiology investigation: Foundation, present, and future. Frontiers in Endocrinology. 13, 907914 (2022).
- Komori, T.
- Zhu, S., et al. Ovariectomy-induced bone loss in TNFα and IL6 gene knockout mice is regulated by different mechanisms. Journal of Molecular Endocrinology. 60 (3), 185-198 (2018).
- Baum, T., et al. Osteoporosis imaging: effects of bone preservation on MDCT-based trabecular bone microstructure parameters and finite element models. BMC Medical Imaging. 15, 22 (2015).
- Nazarian, A., Hermannsson, B. J., Muller, J., Zurakowski, D., Snyder, B. D. Effects of tissue preservation on murine bone mechanical properties. Journal of Biomechanics. 42 (1), 82-86 (2009).
- Martín-Badosa, E., Amblard, D., Nuzzo, S., Elmoutaouakkil, A., Vico, L., Peyrin, F. Excised bone structures in mice: imaging at three-dimensional synchrotron radiation micro CT. Radiology. 229 (3), 921-928 (2003).
- Egan, K. P., Brennan, T. A., Pignolo, R. J. Bone histomorphometry using free and commonly available software. Histopathology. 61 (6), 1168-1173 (2012).
- Brandi, M. L. Microarchitecture, the key to bone quality. Rheumatology. 48 (suppl_4), iv3-iv8 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Domander, R., Felder, A. A., Doube, M.
- Parfitt, A. M., et al. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units: report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. Journal of Bone and Mineral Research. 2 (6), 595-610 (1987).
- Kazama, J. J., Koda, R., Yamamoto, S., Narita, I., Gejyo, F., Tokumoto, A. Cancellous bone volume is an indicator for trabecular bone connectivity in dialysis patients. Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 5 (2), 292-298 (2010).
- Watts, N. B. Postmenopausal osteoporosis: A clinical review. Journal of Women's Health. 27 (9), 1093-1096 (2018).
- Thompson, D. D., Simmons, H. A., Pirie, C. M., Ke, H. Z. FDA Guidelines and animal models for osteoporosis. Bone. 17 (4), S125-S133 (1995).
- Iwaniec, U. T., Yuan, D., Power, R. A., Wronski, T. J. Strain-dependent variations in the response of cancellous bone to ovariectomy in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (7), 1068-1074 (2006).
- Ferguson, V. L., Ayers, R. A., Bateman, T. A., Simske, S. J. Bone development and age-related bone loss in male C57BL/6J mice. Bone. 33 (3), 387-398 (2003).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (8), 1197-1207 (2007).
- Seeman, E. The structural and biomechanical basis of the gain and loss of bone strength in women and men. Endocrinology and Metabolism Clinics. 32 (1), 25-38 (2003).
- Ticha, P., et al. A novel cryo-embedding method for in-depth analysis of craniofacial mini pig bone specimens. Scientific Reports. 10 (1), 19510 (2020).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology. 47 (suppl_4), iv9-iv16 (2008).
- Zaw Thin, M., Moore, C., Snoeks, T., Kalber, T., Downward, J., Behrens, A. Micro-CT acquisition and image processing to track and characterize pulmonary nodules in mice. Nature Protocols. 18 (3), 990-1015 (2023).
