Summary
Данный протокол представляет собой экономичный и эффективный метод количественной оценки микроархитектуры костной ткани на мышиной модели остеопороза путем сочетания методов окрашивания гематоксилин-эозином (ГЭ) и микрокомпьютерной томографии (Микро-КТ).
Abstract
Микроструктура кости относится к расположению и качеству костной ткани на микроскопическом уровне. Понимание костной микроструктуры скелета имеет решающее значение для понимания патофизиологии остеопороза и улучшения его лечения. Однако работа с образцами костей может быть сложной задачей из-за их твердых и плотных свойств. Во-вторых, специализированное программное обеспечение затрудняет обработку и анализ изображений. В этом протоколе мы представляем экономичное и простое в использовании решение для анализа микроструктуры трабекулярной кости. Подробно описаны шаги и меры предосторожности. Микро-КТ — это метод неразрушающей трехмерной (3D) визуализации, который позволяет получать изображения структуры трабекулярной кости с высоким разрешением. Он позволяет объективно и количественно оценить качество костной ткани, поэтому он считается золотым стандартом оценки качества костной ткани. Тем не менее, гистоморфометрия остается незаменимой, поскольку она предлагает важнейшие параметры на клеточном уровне, преодолевая разрыв между двумерной (2D) и 3D-оценкой образцов костей. Что касается гистологических методов, мы выбрали декальцинацию костной ткани, а затем традиционное введение парафина. Таким образом, сочетание этих двух методов может дать более полную и точную информацию о микроструктуре кости.
Introduction
Остеопороз является распространенным метаболическим заболеванием костей, особенно среди пожилых людей, и связан с повышенным риском хрупких переломов. По мере того, как остеопороз становится все более распространеннымв Китае1, будет расти спрос на изучение костных структур мелких животных 2,3. Предыдущие методы измерения потери костной массы основываются на результатах двумерной двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии. Однако при этом не учитываются изменения в архитектурной микроструктуре трабекулярной кости, которая является ключевымфактором для прочности скелета. Микроструктура кости влияет на ее прочность, жесткость и устойчивость к изломам. Сравнивая микроархитектуру костной ткани в норме и при патологии, можно выявить изменения морфологии, структуры и функции костной ткани, вызванные остеопорозом. Эта информация способствует пониманию развития остеопороза и его связи с другими заболеваниями.
Микрокомпьютерная томография (Микро-КТ) в последнее время стала популярным методом оценки морфологии кости, где она может предоставить точные и исчерпывающие данные о структуре и параметрах плотности кости, таких как объемная доля кости, толщина и разделение 5,6. В то же время на результаты микро-КТ может влиять аналитическое программное обеспечение7. Различные методы получения, оценки и составления отчетов изображений используются различными коммерческими системами микро-КТ. Это несоответствие затрудняет сравнение и интерпретацию результатов, полученных в различных исследованиях5. Кроме того, в настоящее время она не может заменить костную гистоморфометрию в предоставлении исследователям информации о параметрах на клеточном уровне в костной системе8. Между тем, гистологические методы позволяют непосредственно наблюдать и измерять микроскопическую морфологию кости. Окрашивание гематоксилином и эозином (ГЭ) является распространенным методом окрашивания, используемым в гистологии для визуализации общей структуры клеток и тканей. Применяется для выявления наличия костной ткани и ее микроархитектуры.
В данной статье используется микро-КТ в сочетании с техникой среза тканей (окрашивание гематоксилин-эозином [HE]) для сбора изображений костной ткани и проведения количественного анализа трабекулярной кости для оценки изменений микроструктуры кости в мышиной модели остеопороза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол для животных был одобрен Комитетом по этике животных Университета традиционной китайской медицины Чэнду (рекордный номер: 2020-34). Самки мышей C57BL/6J (12 недель, n = 14) были случайным образом разделены на две группы: симуляционную (группа Sham, n = 7) и модельную группу (группа OVX, n = 7). Животные были приобретены у коммерческого поставщика (см. Таблицу материалов). Все мыши содержались в индивидуальных клетках при температуре 22-26 °C при влажности 45%-55%, им давали адаптироваться к новой среде в течение 1 недели, обеспечивали свободный доступ к воде и рациону. Все экспериментальные исследования на животных проводились в Чэндуском университете традиционной китайской медицины, и все усилия были направлены на то, чтобы свести к минимуму страдания животных.
1. Подготовка модели животного
- Обезболивают 12-недельную мышь внутрибрюшинной инъекцией 1,25% Авертина (трибромэтанол в трет-амиловом спирте, см. таблицу материалов) в дозировке 0,02 мл/г. Положите мышь лежа на стерильный хирургический операционный стол и обездвижьте ее конечности, надежно заклеив их скотчем.
- Используйте ножницы (см. Таблицу материалов), чтобы подстричь волосы, которые могут повлиять на хирургическую операцию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется избегать повреждения кожи во время подготовки места операции. - Тщательно вымойте руки и наденьте хирургические перчатки. Продезинфицируйте спину мыши три раза повидон-йодом (см. Таблицу материалов) и используйте медицинскую марлю (см. Таблицу материалов), чтобы высушить ее.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны; Слишком влажные волосы во время дезинфекции могут привести к послеоперационному переохлаждению у мышей. - Сделайте скальпелем надрез длиной примерно 0,5-1,0 см, расположенный на расстоянии 1 см от одной трети средней линии спины мыши (см. Таблицу материалов). Аккуратно отделите фасцию и разрежьте мышцу тканевыми ножницами (см. Таблицу материалов) до тех пор, пока яичник не станет виден. Перевязать окружающие кровеносные сосуды нерассасывающимися швами (см. Таблицу материалов) и удалить яичник.
- Промойте полость 0,9% физиологическим раствором, затем наложите швы на кожу, мышцу и фасцию отдельно (см. таблицу материалов).
- Повторите ту же последовательность шагов с другой стороны.
- Удалите периовариальный жир того же размера, что и яичник, и выполните ту же хирургическую процедуру, упомянутую выше, для остальных шагов по созданию фиктивной модели.
- Восстановительный период составляет 1 неделю после операции. Через 8 недель модели мышей с остеопорозом будут успешно установлены 9,10.
2. Микрокомпьютерная томография
- Усыпьте мышь путем вдыхания избыткаСО2 . Удалите как можно больше мягких тканей из бедренной кости мыши после эвтаназии и получите свежий образец для сканирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что идеального решения для сохранения образцов не существует, можно предпринять определенные шаги, чтобы максимизировать качество результатов микро-КТ. Перед фиксацией позаботьтесь о том, чтобы удалить как можно больше окружающих тканей. Формалин или буферный формалин является наиболее предпочтительным методом фиксации с хранением в PBS11,12. - Дважды щелкните значок программного обеспечения системы микро-КТ на рабочем столе, чтобы запустить систему (см. Таблицу материалов). Выберите слой образца, совместимый с полем зрения образца (FOV) 18 мм x 18 мм. Загрузите соответствующий слой образца в машину и закройте люк.
- Нажмите кнопку «Прогрев » на панели управления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Потребовалось короткое время прогрева. Не пытайтесь открыть люк во время рентгеновского излучения. Проверьте индикатор X-Ray On на передней панели и мониторе компьютера, чтобы убедиться, генерируются ли рентгеновские лучи. - Нажмите кнопку Меню , чтобы установить новую базу данных, затем создайте новую выборку и исследование.
- Выберите «Вручную» в раскрывающемся списке «Меню» и введите пользовательские значения напряжения и тока на панели управления. Установите напряжение (кВ) на 90, ток (мкА) на 80, режим сканирования на высокое разрешение, 14 мин и угол обзора (мм) на 18 мм x 18 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к руководству по эксплуатации различных систем микрокомпьютерной томографии, чтобы установить соответствующие параметры. - Надежно расположите кость с помощью полиэтиленовой пленки в слое образца. Закройте люк. Убедитесь, что объект находится точно по центру в окне X-захвата, нажимая кнопки регулировки на аппарате.
ПРИМЕЧАНИЕ: Регулировка образца должна быть медленной и аккуратной, чтобы избежать его случайного попадания в машину. - Нажмите кнопку «Пуск », чтобы начать компьютерную томографию.
3. Анализ данных КТ
- Войдите в программное обеспечение (см. Таблицу материалов) и выберите данные для анализа. Нажмите «Сабвуфер » и установите Размер пикселя на 10 мкм. Переместите и измените размер области интереса (ROI), включив в нее дистальный отдел бедренной кости над пластиной роста. Нажмите кнопку Start (см. рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пикселя субобъемной реконструкции был выбран равным 10 мкм, поскольку толщина трабекул изображений была оценена примерно в 20-30 мкм на основе гистологических данных предыдущих исследований13. Если отношение сигнал/шум недостаточно для обработки данных, необходимо выполнить сканирование с высоким разрешением в течение 1 часа. - Нажмите кнопку Анализ 3D, чтобы получить результирующую 3D-реконструкцию.
- Экспортируйте данные из системы микро-КТ на компьютер для анализа.
- Импортируйте восстановленные данные КТ. Нажмите «Обработать > калькуляторе изображений», затем нажмите «Контактная площадка области» > интерактивной. Установите желтый флажок на соответствующую рентабельность инвестиций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Область интереса (ROI) начинается примерно на 540 мкм проксимальнее ростовой пластинки и простирается на 1600 мкм проксимальнее для оценки фактического метаболизма и ремоделирования костной ткани. - Выберите дополнение Bone Microarchitecture Analysis (BMA) (см. Таблицу материалов). Щелкните Сегментировать кортику , а затем Сегментировать трабекулы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трабекулярная и кортикальная кости выбираются автоматически. Как правило, ручная регулировка не требуется. - Нажмите Save Final Object Map , а затем нажмите Measure Bone для вычисления костных морфометрических индексов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь была рассчитана только относительная минеральная плотность костной ткани (МПК), так как контроль не был добавлен.
4. Декальцинация костной ткани
- Зафиксируйте образцы костей в 4%-ном параформальдегиде (см. таблицу материалов) в течение 24 ч. Промойте образцы трижды PBS (см. Таблицу материалов) каждый раз в течение 20 минут.
- Трижды промойте салфетку дистиллированной водой в течение 20 минут каждый раз. Перенесите ткань в раствор для декальцинации, содержащий ЭДТА (см. таблицу материалов), и декальцинируйте в течение 30 дней с еженедельной сменой раствора до конечной точки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прокалывание иглой, защемление рук и зажим используются для прекращения декальцинации, когда костная ткань становится мягкой или отсутствует ощущение сопротивления при иглоукалывании. Физический метод обнаружения может привести к некоторому повреждению структуры ткани, поэтому старайтесь избегать чрезмерных усилий или повторного тестирования. - Выньте ткань из фиксатора и скальпелем обрежьте ткань в вытяжном шкафу. Положите обрезанную салфетку и соответствующую этикетку в коробку для обезвоживания.
- Поместите ящик для обезвоживания в корзину и обезвоживайте его в тканевой комбайне (см. Таблицу материалов) градиентным спиртом (75% этанол в течение 4 ч, 85% этанол в течение 2 ч, 90% этанол в течение 2 ч, 95% этанол в течение 1 ч, безводный этанол в течение 30 мин, безводный этанол II в течение 30 мин, ксилол I в течение 5-10 мин, ксилол II в течение 5-10 мин, воск I в течение 1 ч, воск II в течение 1 ч, воск III в течение 1 ч).
- Используйте машину для заделки (см. Таблицу материалов), чтобы заложить пропитанную воском ткань. Вылейте расплавленный воск в коробку для закладки и поместите ткань из коробки для обезвоживания до того, как воск затвердеет.
- Сориентируйте ткань в соответствии с поверхностью закладки и прикрепите соответствующую этикетку. Охладить на морозильном столе при температуре -20 °C (см. Таблицу материалов). После затвердевания извлеките восковой блок из коробки для закладки и при необходимости обрежьте восковой блок (см. Таблицу материалов).
- Разрежьте обрезанный восковой блок на предметные стекла толщиной 3 мкм на микротоме (см. Таблицу материалов). Поместите предметные стекла в теплую воду с температурой 40 °C на машине для разбрасывания салфеток (см. Таблицу материалов), чтобы расплющить ткань и зачерпнуть их предметным стеклом.
- Выпекать в духовке при температуре 60 °C (см. Таблицу материалов) до тех пор, пока вода не испарится и воск не растает. Выньте и храните при комнатной температуре (RT) для последующего использования.
5. Окрашивание HE
- Поместите предметные стекла в ксилол I на 20 мин, затем в ксилол II на 20 мин. Далее поместите предметные стекла в безводный этанол I и безводный этанол II на 5 мин каждый, 75% спирт на 5 мин, а затем промойте предметные стекла водопроводной водой (см. таблицу материалов).
- Инкубируют в гематоксилине (см. таблицу материалов) в течение 3-5 мин. Дифференцируют образцы раствором соляной кислоты (см. таблицу материалов). Обработайте предметные стекла раствором аммиака (см. Таблицу материалов) для воронения, а затем промойте предметные стекла водой.
- Поместите предметные стекла в 85%, 95% градиентный спирт для обезвоживания и окрасьте раствором эозина (см. таблицу материалов) в течение 5 минут.
- Поместите предметные стекла в безводный этанол I на 5 мин, безводный этанол II на 5 мин и безводный этанол III на 5 мин. Обработайте предметные стекла ксилолом I в течение 5 минут, ксилолом II в течение 5 мин и закрепите нейтральным бальзамом (см. таблицу материалов).
- Рассмотрите каждое предметное стекло под микроскопом. Затем выберите репрезентативные срезы для панорамного сканирования (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого образца требуется не менее трех последовательных срезов. Перед панорамным сканированием срезы необходимо рассмотреть под микроскопом, чтобы убедиться в их полноте и четкости. Убедитесь, что полость костного мозга, кортикальная кость и губчатая кость полностью отображены, а также что видны различные типы костных клеток.
6. Анализ ОФ изображений
- Открывайте HE-изображения с помощью программы CaseViewer (см. Таблицу материалов). Выберите интересующую область (ROI) на слайде и сохраните ее в виде цветного изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор ROI согласуется с вышеупомянутым программным обеспечением. - Откройте изображение в ImageJ (см. Таблицу материалов). Выберите инструмент « Палочка » на панели инструментов. Нажмите на трабекулярную кость.
- При необходимости отрегулируйте допуск и смежные параметры. Перейдите в раздел «Коррекция изображения >» > «Черно-белый » и нажмите кнопку «ОК». Повторите эти действия для других участков кости.
- Инвертируйте выделение и залейте его белым цветом. Сохраните изображение в виде маски для анализа (см. рис. 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробную методологию см. в ранее опубликованной работе14. - Откройте маску в аналитическом программном обеспечении15,16 (см. Таблицу материалов). Запустите Process > Binary > Make Binary, чтобы преобразовать цветное изображение в двоичное.
- Используйте плагин 17 (см. Таблицу материалов) в программном обеспечении для анализа структурных параметров: Run Area/Volume Fraction для вычисления объема кости к общему объему кости (BV/TV [%])18,19.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод применим для костных трабекул и костного мозга, заполняя весь ROI на изображениях HE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Микро-КТ анализ
Мы измерили трабекулярные микроархитектурные параметры у мышей из обеих групп и сообщили их средние значения и SD в таблице 1. Распределение некоторых параметров (т.е. отношение объема кости к общему объему ткани, трабекулярная толщина, трабекулярное разделение) внутри каждой группы проиллюстрировано на рисунке 3.
Эти результаты свидетельствуют о достоверных различиях между мышами группы OVX и Sham по ряду параметров, которые были оценены с помощью микро-КТ. А именно, отношение объема костной ткани к общему объему тканей (BV/TV) в группе OVX было на 3% ниже, чем в группе Sham. Трабекулярная толщина у мышей OVX была ниже, чем у мышей группы Sham, с относительным процентом различий 39,3%. Трабекулярное разделение у мышей OVX было больше, чем у мышей Sham. На рисунке 4 показаны 3D-дисплеи трабекулярных ROI, извлеченных из реконструированного объема костей для каждой группы. По сравнению с группой Sham (рис. 4A), плотностью костной ткани мышей после овариоэктомии, трабекулы были редкими и показывали остеопороз (рис. 4B).
Анализ окрашивания HE
Кроме того, гистопатологический анализ подтвердил изменения, обнаруженные при анализе Микро-КТ. Через 8 недель окрашивание ПЭ показало, что трабекулярная кость (красная) под ростовой пластинкой дистального отдела бедренной кости мышей после ОВХ была редуцирована по сравнению с группой Sham, и почти отсутствовала явная толстая трабекулярная структура, и появилось большое количество жироподобных гранул (рис. 5А). На основании количественного анализа срезов тканей у мышей OVX площадь трабекулярной кости была меньше, чем у мышей Sham (рис. 5B).
Рисунок 1: Скриншот интерфейса реконструкции подобъема. Подобъемная реконструкция в зеленом прямоугольнике с уменьшением до 10 мкм в поле зрения (FOV) 5,12 мм x 5,12 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Черно-белая конструкция маски изображения. (A1-A3): Изображения HE из группы Sham (масштабная линейка = 200 мкм). Костные трабекулы показаны черным цветом в пределах выбранной области, а другие ткани – белым. (В1-В3) Изображения группы OVX (Масштабная линейка = 200 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Сравнение микроструктурных параметров дистальных трабекул бедренной кости между группами OVX и Sham. (A) Отношение объема костной ткани к общему объему тканей (BV/TV [%]) в группе OVX было ниже, чем в группе Sham. (В) Трабекулярная толщина (TB.Th [мкм]) у мышей OVX была ниже, чем в группе Sham. (C) Трабекулярное разделение (TB.sp [мкм]) у мышей OVX было больше, чем у мышей Sham. *P < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные микро-КТ-изображения трабекулярной кости в дистальном отделе бедренной кости. По сравнению с группой (A) Sham, плотность костной ткани мышей после овариоэктомии (B) демонстрировала редкие трабекулы и показал остеопороз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Гистологический анализ области трабекулярной кости в дистальном отделе бедренной кости групп OVX и Sham. (A) Репрезентативные HE-окрашенные изображения дистального отдела бедренной кости в каждой группе (масштабная линейка = 500 мкм). Черными стрелками показаны трабекулы. (Б) Количественный анализ площади трабекулярной кости от общего объема тканей в выбранном ROI. *P < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Параметр | Фиктивная группировка (SHAM) (n = 5). |
Группа овариэктомии (OVX) (n = 5). |
Значение P |
| Отношение объема костной ткани к общему объему тканей (%) | 7,3 ± 0,9 | 4,2 ± 0,5 | 0.012* |
| Трабекулярная толщина (мкм) | 79,5 ± 5,5 | 53,4 ± 6,0 | 0.013* |
| Трабекулярное разделение (мкм) | 212,5 ± 8,7 | 249,4 ± 8,3 | 0.015* |
| Значения являются средними ± SD. * Существенно отличается (P<0.05). |
|||
Таблица 1: Параметры трабекулярной кости, оцененные по данным микро-КТ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Остеопороз может приводить к частым переломам, которые являются дорогостоящими, могут вызывать боль, инвалидность или даже смерть и серьезно влиять на качество жизни пациентов20. На протяжении многих лет модель овариоэктомии была признана одним из стандартных методов изучения остеопороза21. Наиболее распространенной доклинической моделью остеопороза на животных является овариоэктомированная (OVX) крыса. Несмотря на это, большинство исследований механизмов заболеваний костей, включая остеопороз, было проведено на мышах22. Для создания модели остеопороза у взрослых самок мышей C57/BL6J овариоэктомия проводится в возрасте 12 недель, что является оптимальным сроком для этой процедуры. Мыши становятся зрелыми и фертильными в возрасте 8-12 недель, и овариоэктомия оказывает значительное влияние на их костную массу вэто время. Предыдущие исследования показывают, что до 12 недель кости мышей быстро растут, а показатели морфологии костей, МПК и биомеханики костей быстро увеличиваются. Общая МПК и МПК кортикальных костей достоверно коррелируют с возрастом мышей. Однако через 12 недель костный метаболизм мышей вступает в стабильный период, и вышеуказанные показатели имеют тенденцию к стабильности23,24.
Микроархитектура кости была предложена в качестве основного фактора, влияющего на хрупкость костей, независимо от МПК. Хрупкость костей при остеопорозе не до конца объясняется дефицитом костной массы. МПК может объяснить только 60%-70% прочности костей25. С точки зрения структурного состава, кортикальная кость составляет 80% костной массы, в то время как губчатая кость демонстрирует только 10% измерений после потери 50% костной массы, что позволяет предположить, что одних только измерений костной массы недостаточно для оценки потери костной массы. В дополнение к объему кости, структурные изменения в костных трабекулах имеют решающее значение для прочности костей. Губчатая кость содержит кроветворную ткань костного мозга или жировую ткань. Его поверхность довольно большая, примерно в восемь раз больше, чем у кортикальной кости. Эта большая площадь поверхности, соединенной с костным мозгом, позволяет губчатой кости иметь довольно высокую скорость конверсии костной ткани. Именно поэтому в качестве основного показателя для наблюдения за остеопоротическими изменениями мы выбрали микроструктуру костных трабекул. Трабекулярная костная ткань в скелете постоянно подвергается ремоделированию в процессе роста, в ходе которого вновь образованные костные трабекулы заменяют существующие и образуют вторичную губчатую кость. Поэтому в нормальных условиях морфометрический анализ трабекулярной кости в основном сосредоточен на вторичной губчатой области кости. Первичная губчатая костная ткань, с другой стороны, представляет собой врожденную и относительно стабильную структуру, которая не ремоделируется и, таким образом, должна быть исключена из анализа. Как правило, кость в пределах определенного расстояния от ростовой пластинки можно рассматривать как активно ремоделирующую ткань. Поэтому для анализа мы выбрали область интереса (ROI), которая начинается от 540 мкм над ростовой пластиной и охватывает 1600 мкм в проксимальном направлении. Согласно нашим выводам, мыши демонстрируют очень разные микроструктурные характеристики в трабекулярных областях после овариоэктомии.
Технология микро-КТ, используемая в данном исследовании, представляет собой метод неразрушающей 3D-визуализации, разработанный в последние десятилетия и постепенно применяемый для фармакологического изучения этнолекарственных трав. Он обеспечивает четкое понимание внутренней микроструктуры образца без ее разрушения. Что касается гистопатологического исследования, то метод встраивания смолы повреждает активность ферментов и антигенность белков и не может быть надежно использован для гистохимии или иммуногистохимии26. Традиционное встраивание парафина можно комбинировать с такими методами, как иммуногистохимия (ИГХ), флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) и конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (CLSM) для количественного обнаружения веществ с низким содержанием в костной ткани на молекулярном уровне, тем самым получая более глубокое понимание механизмов и регуляции костного метаболизма. Панорамный сканер слайдов может быстро преобразовывать слайды в цифровые изображения с высоким разрешением, что позволяет количественно анализировать данные гистоморфологии костей с помощью компьютерного программного обеспечения. Таким образом, комбинация микро-КТ и гистоморфологии кости может обеспечить более детальную и точную оценку микроструктуры кости.
Традиционно оценка качества костной ткани в основном ограничивалась двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрией (ДЭРА), компьютерной томографией с ограниченным разрешением или технически сложной магнитно-резонансной томографией27. Несмотря на то, что комбинация этих двух методов имеет свои уникальные преимущества, она также имеет свои ограничения. Во-первых, несмотря на то, что микро-КТ позволяет осуществлять долгосрочный непрерывный мониторинг одного и того же животного, визуализация in vivo микроструктур скелета у живых мелких животных, особенно у мышей, по-прежнемутехнически сложна. Во-вторых, отсутствие структурированного и международно признанного протокола для сбора и анализа данных от различных инструментов или пользователей затрудняет сравнение наборов данных и воспроизведение результатов исследований между исследованиями. В-третьих, из-за особенностей Микро-КТ воздействие ионизирующего излучения неизбежно. В-четвертых, несмотря на то, что наш простой и экономичный протокол может обеспечить количественный анализ изображений костей, окрашенных HE, он в основном основан на полуавтоматической стратегии сегментации, которая является более трудоемкой, чем сложные автоматизированные методы.
В заключение следует отметить, что применение данной технологии, несомненно, даст большой толчок исследованиям остеопороза в этномедицине в процессе исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Управлением традиционной китайской медицины провинции Сычуань (2021YJ0175) и Инновационным проектом аспирантуры Школы клинической медицины (LCYJSKT2023-11) Университета традиционной китайской медицины Чэнду.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
| Ammonia Solution | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anatomical Forceps | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J3C030 | |
| Anhydrous Ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Automatic Dyeing Machine | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
| Bone Microarchitecture Analysis Add-on | AnalyzeDirect, Inc | ||
| C57BL/6J mice | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Carrier Slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Coverslips | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Decalcification Solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Delicate Scissors | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | ZJA010 | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fiji: ImageJ | National Institutes of Health, USA | ||
| Film Sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| Freezing Table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| H&E Staining Kit | Leagene | DH0020 | |
| Hydrochloric Acid Solution | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| ImageJ2 Plugin | BoneJ 7.0.16 | ||
| Medical Gauze | Shandong Ang Yang Medical Technology Co. | ||
| Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures | Ethicon, Inc. | SA84G | |
| Needle Holder | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J32010 | |
| Neutral Balsam | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| PANNORAMIC Digital Slide Scanners | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Povidone-iodine solution 5% | Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Quantum GX2 microCT Imaging System | PerkinElmer, Inc. | ||
| Rotary Microtome | Thermo scientific | HM325 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Scan & Browse Software | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
| Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves | Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd | 22B141EO | |
| Sodium Chloride Solution 0.9% | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Sterile Hypodermic Syringes for Single Use | Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd | ||
| Sterile Medical Suture Needles | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | PW8068 | |
| Tissue Processor | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Tissue Spreading and Baking Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Tribromoethanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M2920 | |
| Wax Trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Wang, J., et al. The prevalence of osteoporosis in China, a community based cohort study of osteoporosis. Frontiers in Public Health. 11, 1084005 (2023).
- Stein, M., et al. Why animal experiments are still indispensable in bone research: A statement by the European Calcified Tissue Society. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (8), 1045-1061 (2023).
- Kerschan-Schindl, K., Papageorgiou, M., Föger-Samwald, U., Butylina, M., Weber, M., Pietschmann, P. Assessment of bone microstructure by micro CT in C57BL/6J mice for sex-specific differentiation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 14585 (2022).
- Fonseca, H., Moreira-Gonçalves, D., Coriolano, H. J. A., Duarte, J. A. Bone quality: the determinants of bone strength and fragility. Sports Medicine. 44, 37-53 (2014).
- Bouxsein, M. L., Boyd, S. K., Christiansen, B. A., Guldberg, R. E., Jepsen, K. J., Müller, R. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Akhter, M. P., Recker, R. R. High resolution imaging in bone tissue research-review. Bone. 143, 115620 (2021).
- Mys, K., et al. Quantification of 3D microstructural parameters of trabecular bone is affected by the analysis software. Bone. 142, 115653 (2021).
- Chavassieux, P., Chapurlat, R. Interest of bone histomorphometry in bone pathophysiology investigation: Foundation, present, and future. Frontiers in Endocrinology. 13, 907914 (2022).
- Komori, T.
- Zhu, S., et al. Ovariectomy-induced bone loss in TNFα and IL6 gene knockout mice is regulated by different mechanisms. Journal of Molecular Endocrinology. 60 (3), 185-198 (2018).
- Baum, T., et al. Osteoporosis imaging: effects of bone preservation on MDCT-based trabecular bone microstructure parameters and finite element models. BMC Medical Imaging. 15, 22 (2015).
- Nazarian, A., Hermannsson, B. J., Muller, J., Zurakowski, D., Snyder, B. D. Effects of tissue preservation on murine bone mechanical properties. Journal of Biomechanics. 42 (1), 82-86 (2009).
- Martín-Badosa, E., Amblard, D., Nuzzo, S., Elmoutaouakkil, A., Vico, L., Peyrin, F. Excised bone structures in mice: imaging at three-dimensional synchrotron radiation micro CT. Radiology. 229 (3), 921-928 (2003).
- Egan, K. P., Brennan, T. A., Pignolo, R. J. Bone histomorphometry using free and commonly available software. Histopathology. 61 (6), 1168-1173 (2012).
- Brandi, M. L. Microarchitecture, the key to bone quality. Rheumatology. 48 (suppl_4), iv3-iv8 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Domander, R., Felder, A. A., Doube, M.
- Parfitt, A. M., et al. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units: report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. Journal of Bone and Mineral Research. 2 (6), 595-610 (1987).
- Kazama, J. J., Koda, R., Yamamoto, S., Narita, I., Gejyo, F., Tokumoto, A. Cancellous bone volume is an indicator for trabecular bone connectivity in dialysis patients. Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 5 (2), 292-298 (2010).
- Watts, N. B. Postmenopausal osteoporosis: A clinical review. Journal of Women's Health. 27 (9), 1093-1096 (2018).
- Thompson, D. D., Simmons, H. A., Pirie, C. M., Ke, H. Z. FDA Guidelines and animal models for osteoporosis. Bone. 17 (4), S125-S133 (1995).
- Iwaniec, U. T., Yuan, D., Power, R. A., Wronski, T. J. Strain-dependent variations in the response of cancellous bone to ovariectomy in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (7), 1068-1074 (2006).
- Ferguson, V. L., Ayers, R. A., Bateman, T. A., Simske, S. J. Bone development and age-related bone loss in male C57BL/6J mice. Bone. 33 (3), 387-398 (2003).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (8), 1197-1207 (2007).
- Seeman, E. The structural and biomechanical basis of the gain and loss of bone strength in women and men. Endocrinology and Metabolism Clinics. 32 (1), 25-38 (2003).
- Ticha, P., et al. A novel cryo-embedding method for in-depth analysis of craniofacial mini pig bone specimens. Scientific Reports. 10 (1), 19510 (2020).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology. 47 (suppl_4), iv9-iv16 (2008).
- Zaw Thin, M., Moore, C., Snoeks, T., Kalber, T., Downward, J., Behrens, A. Micro-CT acquisition and image processing to track and characterize pulmonary nodules in mice. Nature Protocols. 18 (3), 990-1015 (2023).
