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Medicine

एक ऑस्टियोपोरोसिस माउस मॉडल में ट्रैब्युलर बोन माइक्रोआर्किटेक्चर मूल्यांकन

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65880
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2
1Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Orthopedics, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल हेमेटोक्सिलिन-ईओसिन (एचई) धुंधला और माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी (माइक्रो-सीटी) तकनीकों के संयोजन से ऑस्टियोपोरोसिस के माउस मॉडल में हड्डी माइक्रोआर्किटेक्चर के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए एक किफायती और कुशल विधि प्रस्तुत करता है।

Abstract

अस्थि सूक्ष्म संरचना सूक्ष्म स्तर पर हड्डी के ऊतकों की व्यवस्था और गुणवत्ता को संदर्भित करती है। ऑस्टियोपोरोसिस के पैथोफिज़ियोलॉजी में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने और इसके उपचार में सुधार के लिए कंकाल की हड्डी के माइक्रोस्ट्रक्चर को समझना महत्वपूर्ण है। हालांकि, हड्डी के नमूनों को संभालना उनके कठोर और घने गुणों के कारण जटिल हो सकता है। दूसरे, विशेष सॉफ्टवेयर छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण को कठिन बनाता है। इस प्रोटोकॉल में, हम त्रिकोणीय हड्डी microstructure विश्लेषण के लिए एक लागत प्रभावी और आसान करने के लिए उपयोग समाधान प्रस्तुत करते हैं. विस्तृत कदम और सावधानियां प्रदान की जाती हैं। माइक्रो-सीटी एक गैर-विनाशकारी त्रि-आयामी (3 डी) इमेजिंग तकनीक है जो ट्रैब्युलर हड्डी संरचना की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां प्रदान करती है। यह हड्डी की गुणवत्ता के उद्देश्य और मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है, यही वजह है कि इसे व्यापक रूप से हड्डी की गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए स्वर्ण मानक विधि माना जाता है। हालांकि, हिस्टोमोर्फोमेट्री अपरिहार्य बनी हुई है क्योंकि यह महत्वपूर्ण सेलुलर-स्तर के पैरामीटर प्रदान करती है, जो हड्डी के नमूनों के दो-आयामी (2 डी) और 3 डी आकलन के बीच की खाई को पाटती है। हिस्टोलॉजिक तकनीकों के लिए, हमने हड्डी के ऊतकों को डीकैल्सीफाई करना चुना और फिर पारंपरिक पैराफिन एम्बेडिंग का प्रदर्शन किया। संक्षेप में, इन दो तरीकों के संयोजन से हड्डी के माइक्रोस्ट्रक्चर पर अधिक व्यापक और सटीक जानकारी मिल सकती है।

Introduction

ऑस्टियोपोरोसिस एक प्रचलित चयापचय हड्डी रोग है, विशेष रूप से बुजुर्गों के बीच, और नाजुकता फ्रैक्चर के बढ़ते जोखिम से जुड़ा हुआ है। चूंकि ऑस्टियोपोरोसिस चीन1 में अधिक आम हो जाता है, इसलिए छोटे जानवरों 2,3 की हड्डी संरचनाओं का अध्ययन करने की बढ़ती मांग होगी। हड्डी के नुकसान को मापने के पिछले तरीके दो-आयामी दोहरी-ऊर्जा एक्स-रे अवशोषणमिति के परिणामों पर निर्भर करते हैं। हालांकि, यह ट्रैब्युलर हड्डी के वास्तुशिल्प माइक्रोस्ट्रक्चर में परिवर्तनों को कैप्चर नहीं करता है, जो कंकाल की ताकत4 के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है। हड्डी की माइक्रोस्ट्रक्चर इसकी ताकत, कठोरता और फ्रैक्चर प्रतिरोध को प्रभावित करती है। सामान्य और रोग संबंधी अवस्थाओं में हड्डी के माइक्रोआर्किटेक्चर की तुलना करके, ऑस्टियोपोरोसिस के कारण हड्डी के ऊतक आकृति विज्ञान, संरचना और कार्य में परिवर्तन की पहचान की जा सकती है। यह जानकारी ऑस्टियोपोरोसिस के विकास और अन्य बीमारियों के साथ इसके संबंध की समझ में योगदान करती है।

माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी (माइक्रो-सीटी) इमेजिंग हाल ही में हड्डी आकृति विज्ञान मूल्यांकन के लिए एक लोकप्रिय तकनीक बन गई है, जहां यह हड्डी की संरचना और घनत्व मापदंडों जैसे हड्डी की मात्रा अंश, मोटाई और पृथक्करण 5,6 पर सटीक और व्यापक डेटा प्रदान कर सकती है। इसी समय, माइक्रो-सीटी परिणाम विश्लेषण सॉफ्टवेयर7 से प्रभावित हो सकते हैं। छवि अधिग्रहण, मूल्यांकन और रिपोर्टिंग के विभिन्न तरीकों का उपयोग विभिन्न वाणिज्यिक माइक्रो-सीटी सिस्टम द्वारा किया जाता है। यह असंगतता विभिन्न अध्ययनों द्वारा रिपोर्ट किए गए परिणामों की तुलना और व्याख्या करना कठिन बनाती है5. इसके अलावा, यह वर्तमान में कंकाल प्रणाली8 में सेलुलर स्तर के मापदंडों के बारे में जानकारी के साथ शोधकर्ताओं को प्रदान करने में हड्डी हिस्टोमोर्फोमेट्री को प्रतिस्थापित नहीं कर सकता है। इस बीच, हिस्टोलॉजिक तकनीक हड्डी के सूक्ष्म आकारिकी के प्रत्यक्ष अवलोकन और माप की अनुमति देती है। हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन (एचई) धुंधला हो जाना एक सामान्य धुंधला तकनीक है जिसका उपयोग ऊतक विज्ञान में कोशिकाओं और ऊतकों की सामान्य संरचना की कल्पना करने के लिए किया जाता है। इसका उपयोग हड्डी के ऊतकों की उपस्थिति और इसके माइक्रोआर्किटेक्चर की पहचान करने के लिए किया जाता है।

यह लेख हड्डी के ऊतकों की छवियों को इकट्ठा करने और ऑस्टियोपोरोसिस माउस मॉडल में हड्डी के माइक्रोस्ट्रक्चर के परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए ट्रैब्युलर हड्डी का मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया तकनीक (हेमेटोक्सिलिन-ईओसिन [एचई] धुंधला) के साथ संयुक्त माइक्रो-सीटी का उपयोग करता है।

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Protocol

पशु प्रोटोकॉल को चेंगदू यूनिवर्सिटी ऑफ ट्रेडिशनल चाइनीज मेडिसिन की पशु नैतिक समिति (रिकॉर्ड संख्या: 2020-34) द्वारा अनुमोदित किया गया है। महिला C57BL/6J चूहों (12 सप्ताह पुराने, n = 14) बेतरतीब ढंग से दो समूहों में विभाजित थे, एक शम-संचालित समूह (शाम समूह, n = 7) और एक मॉडल समूह (OVX समूह, n = 7)। जानवरों को एक वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता से खरीदा गया था ( सामग्री की तालिकादेखें)। सभी चूहों को 45% -55% आर्द्रता के साथ 22-26 डिग्री सेल्सियस पर व्यक्तिगत पिंजरों में रखा गया था, 1 सप्ताह के लिए अपने नए वातावरण के अनुकूल होने की अनुमति दी गई थी, और पानी और आहार तक मुफ्त पहुंच प्रदान की गई थी। सभी पशु प्रयोगात्मक अध्ययन चेंगदू विश्वविद्यालय के पारंपरिक चीनी चिकित्सा में आयोजित किए गए थे, और पशु पीड़ा को कम करने के लिए सभी प्रयास किए गए थे।

1. पशु मॉडल की तैयारी

  1. 0.02 एमएल / जी की खुराक पर 1.25% एवर्टिन (टर्ट-एमाइल अल्कोहल में ट्राइब्रोमोथेनॉल, सामग्री की तालिकादेखें) के साथ इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा 12 सप्ताह पुराने माउस को एनेस्थेटाइज करें। माउस एक बाँझ शल्य शल्य ऑपरेटिंग टेबल पर प्रवण स्थिति, और उन्हें सुरक्षित रूप से दोहन द्वारा अपने अंगों स्थिर.
  2. सर्जिकल ऑपरेशन को प्रभावित करने वाले किसी भी बाल को ट्रिम करने के लिए कैंची ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें।
    नोट: सर्जिकल साइट तैयार करते समय त्वचा की क्षति से बचने की सिफारिश की जाती है।
  3. हाथों को अच्छी तरह से धोएं और सर्जिकल दस्ताने पहनें। माउस की पीठ को पोविडोन-आयोडीन (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ तीन बार कीटाणुरहित करें, और इसे सूखने के लिए चिकित्सा धुंध (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें।
    नोट: सावधान रहें; कीटाणुशोधन के दौरान बालों को बहुत गीला करने से चूहों में पोस्टऑपरेटिव हाइपोथर्मिया हो सकता है।
  4. एक स्केलपेल का उपयोग करके, माउस की पीठ के मध्य रेखा के एक तिहाई से 1 सेमी दूर स्थित लगभग 0.5-1.0 सेमी लंबा चीरा बनाएं ( सामग्री की तालिकादेखें)। धीरे प्रावरणी को अलग करें और ऊतक कैंची के साथ मांसपेशियों के माध्यम से काटें ( सामग्री की तालिकादेखें) जब तक कि अंडाशय दिखाई न दे। गैर-अवशोषित टांके के साथ आसपास के रक्त वाहिकाओं को संवारें ( सामग्री की तालिकादेखें) और अंडाशय को हटा दें।
  5. 0.9% खारा समाधान का उपयोग गुहा कुल्ला, तो त्वचा, मांसपेशी, और प्रावरणी अलग से सीवन ( सामग्री की तालिकादेखें).
  6. दूसरी तरफ चरणों के समान क्रम को दोहराएं।
  7. अंडाशय के समान आकार के पेरी-डिम्बग्रंथि वसा को हटा दें, और शम-संचालित मॉडल को स्थापित करने के लिए शेष चरणों के लिए ऊपर वर्णित एक ही सर्जरी प्रक्रिया करें।
  8. सर्जरी के बाद 1 सप्ताह की रिकवरी अवधि की अनुमति दें। 8 सप्ताह के बाद, ऑस्टियोपोरोटिक माउस मॉडल सफलतापूर्वक 9,10 स्थापित किया जाएगा.

2. माइक्रो-सीटी स्कैनिंग

  1. अतिरिक्त सीओ2 साँस लेना द्वारा माउस euthanize. इच्छामृत्यु के बाद माउस फीमर से जितना संभव हो उतना नरम ऊतक निकालें और स्कैनिंग के लिए एक ताजा नमूना प्राप्त करें।
    नोट: जबकि नमूना संरक्षण के लिए कोई सही समाधान नहीं है, माइक्रो-सीटी स्कैन परिणामों की गुणवत्ता को अधिकतम करने के लिए कुछ कदम उठाए जा सकते हैं। निर्धारण से पहले, जितना संभव हो उतना आसपास के ऊतक को हटाने के लिए ध्यान रखें। फॉर्मेलिन या बफर फॉर्मेलिन पीबीएस11,12 में भंडारण के साथ निर्धारण का सबसे पसंदीदा तरीका है।
  2. सिस्टम शुरू करने के लिए डेस्कटॉप पर माइक्रो-सीटी इमेजिंग सिस्टम सॉफ्टवेयर आइकन पर डबल-क्लिक करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। 18 मिमी x 18 मिमी के दृश्य (FOV) के नमूना क्षेत्र के साथ संगत एक नमूना बिस्तर का चयन करें। मशीन में उपयुक्त नमूना बिस्तर लोड करें और हैच को बंद करें।
  3. नियंत्रण कक्ष में वार्म-अप बटन पर क्लिक करें।
    नोट: एक छोटा वार्म-अप समय आवश्यक था। एक्स-रे उत्पन्न होने पर हैच को खोलने का प्रयास न करें। एक्स-रे उत्पन्न होने की पुष्टि करने के लिए फ्रंट पैनल और कंप्यूटर मॉनीटर पर एक्स-रे ऑन लाइट की जांच करें।
  4. नया डेटाबेस सेट करने के लिए मेनू बटन पर क्लिक करें, फिर एक नया नमूना बनाएं और अध्ययन करें।
  5. मेनू ड्रॉप-डाउन सूची से मैनुअल का चयन करें और कस्टम वॉल्यूम दर्ज करेंtagई और नियंत्रण कक्ष में वर्तमान मान। वोल्टेज (केवी) को 90, करंट (μA) को 80, स्कैन मोड को हाई रिज़ॉल्यूशन, 14 मिनट और FOV (मिमी) को 18 मिमी x 18 मिमी पर सेट करें।
    नोट: उपयुक्त पैरामीटर सेट करने के लिए विभिन्न माइक्रो सीटी सिस्टम के लिए मैनुअल देखें।
  6. नमूना बिस्तर में प्लास्टिक की फिल्म के साथ सुरक्षित रूप से हड्डी की स्थिति। हैच बंद करें। सुनिश्चित करें कि मशीन पर समायोजन बटन दबाकर विषय एक्स-कैप्चर विंडो में ठीक से केंद्रित है।
    नोट: दुर्घटना से मशीन में गिरने से बचने के लिए नमूना समायोजित करना धीमा और कोमल होना चाहिए।
  7. सीटी स्कैन शुरू करने के लिए स्टार्ट बटन पर क्लिक करें।

3. सीटी डेटा विश्लेषण

  1. सॉफ्टवेयर दर्ज करें (सामग्री की तालिकादेखें), और विश्लेषण किए जाने वाले डेटा का चयन करें। उप क्लिक करें और 10 माइक्रोन के लिए पिक्सेल आकार सेट. ले जाएँ और ब्याज के क्षेत्र का आकार (ROI) विकास प्लेट के ऊपर बाहर का फीमर शामिल करने के लिए. स्टार्ट पर क्लिक करें (चित्र 1 देखें)।
    नोट: इमेजिंग ट्रेबेकुले की मोटाई पिछले अध्ययनों 13 से हिस्टोलॉजिकल डेटा के आधार पर लगभग 20-30 माइक्रोन होने का अनुमान लगाने के बाद से सबवॉल्यूम पुनर्निर्माण पिक्सेल आकार10 माइक्रोन पर चुना गया था। यदि डेटा प्रोसेसिंग के लिए सिग्नल-टू-शोर अनुपात अपर्याप्त है, तो एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन 1 घंटे स्कैन किया जाना चाहिए।
  2. परिणामी 3D पुनर्निर्माण प्राप्त करने के लिए विश्लेषण 3D बटन पर क्लिक करें।
  3. विश्लेषण के लिए माइक्रो-सीटी सिस्टम से डेटा को कंप्यूटर पर निर्यात करें।
  4. पुनर्निर्मित सीटी डेटा आयात करें। छवि कैल्क्यूलेटर > प्रक्रिया करें पर क्लिक करें, फिर क्षेत्र पैड > इंटरएक्टिव पर क्लिक करें। पीले चेकबॉक्स को उपयुक्त ROI में समायोजित करें।
    नोट: ब्याज का क्षेत्र (आरओआई) विकास प्लेट के लिए लगभग 540 माइक्रोन समीपस्थ शुरू होता है और वास्तविक हड्डी चयापचय और रीमॉडेलिंग का आकलन करने के लिए समीपस्थ रूप से 1600 माइक्रोन तक फैलता है।
  5. बोन माइक्रोआर्किटेक्चर एनालिसिस (BMA) ऐड-ऑन चुनें ( सामग्री की तालिकादेखें)। सेगमेंट कॉर्टेक्स और फिर सेगमेंट ट्रैबेकुले पर क्लिक करें।
    नोट: दोनों trabecular और cortical boneare स्वचालित रूप से चयनित। आम तौर पर कोई मैनुअल समायोजन की आवश्यकता नहीं होती है।
  6. Save Final Object Map पर क्लिक करें और फिर Measure Bone to calculate bone morphometric indices पर क्लिक करें।
    नोट: केवल सापेक्ष अस्थि खनिज घनत्व (बीएमडी) की गणना यहां की गई थी क्योंकि कोई नियंत्रण नहीं जोड़ा गया था।

4. हड्डी के ऊतकों का Decalcification

  1. 24 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड ( सामग्री की तालिकादेखें) में हड्डी के नमूनों को ठीक करें। हर बार 20 मिनट के लिए पीबीएस ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ नमूनों को तीन बार धोएं।
  2. हर बार 20 मिनट के लिए आसुत जल के साथ ऊतक तीन बार कुल्ला. ऊतक को EDTA युक्त एक decalcification समाधान में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिकादेखें) और समापन बिंदु तक साप्ताहिक समाधान परिवर्तन के साथ 30 दिनों के लिए decalcify करें।
    नोट: सुई चुभन, हाथ चुटकी, और clamping हड्डी के ऊतकों नरम हो जाता है जब decalcification समाप्त करने के लिए उपयोग किया जाता है, या प्रतिरोध की कोई भावना नहीं है जब needling. पता लगाने की भौतिक विधि ऊतक संरचना को कुछ नुकसान पहुंचा सकती है, इसलिए अत्यधिक बल या बार-बार परीक्षण से बचने की कोशिश करें।
  3. ऊतक को लगानेवाला से बाहर निकालें और एक धूआं हुड में ऊतक को ट्रिम करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें। एक निर्जलीकरण बॉक्स में छंटनी ऊतक और इसी लेबल रखो.
  4. निर्जलीकरण बॉक्स को एक टोकरी में रखें और इसे एक ऊतक प्रोसेसर (सामग्री की तालिकादेखें) में ढाल अल्कोहल (4 घंटे के लिए 75% इथेनॉल, 2 घंटे के लिए 85% इथेनॉल, 2 घंटे के लिए 90% इथेनॉल, 1 घंटे के लिए 95% इथेनॉल, 30 मिनट के लिए निर्जल इथेनॉल, 30 मिनट के लिए निर्जल इथेनॉल द्वितीय, 5-10 मिनट के लिए ज़ाइलीन I, 5-10 मिनट के लिए xylene द्वितीय, 1 घंटे के लिए मोम मैं, 1 घंटे के लिए मोम द्वितीय, 1 घंटे के लिए मोम III).
  5. मोम से लथपथ ऊतक को एम्बेड करने के लिए एक एम्बेडिंग मशीन ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें। पिघले हुए मोम को एक एम्बेडिंग बॉक्स में डालें और मोम के सख्त होने से पहले ऊतक को निर्जलीकरण बॉक्स से रखें।
  6. एम्बेडिंग सतह के अनुसार ऊतक को ओरिएंट करें और संबंधित लेबल संलग्न करें। -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजिंग टेबल पर ठंडा करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। जमने के बाद एम्बेडिंग बॉक्स से मोम ब्लॉक निकालें और आवश्यकतानुसार मोम ब्लॉक को ट्रिम करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  7. एक microtome पर 3 माइक्रोन मोटी स्लाइड में छंटनी मोम ब्लॉक कटौती ( सामग्री की तालिकादेखें). ऊतक को समतल करने और उन्हें स्लाइड के साथ स्कूप करने के लिए ऊतक फैलाने वाली मशीन ( सामग्री की तालिकादेखें) पर 40 डिग्री सेल्सियस गर्म पानी पर स्लाइड फ्लोट करें।
  8. 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में सेंकना ( सामग्री की तालिकादेखें) जब तक कि पानी वाष्पित न हो जाए और मोम पिघल न जाए। बाद में उपयोग के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर बाहर निकालें और स्टोर करें।

5. वह धुंधला हो जाना

  1. 20 मिनट के लिए xylene मैं में स्लाइड रखो, तो 20 मिनट के लिए xylene द्वितीय में. इसके अलावा, 5 मिनट प्रत्येक, 5 मिनट के लिए 75% शराब के लिए निर्जल इथेनॉल मैं और निर्जल इथेनॉल द्वितीय में स्लाइड रखो, और फिर नल के पानी के साथ स्लाइड धो ( सामग्री की तालिकादेखें).
  2. 3-5 मिनट के लिए hematoxylin ( सामग्री की तालिकादेखें) में सेते हैं. हाइड्रोक्लोरिक एसिड समाधान के साथ नमूनों में अंतर करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। ब्लूइंग के लिए अमोनिया समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ स्लाइड्स का इलाज करें, और फिर स्लाइड्स को पानी से धो लें।
  3. निर्जलीकरण के लिए 85%, 95% ढाल शराब में स्लाइड रखो, और 5 मिनट के लिए ईोसिन समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ दाग।
  4. 5 मिनट के लिए निर्जल इथेनॉल मैं में स्लाइड्स रखो, 5 मिनट के लिए निर्जल इथेनॉल द्वितीय, और 5 मिनट के लिए निर्जल इथेनॉल तृतीय. 5 मिनट के लिए xylene मैं, 5 मिनट के लिए xylene द्वितीय, और तटस्थ balsam के साथ माउंट ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ स्लाइड का इलाज करें.
  5. माइक्रोस्कोप के नीचे प्रत्येक स्लाइड की जांच करें। फिर, पैनोरमिक स्कैनिंग के लिए प्रतिनिधि स्लाइस चुनें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: प्रत्येक नमूने के लिए कम से कम तीन लगातार स्लाइस आवश्यक हैं। नयनाभिराम स्कैनिंग से पहले, स्लाइस को यह सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे जांच की जानी चाहिए कि वे पूर्ण और स्पष्ट हैं। सुनिश्चित करें कि अस्थि मज्जा गुहा, कॉर्टिकल हड्डी और रद्द हड्डी पूरी तरह से प्रदर्शित हैं और विभिन्न प्रकार की हड्डी कोशिकाओं को देखा जा सकता है।

6. एचई छवि विश्लेषण

  1. CaseViewer सॉफ़्टवेयर के साथ HE छवियों को खोलें ( सामग्री की तालिकादेखें)। स्लाइड पर रुचि के क्षेत्र (ROI) का चयन करें, और इसे रंगीन छवि के रूप में सहेजें।
    नोट: आरओआई का चयन उपर्युक्त सॉफ्टवेयर के अनुरूप है।
  2. छवि को ImageJ में खोलें ( सामग्री की तालिकादेखें)। टूलबार से वैंड टूल को चुनें। ट्रैब्युलर हड्डी पर क्लिक करें।
  3. आवश्यकतानुसार सहिष्णुता और सन्निहित सेटिंग्स समायोजित करें। Image > Adjustments > Black & White पर जाएं और OK पर क्लिक करें। हड्डी के अन्य क्षेत्रों के लिए चरणों को दोहराएं।
  4. चयन को उल्टा करें और इसे सफेद रंग से भरें। विश्लेषण के लिए एक मुखौटा के रूप में छवि सहेजें (चित्रा 2 देखें).
    नोट: विस्तृत कार्यप्रणाली के लिए, पहले प्रकाशित कार्य14 देखें।
  5. विश्लेषण सॉफ्टवेयर15,16 में मुखौटा खोलें (सामग्री की तालिकादेखें). बाइनरी > प्रक्रिया चलाएं > रंगीन छवि को बाइनरी छवि में बदलने के लिए बाइनरी बनाएं।
  6. संरचनात्मक मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए सॉफ्टवेयर में प्लगइन 17 (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें: हड्डी की कुल मात्रा (बीवी/टीवी [%])18,19के लिए हड्डी की मात्रा की गणना करने के लिए क्षेत्र/वॉल्यूम अंश चलाएं।
    नोट: यह विधि हड्डी ट्रेबेकुले और अस्थि मज्जा के लिए लागू है, एचई छवियों में पूरे आरओआई को भरना।

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Representative Results

माइक्रो-सीटी विश्लेषण
हमने दोनों समूहों से चूहों में ट्रैब्युलर माइक्रोआर्किटेक्चरल मापदंडों को मापा और तालिका 1 में उनके औसत मूल्यों और एसडी की सूचना दी। प्रत्येक समूह के भीतर कुछ मापदंडों (यानी, हड्डी की मात्रा का कुल ऊतक मात्रा, त्रिकोणीय मोटाई, त्रिकोणीय पृथक्करण का अनुपात) का वितरण चित्रा 3में चित्रित किया गया है।

ये परिणाम माइक्रो-सीटी से अनुमानित कई मापदंडों के लिए ओवीएक्स और शाम समूह के चूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर का संकेत देते हैं। अर्थात्, OVX समूह में हड्डी की मात्रा से कुल ऊतक मात्रा (BV/TV) का अनुपात शाम समूह की तुलना में 3% कम था। OVX के चूहों में त्रिकोणीय मोटाई शाम समूह की तुलना में कम थी, जिसमें सापेक्ष अंतर प्रतिशत 39.3% था। OVX चूहों में त्रिकोणीय पृथक्करण शाम चूहों की तुलना में अधिक था। चित्रा 4 प्रत्येक समूह के लिए पुनर्निर्मित हड्डी की मात्रा से निकाले गए ट्रैब्युलर आरओआई के 3 डी डिस्प्ले दिखाता है। शाम समूह (चित्रा 4 ए) के साथ तुलना में, ओवरीएक्टोमी के बाद चूहों की हड्डी घनत्व, ट्रेबेकुले विरल थे और ऑस्टियोपोरोसिस (चित्रा 4बी) दिखाया।

वह धुंधला विश्लेषण
इसके अलावा, हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण ने माइक्रो-सीटी विश्लेषण में पाए गए परिवर्तनों की पुष्टि की। 8 सप्ताह के बाद, हे धुंधला हो जाना पता चला है कि ओवीएक्स के बाद चूहों के डिस्टल फीमर की वृद्धि प्लेट के नीचे त्रिकोणीय हड्डी (लाल) शाम समूह के साथ तुलना में कम हो गई थी, और लगभग कोई स्पष्ट मोटी त्रिकोणीय संरचना नहीं थी, और बड़ी संख्या में वसा की तरह कणिकाओं (चित्रा 5ए)। ऊतक वर्गों के मात्रात्मक विश्लेषण के आधार पर, ओवीएक्स चूहों में शाम एक(चित्रा 5बी)की तुलना में कम ट्रैब्युलर हड्डी क्षेत्र था।

Figure 1
चित्र 1: सबवॉल्यूम पुनर्निर्माण के इंटरफ़ेस का स्क्रीनशॉट। हरे आयत में एक उपखंड पुनर्निर्माण देखने के एक 5.12 मिमी x 5.12 मिमी क्षेत्र (FOV) में 10 माइक्रोन करने के लिए नीचे पाने के लिए. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: काले और सफेद में छवि मुखौटा निर्माण। (A1-A3): शाम समूह (स्केल बार = 200 माइक्रोन) से HE छवियाँ। अस्थि trabeculae चयनित क्षेत्र के भीतर काले रंग में और सफेद रंग में अन्य ऊतकों को दिखाया जाता है। (बी 1-बी 3) OVX समूह की छवियाँ (स्केल बार = 200 माइक्रोन)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ओवीएक्स और शाम समूहों के बीच डिस्टल ऊरु ट्रेबेकुले के माइक्रोस्ट्रक्चरल मापदंडों की तुलना। (ए) ओवीएक्स समूह में हड्डी की मात्रा से कुल ऊतक मात्रा (बीवी/टीवी [%]) का अनुपात शाम समूह की तुलना में कम था। (बी) OVX के चूहों में त्रिकोणीय मोटाई (TB.Th [μm]) शाम समूह की तुलना में कम थी। (सी) OVX चूहों में त्रिकोणीय पृथक्करण (TB.sp [μm]) शाम चूहों की तुलना में अधिक था। *पी < 0.05। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: डिस्टल फीमर में त्रिकोणीय हड्डी के प्रतिनिधि माइक्रो-सीटी छवियां। (ए) शाम समूह की तुलना में, ओवरीएक्टोमी (बी) के बाद चूहों की हड्डी घनत्व ने विरल ट्रेबेकुले प्रदर्शित किया और ऑस्टियोपोरोसिस दिखाया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ओवीएक्स और शाम समूहों के डिस्टल फीमर में ट्रैब्युलर हड्डी क्षेत्र का हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण। (ए) प्रत्येक समूह में डिस्टल फीमर की प्रतिनिधि एचई-दाग वाली छवियां (स्केल बार = 500 माइक्रोन)। काले तीर trabeculae दिखाते हैं। (बी) चयनित आरओआई में कुल ऊतक मात्रा के त्रिकोणीय हड्डी क्षेत्र का मात्रात्मक विश्लेषण। *पी < 0.05। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्राचल शम-संचालित समूह (SHAM)
(n = 5)।		 ओवरीएक्टोमी समूह (OVX)
(n = 5)।		 P मान
अस्थि की मात्रा-से-कुल ऊतक मात्रा अनुपात (%) 7.3 ± 0.9 4.2 ± 0.5 0.012*
त्रिकोणीय मोटाई (माइक्रोन) 79.5 ± 5.5 53.4 ± 6.0 0.013*
त्रिकोणीय पृथक्करण (माइक्रोन) 212.5 ± 8.7 249.4 ± 8.3 0.015*
मान एसडी ± माध्य हैं।
* काफी अलग (पी <0 .05)।

तालिका 1: माइक्रो-सीटी से अनुमानित ट्रैब्युलर हड्डी पैरामीटर।

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Discussion

ऑस्टियोपोरोसिस लगातार फ्रैक्चर का कारण बन सकता है, जो महंगा है, दर्द, विकलांगता, या यहां तक कि मौत का कारण बन सकता है, और रोगियों के जीवन की गुणवत्ता को गंभीरता से प्रभावित कर सकताहै 20. इन वर्षों में, डिम्बग्रंथि मॉडल ऑस्टियोपोरोसिस21 के अध्ययन के लिए मानक तरीकों में से एक के रूप में मान्यता दी गई है. ऑस्टियोपोरोसिस के लिए सबसे आम प्रीक्लिनिकल पशु मॉडल ओवरीएक्टोमाइज्ड (OVX) चूहा है। इसके बावजूद, ऑस्टियोपोरोसिस सहित हड्डी विकारों के तंत्र में अधिकांश शोध चूहों22 का उपयोग करके आयोजित किए गए हैं। वयस्क महिला C57/BL6J चूहों में ऑस्टियोपोरोसिस मॉडल स्थापित करने के लिए, ओवरीएक्टोमी 12 सप्ताह की आयु में की जाती है, जो इस प्रक्रिया के लिए इष्टतम समय है। चूहे परिपक्व और उम्र के 8-12 सप्ताह से उपजाऊ हैं, और ovariectomy इस समय10 पर उनकी हड्डी द्रव्यमान पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है. पिछले अध्ययनों से पता चलता है कि 12 सप्ताह से पहले, चूहों की हड्डियां तेजी से बढ़ती हैं, और हड्डी आकृति विज्ञान, बीएमडी और हड्डी बायोमैकेनिक्स के संकेतक जल्दी से बढ़ते हैं। कुल बीएमडी और कॉर्टिकल हड्डी बीएमडी चूहों की उम्र के साथ काफी सहसंबद्ध हैं। हालांकि, 12 सप्ताह के बाद, चूहों की हड्डी चयापचय एक स्थिर अवधि में प्रवेश करती है, और उपरोक्त संकेतक23,24 स्थिर होते हैं।

अस्थि माइक्रोआर्किटेक्चर को हड्डी की नाजुकता को प्रभावित करने वाले प्राथमिक कारक के रूप में प्रस्तावित किया गया है, जो बीएमडी से स्वतंत्र है। ऑस्टियोपोरोसिस की हड्डी की नाजुकता को हड्डी द्रव्यमान में कमी से पूरी तरह से समझाया नहीं गया है। बीएमडी केवल हड्डी की ताकत का 60% -70% समझा सकताहै 25. संरचनात्मक संरचना के संदर्भ में, कॉर्टिकल हड्डी में हड्डी द्रव्यमान का 80% शामिल होता है, जबकि हड्डी द्रव्यमान का 50% खोने के बाद केवल 10% माप प्रदर्शित करता है, यह सुझाव देता है कि हड्डी द्रव्यमान माप अकेले हड्डी द्रव्यमान हानि का आकलन करने के लिए पर्याप्त नहीं हैं। हड्डी की मात्रा के अलावा, हड्डी ट्रेबेकुले में संरचनात्मक परिवर्तन हड्डी की ताकत के लिए महत्वपूर्ण हैं। कैंसेलस हड्डी में हेमटोपोइएटिक अस्थि मज्जा ऊतक या वसा ऊतक होते हैं। इसकी सतह काफी बड़ी है, जो कॉर्टिकल हड्डी की तुलना में लगभग आठ गुना बड़ी है। अस्थि मज्जा से जुड़ा यह बड़ा सतह क्षेत्र रद्द हड्डी को काफी उच्च हड्डी रूपांतरण दर की अनुमति देता है। यही कारण है कि हमने ऑस्टियोपोरोटिक परिवर्तनों को देखने के लिए मुख्य संकेतक के रूप में हड्डी ट्रेबेकुले के माइक्रोस्ट्रक्चर को चुना। कंकाल में त्रिकोणीय हड्डी ऊतक लगातार विकास के दौरान रीमॉडेलिंग से गुजर रहा है, जिसके दौरान नवगठित हड्डी ट्रेबेकुले मौजूदा लोगों को प्रतिस्थापित करते हैं और माध्यमिक स्पंजी हड्डी बनाते हैं। इसलिए, सामान्य परिस्थितियों में, त्रिकोणीय हड्डी का मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण मुख्य रूप से माध्यमिक स्पंजी हड्डी क्षेत्र पर केंद्रित है। दूसरी ओर, प्राथमिक स्पंजी हड्डी ऊतक, एक जन्मजात रूप से मौजूद और अपेक्षाकृत स्थिर संरचना है जिसे फिर से तैयार नहीं किया गया है और इस प्रकार विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए। आम तौर पर, विकास प्लेट से एक निश्चित दूरी के भीतर हड्डी को सक्रिय रूप से रीमॉडेलिंग ऊतक माना जा सकता है। इसलिए, हमने ब्याज के एक क्षेत्र (आरओआई) का चयन किया जो विकास प्लेट के ऊपर 540 माइक्रोन से शुरू होता है और विश्लेषण के लिए समीपस्थ दिशा में 1600 माइक्रोन तक फैलता है। हमारे निष्कर्षों के अनुसार, चूहों में ओवरीएक्टोमी के बाद त्रिकोणीय क्षेत्रों में बहुत अलग माइक्रोस्ट्रक्चरल विशेषताओं का प्रदर्शन होता है।

इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली माइक्रो-सीटी तकनीक हाल के दशकों में विकसित एक गैर-विनाशकारी 3 डी इमेजिंग तकनीक है और धीरे-धीरे नृवंशविज्ञान जड़ी बूटियों के औषधीय अध्ययन के लिए लागू की जा रही है। यह इसे नष्ट किए बिना नमूने के आंतरिक माइक्रोस्ट्रक्चर की स्पष्ट समझ प्रदान करता है। हिस्टोपैथोलॉजिकल परीक्षा के लिए, राल एम्बेडिंग विधि एंजाइम गतिविधि और प्रोटीन एंटीजेनेसिटी को नुकसान पहुंचाती है और हिस्टोकेमिस्ट्री या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री26के लिए मज़बूती से उपयोग नहीं किया जा सकता है। पारंपरिक पैराफिन एम्बेडिंग को इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी), सीटू हाइब्रिडाइजेशन (फिश) में प्रतिदीप्ति, और आणविक स्तर पर हड्डी के ऊतकों में कम बहुतायत वाले पदार्थों का मात्रात्मक रूप से पता लगाने के लिए कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (सीएलएसएम) जैसी तकनीकों के साथ जोड़ा जा सकता है, जिससे तंत्र की गहरी समझ प्राप्त हो रही है और हड्डी चयापचय का विनियमन। पैनोरमिक स्लाइड स्कैनर तेजी से स्लाइड को उच्च-रिज़ॉल्यूशन डिजिटल छवियों में परिवर्तित कर सकता है, जिससे कंप्यूटर सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके हड्डी हिस्टोमोर्फोलॉजी डेटा का मात्रात्मक विश्लेषण करना संभव हो जाता है। सारांश में, माइक्रो-सीटी और हड्डी हिस्टोमोर्फोलॉजी का संयोजन हड्डी के माइक्रोस्ट्रक्चर का अधिक विस्तृत और सटीक मूल्यांकन प्रदान कर सकता है।

परंपरागत रूप से, हड्डी की गुणवत्ता का आकलन काफी हद तक दोहरी ऊर्जा एक्स-रे अवशोषणमिति (डीएक्सए), सीमित संकल्प गणना टोमोग्राफी, या तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग27तक सीमित था। यद्यपि दो तकनीकों के संयोजन के अपने अद्वितीय फायदे हैं, लेकिन इसकी सीमाएं भी हैं। सबसे पहले, हालांकि माइक्रो-सीटी एक ही जानवर की लंबी अवधि के निरंतर निगरानी के लिए अनुमति देता है, जीवित छोटे जानवरों, विशेष रूप से चूहों में कंकाल microstructures के vivo इमेजिंग में, अभी भी तकनीकी रूप से28 चुनौतीपूर्ण है. दूसरा, विभिन्न उपकरणों या उपयोगकर्ताओं से डेटा प्राप्त करने और विश्लेषण करने के लिए एक संरचित और अंतरराष्ट्रीय स्तर पर मान्यता प्राप्त प्रोटोकॉल की अनुपस्थिति डेटासेट की तुलना करना और अध्ययनों में शोध परिणामों को पुन: पेश करना मुश्किल बनाती है। तीसरा, माइक्रो-सीटी की विशेषताओं के कारण, आयनकारी विकिरण के संपर्क में आना अपरिहार्य है। चौथा, हालांकि हमारे सरल और किफायती प्रोटोकॉल एचई-दाग हड्डी छवियों का मात्रात्मक विश्लेषण प्रदान कर सकते हैं, यह मुख्य रूप से एक अर्ध-स्वचालित विभाजन रणनीति पर आधारित है, जो जटिल स्वचालित तरीकों से अधिक श्रमसाध्य है।

अंत में, इस तकनीक का अनुप्रयोग निस्संदेह अन्वेषण प्रक्रिया के दौरान नृवंशविज्ञान में ऑस्टियोपोरोसिस अनुसंधान के लिए एक महान प्रोत्साहन लाएगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को पारंपरिक चीनी चिकित्सा के सिचुआन प्रांतीय प्रशासन (2021YJ0175) और स्कूल ऑफ क्लिनिकल मेडिसिन (LCYJSKT2023-11), चेंगदू यूनिवर्सिटी ऑफ ट्रेडिशनल चाइनीज मेडिसिन के ग्रेजुएट रिसर्च इनोवेशन प्रोजेक्ट द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde Biosharp BL539A
Adobe Photoshop Adobe Inc.
Ammonia Solution Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd 2021070101
Anatomical Forceps Jinzhong surgical instrument Co., Ltd J3C030
Anhydrous Ethanol Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd 2022070501
Automatic Dyeing Machine Thermo scientific Varistain™ Gemini ES
Bone Microarchitecture Analysis Add-on AnalyzeDirect, Inc
C57BL/6J mice SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.
Carrier Slides Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd 220518001
Coverslips Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. 220518001
Decalcification Solution Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd CR2203047
Delicate Scissors Jinzhong surgical instrument Co., Ltd ZJA010
Embedding box marking machine Thermo scientific  PrintMate AS
Embedding Machine Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd JB-P5
Fiji: ImageJ National Institutes of Health, USA
Film Sealer Thermo scientific Autostainer 360
Freezing Table Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd JB-L5
H&E Staining Kit Leagene DH0020
Hydrochloric Acid Solution Sichuan Xilong Science Co., Ltd 210608
ImageJ2 Plugin BoneJ 7.0.16
Medical Gauze Shandong Ang Yang Medical Technology Co.
Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures Ethicon, Inc. SA84G
Needle Holder Jinzhong surgical instrument Co., Ltd J32010
Neutral Balsam Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd 10004160
Oven Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd DHG-9240A
PANNORAMIC Digital Slide Scanners 3DHISTECH Ltd.  PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000
PBS buffer Biosharp G4202
Povidone-iodine solution 5% Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd
Quantum GX2 microCT Imaging System PerkinElmer, Inc.
Rotary Microtome Thermo scientific HM325
Scalpel Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd 20170022
Scan & Browse Software 3DHISTECH Ltd.  CaseViewer2.4
Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd 22B141EO
Sodium Chloride Solution 0.9% Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd
Sterile Hypodermic Syringes for Single Use Shandong Weigao Group Medical Polymer Products  Co., Ltd
Sterile Medical Suture Needles Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.  PW8068
Tissue Processor Thermo scientific STP420 ES
Tissue Spreading and Baking Machine Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd JK-6
Tribromoethanol Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd M2920
Wax Trimmer Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd JXL-818
Xylene Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd 2022051901

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एक ऑस्टियोपोरोसिस माउस मॉडल में ट्रैब्युलर बोन माइक्रोआर्किटेक्चर मूल्यांकन
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Li, J., Hu, Y., You, H., Li, R., Ran, Q., Ouyang, T., Huang, Y. Trabecular Bone Microarchitecture Evaluation in an Osteoporosis Mouse Model. J. Vis. Exp. (199), e65880, doi:10.3791/65880 (2023).

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