Summary
Denne protokollen presenterer en økonomisk og effektiv metode for kvantitativ evaluering av beinmikroarkitektur i en musemodell av osteoporose ved å kombinere hematoksylin-eosin (HE) farging og mikrocomputertomografi (Micro-CT) teknikker.
Abstract
Benmikrostruktur refererer til arrangementet og kvaliteten på beinvev på mikroskopisk nivå. Å forstå skjelettets beinmikrostruktur er avgjørende for å få innsikt i patofysiologien ved osteoporose og forbedre behandlingen. Imidlertid kan håndtering av beinprøver være komplisert på grunn av deres harde og tette egenskaper. For det andre gjør spesialisert programvare bildebehandling og analyse vanskelig. I denne protokollen presenterer vi en kostnadseffektiv og brukervennlig løsning for analyse av trabekulær beinmikrostruktur. Detaljerte trinn og forholdsregler er gitt. Micro-CT er en ikke-destruktiv tredimensjonal (3D) avbildningsteknikk som gir høyoppløselige bilder av trabekulær beinstruktur. Det muliggjør objektiv og kvantitativ evaluering av beinkvalitet, og det er derfor det er allment ansett som gullstandardmetoden for vurdering av beinkvalitet. Imidlertid forblir histomorfometri uunnværlig, da det gir viktige parametere på cellulært nivå, som bygger bro over gapet mellom todimensjonale (2D) og 3D-vurderinger av beinprøver. Når det gjelder de histologiske teknikkene, valgte vi å avkalke beinvevet og deretter utføre tradisjonell parafininnebygging. Oppsummert kan kombinasjon av disse to metodene gi mer omfattende og nøyaktig informasjon om beinmikrostruktur.
Introduction
Osteoporose er en utbredt metabolsk beinsykdom, særlig blant eldre, og er forbundet med økt risiko for skjørhetsbrudd. Etter hvert som osteoporose blir mer vanlig i Kina1, vil det være en økende etterspørsel etter å studere beinstrukturer hos små dyr 2,3. De tidligere metodene for måling av bentap er avhengige av resultatene av todimensjonal dual-energy røntgenabsorptiometri. Dette fanger imidlertid ikke opp endringene i den arkitektoniske mikrostrukturen til det trabekulære beinet, som er en nøkkelfaktor for skjelettstyrke4. Mikrostrukturen av bein påvirker dens styrke, stivhet og bruddmotstand. Ved å sammenligne beinmikroarkitektur i normale og patologiske tilstander, kan endringer i beinvevsmorfologi, struktur og funksjon forårsaket av osteoporose identifiseres. Denne informasjonen bidrar til forståelsen av utviklingen av osteoporose og dens tilknytning til andre sykdommer.
Mikrocomputertomografi (Micro-CT) avbildning har nylig blitt en populær teknikk for vurdering av beinmorfologi, der den kan gi nøyaktige og omfattende data om beinstruktur og tetthetsparametere som benvolumfraksjon, tykkelse og separasjon 5,6. Samtidig kan Micro-CT-resultatene påvirkes av analyseprogrammet7. Ulike metoder for bildeinnsamling, evaluering og rapportering brukes av ulike kommersielle Micro-CT-systemer. Denne inkonsekvensen gjør det vanskelig å sammenligne og tolke resultatene rapportert av ulike studier5. Dessuten kan det for tiden ikke erstatte beinhistomorfometri ved å gi forskere informasjon om parametere på cellenivå i skjelettsystemet8. I mellomtiden tillater histologiske teknikker direkte observasjon og måling av mikroskopisk morfologi av bein. Farging av hematoksylin og eosin (HE) er en vanlig fargeteknikk som brukes i histologi for å visualisere den generelle strukturen til celler og vev. Det brukes til å identifisere tilstedeværelsen av beinvev og dets mikroarkitektur.
Denne artikkelen bruker Micro-CT kombinert med vevskuttingsteknikk (Hematoxylin-Eosin [HE] farging) for å samle beinvevsbilder og utføre kvantitativ analyse av trabekulært bein for å evaluere endringene i beinmikrostruktur i en osteoporose musemodell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreprotokollen er godkjent av Animal Ethical Committee of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (Rekordnummer: 2020-34). Hunnmus C57BL/6J (12-ukers alder, n = 14) ble tilfeldig delt inn i to grupper, en narreoperert gruppe (Sham group, n = 7) og en modellgruppe (OVX group, n = 7). Dyrene ble kjøpt fra en kommersiell leverandør (se Materialfortegnelse). Alle mus ble holdt i individuelle merder ved 22-26 °C med 45% -55% fuktighet, fikk lov til å tilpasse seg sitt nye miljø i 1 uke, og ga fri tilgang til vann og kosthold. Alle dyreeksperimentelle studier ble utført ved Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere dyrs lidelse.
1. Forberedelse av dyremodell
- Bedøv den 12 uker gamle musen ved intraperitoneal injeksjon med 1,25% Avertin (Tribromoetanol i tert-amylalkohol, se materialtabell) i en dose på 0,02 ml / g. Plasser musen utsatt på et sterilt kirurgisk operasjonsbord, og immobiliser lemmer ved å tape dem sikkert.
- Bruk saks (se materialfortegnelse) for å trimme hår som kan påvirke den kirurgiske operasjonen.
MERK: Det anbefales å unngå hudskader mens du forbereder operasjonsstedet. - Vask hendene grundig og ta på kirurgiske hansker. Desinfiser musens rygg tre ganger med povidon-jod (se materialfortegnelse), og bruk medisinsk gasbind (se materialfortegnelse) for å tørke den av.
MERK: Vær forsiktig; Å få håret for vått under desinfeksjon kan føre til postoperativ hypotermi hos mus. - Lag et snitt ca. 0,5-1,0 cm langt, plassert 1 cm fra en tredjedel av midtlinjen på musens rygg, ved hjelp av en skalpell (se materialfortegnelse). Separer fascia forsiktig og skjær gjennom muskelen med vevsaks (se materialfortegnelse) til eggstokken er synlig. Liger de omkringliggende blodkarene med ikke-absorberbare suturer (se materialfortegnelse) og fjern eggstokken.
- Skyll hulrommet med 0,9% saltoppløsning, og sutur deretter huden, muskelen og fascia separat (se materialtabellen).
- Gjenta den samme trinnsekvensen på den andre siden.
- Fjern peri-ovariefett av samme størrelse som eggstokken, og utfør samme operasjonsprosedyre nevnt ovenfor for de resterende trinnene for å etablere den falske opererte modellen.
- Tillat en gjenopprettingsperiode på 1 uke etter operasjonen. Etter 8 uker vil osteoporotiske musemodeller bli etablert 9,10.
2. Micro-CT-skanning
- Avlive musen ved overflødig CO2 -innånding. Fjern så mye bløtvev som mulig fra musens lårben etter eutanasi og få en ny prøve for skanning.
MERK: Selv om det ikke finnes noen perfekt løsning for prøvebevaring, kan visse trinn tas for å maksimere kvaliteten på Micro-CT-skanningsresultatene. Før fiksering, pass på å fjerne så mye omgivende vev som mulig. Formalin eller bufret formalin er den mest foretrukne fikseringsmetoden med lagring i PBS11,12. - Dobbeltklikk på programvareikonet for mikro-CT-bildesystemet på skrivebordet for å starte systemet (se Materialfortegnelse). Velg en prøveseng som er kompatibel med prøvesynsfeltet (FOV) på 18 mm x 18 mm. Legg riktig prøveseng i maskinen og lukk luken.
- Klikk på oppvarmingsknappen i kontrollpanelet.
MERK: En kort oppvarmingstid var nødvendig. Ikke forsøk å åpne luken når røntgenstråler genereres. Kontroller X-Ray On-lyset på frontpanelet og dataskjermen for å bekrefte om røntgenstråler genereres. - Klikk på Meny-knappen for å angi en ny database, og opprett deretter en ny prøve og studer.
- Velg Manuell fra rullegardinlisten Meny og skriv inn egendefinerte spennings- og strømverdier i kontrollpanelet. Sett spenning (kV ) til 90, strøm (μA ) til 80, skannemodus til høy oppløsning, 14 min og FOV (mm) til 18 mm x 18 mm.
MERK: Se håndboken for forskjellige micro CT-systemer for å angi de riktige parametrene. - Plasser benet sikkert med plastfilm i prøvesengen. Lukk luken. Forsikre deg om at motivet er sentrert nøyaktig i X-capture-vinduet ved å trykke på justeringsknappene på maskinen.
MERK: Justering av prøven må være langsom og skånsom for å unngå at den faller inn i maskinen ved et uhell. - Klikk Start-knappen for å starte CT-skanningen.
3. CT-dataanalyse
- Skriv inn programvaren (se Materialfortegnelse), og velg dataene som skal analyseres. Klikk på Sub , og angi Pikselstørrelse til 10 μm. Flytt og endre størrelsen på interesseområdet (ROI) for å inkludere det distale lårbenet over vekstplaten. Klikk på Start (se figur 1).
MERK: Pikselstørrelsen for rekonstruksjon av undervolum ble valgt til 10 μm siden tykkelsen på bildetrabeculae ble estimert til å være ca. 20-30 μm basert på histologiske data fra tidligere studier13. Hvis signal-støy-forholdet ikke er tilstrekkelig for databehandling, må en høyoppløselig skanning på 1 time utføres. - Klikk på Analyse 3D-knappen for å få den resulterende 3D-rekonstruksjonen.
- Eksporter dataene fra micro-CT-systemet til datamaskinen for analyse.
- Importer de rekonstruerte CT-dataene. Klikk på Behandle > bildekalkulator, og klikk deretter på Regionblokk > Interaktiv. Juster den gule avmerkingsboksen til riktig avkastning.
MERK: Interesseområdet (ROI) begynner ca. 540 μm proksimalt for vekstplaten og strekker seg 1600 μm proksimalt for å vurdere den faktiske benmetabolismen og remodelleringen. - Velg tillegget Bone Microarchitecture Analysis (BMA) (se Materialliste). Klikk Segment Cortex og deretter Segment Trabeculae.
MERK: Både trabekulært og kortikalt bein velges automatisk. Normalt er det ikke nødvendig med manuell justering. - Klikk på Save Final Object Map og klikk deretter Measure Bone for å beregne benmorfometriske indekser.
MERK: Kun relativ benmineraltetthet (BMD) ble beregnet her siden ingen kontroll ble lagt til.
4. Avkalkning av beinvev
- Fest benprøvene i 4% paraformaldehyd (se materialfortegnelse) i 24 timer. Vask prøvene tre ganger med PBS (se materialfortegnelse) i 20 minutter hver gang.
- Skyll vevet tre ganger med destillert vann i 20 min hver gang. Overfør vevet til en avkalkningsoppløsning som inneholder EDTA (se materialfortegnelse) og avkalk i 30 dager med ukentlig løsningsbytte til endepunkt.
MERK: Nålestikk, håndklemming og klemming brukes til å avslutte avkalkning når beinvevet blir mykt, eller det ikke er noen følelse av motstand ved nåling. Den fysiske metoden for deteksjon kan forårsake skade på vevstrukturen, så prøv å unngå overdreven kraft eller gjentatt testing. - Ta vevet ut av fikseringsmiddelet og bruk en skalpell for å trimme vevet i en avtrekkshette. Sett det trimmede vevet og den tilsvarende etiketten i en dehydreringsboks.
- Sett dehydreringsboksen i en kurv og dehydrer den i en vevsprosessor (se materialtabell) med gradientalkohol (75% etanol i 4 timer, 85% etanol i 2 timer, 90% etanol i 2 timer, 95% etanol i 1 time, vannfri etanol i 30 minutter, vannfri etanol II i 30 minutter, xylen I i 5-10 minutter, xylen II i 5-10 min, voks I i 1 time, voks II i 1 time, voks III i 1 time).
- Bruk en innebyggingsmaskin (se Materialfortegnelse) til å bygge inn det voksgjennomvåte vevet. Hell den smeltede voksen i en innebyggingsboks og legg vevet fra dehydreringsboksen før voksen stivner.
- Orienter vevet i henhold til innebyggingsoverflaten og fest den tilsvarende etiketten. Avkjøl på et frysebord på -20 °C (se Materialfortegnelse). Fjern voksblokken fra innebyggingsboksen etter størkning og trim voksblokken etter behov (se Materialfortegnelse).
- Klipp den trimmede voksblokken i 3 μm tykke lysbilder på en mikrotome (se materialfortegnelse). Flyt skliene på 40 °C varmt vann på en spredemaskin (se materialfortegnelse) for å flate ut vevet og øse det opp med et lysbilde.
- Stekes i en ovn på 60 °C (se materialfortegnelse) til vannet fordamper og voksen smelter. Ta ut og oppbevar ved romtemperatur (RT) for senere bruk.
5. HAN flekker
- Sett lysbildene i xylen I i 20 minutter, deretter i xylen II i 20 minutter. Legg deretter lysbildene i vannfri etanol I og vannfri etanol II i 5 minutter hver, 75% alkohol i 5 minutter, og vask deretter lysbildene med vann fra springen (se materialfortegnelse).
- Inkuber i hematoksylin (se materialtabell) i 3-5 minutter. Differensiere prøvene med en saltsyreoppløsning (se materialtabell). Behandle lysbildene med en ammoniakkoppløsning (se materialfortegnelse) for blåsing, og vask deretter lysbildene med vann.
- Sett lysbildene i 85%, 95% gradientalkohol for dehydrering, og flekk med eosinløsning (se materialtabell) i 5 minutter.
- Sett lysbildene i vannfri etanol I i 5 min, vannfri etanol II i 5 min og vannfri etanol III i 5 min. Behandle lysbildene med xylen I i 5 min, xylen II i 5 min, og monter med nøytral balsam (se materialfortegnelse).
- Undersøk hvert lysbilde under mikroskopet. Velg deretter de representative stykkene for panoramaskanning (se Materialfortegnelse).
MERK: Minst tre påfølgende skiver kreves for hver prøve. Før panoramaskanning må skivene undersøkes under et mikroskop for å sikre at de er komplette og klare. Forsikre deg om at benmarghulen, kortikale bein og avbrytende bein vises fullt ut, og at forskjellige typer beinceller kan sees.
6. HE bildeanalyse
- Åpne HE-bilder med CaseViewer-programvare (se Materialfortegnelse). Velg interesseområdet (ROI) på lysbildet, og lagre det som et fargebilde.
MERK: Valget av avkastning er i samsvar med ovennevnte programvare. - Åpne bildet i ImageJ (se Materialfortegnelse). Velg tryllestavverktøyet på verktøylinjen. Klikk på det trabekulære beinet.
- Juster toleransen og sammenhengende innstillinger etter behov. Gå til Image > Adjustments > Black &; White og klikk OK. Gjenta trinnene for andre områder av beinet.
- Inverter markeringen og fyll den med hvit farge. Lagre bildet som en maske for analyse (se figur 2).
MERK: For detaljert metodikk, se tidligere publisert arbeid14. - Åpne masken i analyseprogrammet15,16 (se Materialfortegnelse). Kjør Process > Binary > Make Binary for å konvertere fargebildet til et binært bilde.
- Bruk plugin 17 (se Materialfortegnelse) i programvaren for å analysere strukturelle parametere: Run Area / Volume Fraction for å beregne benvolum til totalt volum av bein (BV / TV [%]) 18,19.
MERK: Denne metoden er anvendelig for bein trabeculae og benmarg, fylle hele avkastningen i HE-bildene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Micro-CT-analyse
Vi målte trabekulære mikroarkitektoniske parametere hos mus fra begge gruppene og rapporterte deres gjennomsnittsverdier og SD i tabell 1. Fordelingen av noen parametere (dvs. forholdet mellom benvolum og totalt vevsvolum, trabekulær tykkelse, trabekulær separasjon) innenfor hver gruppe er illustrert i figur 3.
Disse resultatene indikerer signifikante forskjeller mellom mus i OVX- og Sham-gruppen for en rekke parametere som ble estimert fra Micro-CT. Forholdet mellom benvolum og totalt vevsvolum (BV / TV) i OVX-gruppen var nemlig 3% lavere enn i Sham-gruppen. Den trabekulære tykkelsen hos mus av OVX var lavere enn hos Sham-gruppen, med en relativ forskjellsprosent på 39,3%. Den trabekulære separasjonen hos OVX-mus var større enn hos Sham-mus. Figur 4 viser 3D-visninger av trabekulære avkastninger hentet fra rekonstruert beinvolum for hver gruppe. Sammenliknet med Sham-gruppen (figur 4A), var beintettheten hos mus etter ovariektomi sparsom og viste osteoporose (figur 4B).
HE fargeanalyse
I tillegg bekreftet histopatologisk analyse endringene som ble funnet i Micro-CT-analysen. Etter 8 uker viste HE-farging at det trabekulære beinet (rødt) under vekstplaten i det distale lårbenet hos mus etter OVX var redusert sammenlignet med Sham-gruppen, og det var nesten ingen tydelig tykk trabekulær struktur, og et stort antall fettlignende granulater dukket opp (figur 5A). Basert på den kvantitative analysen av vevssnitt hadde OVX-musene mindre trabekulært beinområde enn Sham (figur 5B).
Figur 1: Skjermbilde av grensesnittet for rekonstruksjon av undervolum. En subvolume rekonstruksjon i det grønne rektangelet for å komme ned til 10 μm i et 5,12 mm x 5,12 mm synsfelt (FOV). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bildemaskekonstruksjon i svart-hvitt. (A1-A3): HE-bilder fra Sham-gruppen (skalalinje = 200 μm). Bentrabekler er vist i svart innenfor det valgte området og andre vev i hvitt. (B1-B3) Bilder av OVX-gruppe (skalalinje = 200 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Sammenligning av mikrostrukturelle parametere for distale femorale trabekler mellom OVX- og Sham-grupper. (A) Forholdet mellom benvolum og totalt vevsvolum (BV/TV [%]) i OVX-gruppen var lavere enn i Sham-gruppen. (B) Den trabekulære tykkelsen (TB.Th [μm]) hos mus av OVX var lavere enn i Sham-gruppen. (C) Den trabekulære separasjonen (TB.sp [μm]) hos OVX-mus var større enn hos Sham-mus. * P < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Representative mikro-CT-bilder av trabekulært bein i distale femur. Sammenlignet med (A) Sham-gruppen, viste bentettheten til mus etter ovariektomi (B) sparsom trabeculae og viste osteoporose. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5 Histologisk analyse av det trabekulære beinområdet i distale femur i OVX- og Sham-gruppene. (A) Representative HE-fargede bilder av distale femur i hver gruppe (skala bar = 500 μm). Svarte piler viser trabeculae. (B) Den kvantitative analysen av det trabekulære beinområdet av det totale vevsvolumet i den valgte avkastningen. *P < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Parameter | Humbug-operert gruppe (SHAM) (n = 5). |
Ovariektomi gruppe (OVX) (n = 5). |
P-verdi |
| Benvolum–til–totalt vevsvolumforhold (%) | 7,3 ± 0,9 | 4,2 ± 0,5 | 0.012* |
| Trabekulær tykkelse (μm) | 79,5 ± 5,5 | 53,4 ± 6,0 | 0.013* |
| Trabekulær separasjon (μm) | 212,5 ± 8,7 | 249,4 ± 8,3 | 0.015* |
| Verdier er gjennomsnittet ± SD. * Vesentlig forskjellig (P<0 .05). |
|||
Tabell 1: Trabekulære benparametre estimert fra Micro-CT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Osteoporose kan føre til hyppige brudd, som er kostbare, kan forårsake smerte, funksjonshemming eller til og med død, og alvorlig påvirke livskvaliteten til pasienter20. Gjennom årene har ovariektomimodellen blitt anerkjent som en av standardmetodene for å studere osteoporose21. Den vanligste prekliniske dyremodellen for osteoporose er ovariektomisert (OVX) rotte. Til tross for dette har flertallet av forskningen på mekanismene for beinforstyrrelser, inkludert osteoporose, blitt utført ved bruk av mus22. For å etablere en osteoporosemodell hos voksne kvinnelige C57/BL6J-mus, utføres ovariektomi ved 12 ukers alder, som er det optimale tidspunktet for denne prosedyren. Mus er modne og fruktbare fra 8-12 ukers alder, og ovariektomi har en signifikant effekt på beinmassen på dette tidspunktet10. Tidligere studier viser at før 12 uker vokser musens bein raskt, og indikatorene for beinmorfologi, BMD og beinbiomekanikk øker raskt. Total BMD og kortikal ben-BMD er signifikant korrelert med musenes alder. Men etter 12 uker går beinmetabolismen av mus inn i en stabil periode, og de ovennevnte indikatorene har en tendens til å være stabil23,24.
Benmikroarkitektur har blitt foreslått som den primære faktoren som påvirker benskjørhet, uavhengig av BMD. Benfragheten til osteoporose er ikke fullt ut forklart av et underskudd i benmasse. BMD kan bare forklare 60% -70% av beinstyrken25. Når det gjelder strukturell sammensetning, kortikale bein omfatter 80% av benmassen, mens avbrytende bein utviser bare 10% av målingene etter å ha mistet 50% av benmassen, noe som tyder på at benmassemålinger alene ikke er tilstrekkelig til å vurdere benmassetap. I tillegg til beinvolum er strukturelle endringer i bein trabeculae kritiske for beinstyrken. Cancellous bein inneholder hematopoietisk benmargvev eller fettvev. Overflaten er ganske stor, omtrent åtte ganger større enn kortikal bein. Dette store overflatearealet som er koblet til benmargen, gjør at det avbrutte beinet har en ganske høy beinkonverteringsfrekvens. Derfor valgte vi mikrostrukturen av bein trabeculae som hovedindikator for å observere osteoporotiske forandringer. Det trabekulære beinvevet i skjelettet gjennomgår stadig ombygging under vekst, hvor nydannede beintrabeculae erstatter de eksisterende og danner sekundært svampete bein. Derfor, under normale forhold, er morfometrisk analyse av trabekulært bein hovedsakelig fokusert på det sekundære svampete beinområdet. Primær svampete beinvev er derimot en medfødt tilstede og relativt stabil struktur som ikke er ombygd og derfor må utelukkes fra analysen. Vanligvis kan beinet innenfor en viss avstand fra vekstplaten betraktes som aktivt remodeling vev. Derfor valgte vi et interesseområde (ROI) som starter fra 540 μm over vekstplaten og spenner over 1600 μm i proksimal retning for analysen. Ifølge våre funn viser mus svært forskjellige mikrostrukturelle egenskaper i trabekulære regioner etter ovariektomi.
Micro-CT-teknologien som brukes i denne studien er en ikke-destruktiv 3D-avbildningsteknikk utviklet de siste tiårene og blir gradvis brukt i den farmakologiske studien av etnomedisinske urter. Det gir en klar forståelse av prøvens indre mikrostruktur uten å ødelegge den. Når det gjelder den histopatologiske undersøkelsen, skader harpiksinnbyggingsmetoden enzymaktivitet og proteinantigenisitet og kan ikke brukes pålitelig til histokjemi eller immunhistokjemi26. Den tradisjonelle parafininnstøpingen kan kombineres med teknikker som immunhistokjemi (IHC), fluorescens in situ hybridisering (FISH) og konfokal laserskanningsmikroskop (CLSM) for kvantitativt å oppdage stoffer med lav overflod i beinvev på molekylært nivå, og dermed få en dypere forståelse av mekanismene og reguleringen av benmetabolisme. Den panoramiske lysbildeskanneren kan raskt konvertere lysbilder til høyoppløselige digitale bilder, noe som gjør det mulig å kvantitativt analysere beinhistomorfologidata ved hjelp av dataprogramvare. Oppsummert kan kombinasjonen av Micro-CT og benhistomorfologi gi en mer detaljert og nøyaktig evaluering av beinmikrostruktur.
Tradisjonelt var vurdering av benkvalitet i stor grad begrenset til dual-energy røntgenabsorptiometri (DXA), datatomografi med begrenset oppløsning eller teknisk utfordrende magnetisk resonansavbildning27. Selv om kombinasjonen av de to teknikkene har sine unike fordeler, har den også sine begrensninger. For det første, selv om Micro-CT muliggjør langsiktig kontinuerlig overvåking av samme dyr, er in vivo-avbildning av skjelettmikrostrukturer hos levende små dyr, spesielt mus, fortsatt teknisk utfordrende28. For det andre gjør fraværet av en strukturert og internasjonalt anerkjent protokoll for innhenting og analyse av data fra ulike instrumenter eller brukere det vanskelig å sammenligne datasett og reprodusere forskningsresultater på tvers av studier. For det tredje, på grunn av egenskapene til Micro-CT, er eksponering for ioniserende stråling uunngåelig. For det fjerde, selv om vår enkle og økonomiske protokoll kan gi kvantitativ analyse av HE-fargede beinbilder, er den hovedsakelig basert på en halvautomatisk segmenteringsstrategi, som er mer arbeidskrevende enn komplekse automatiserte metoder.
Avslutningsvis vil anvendelsen av denne teknologien utvilsomt gi en stor drivkraft til osteoporoseforskning i etnomedisin under leteprosessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Sichuan Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine (2021YJ0175) og Graduate Research Innovation Project ved School of Clinical Medicine (LCYJSKT2023-11), Chengdu University of Traditional Chinese Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
| Ammonia Solution | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anatomical Forceps | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J3C030 | |
| Anhydrous Ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Automatic Dyeing Machine | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
| Bone Microarchitecture Analysis Add-on | AnalyzeDirect, Inc | ||
| C57BL/6J mice | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Carrier Slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Coverslips | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Decalcification Solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Delicate Scissors | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | ZJA010 | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fiji: ImageJ | National Institutes of Health, USA | ||
| Film Sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| Freezing Table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| H&E Staining Kit | Leagene | DH0020 | |
| Hydrochloric Acid Solution | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| ImageJ2 Plugin | BoneJ 7.0.16 | ||
| Medical Gauze | Shandong Ang Yang Medical Technology Co. | ||
| Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures | Ethicon, Inc. | SA84G | |
| Needle Holder | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J32010 | |
| Neutral Balsam | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| PANNORAMIC Digital Slide Scanners | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Povidone-iodine solution 5% | Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Quantum GX2 microCT Imaging System | PerkinElmer, Inc. | ||
| Rotary Microtome | Thermo scientific | HM325 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Scan & Browse Software | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
| Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves | Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd | 22B141EO | |
| Sodium Chloride Solution 0.9% | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Sterile Hypodermic Syringes for Single Use | Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd | ||
| Sterile Medical Suture Needles | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | PW8068 | |
| Tissue Processor | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Tissue Spreading and Baking Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Tribromoethanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M2920 | |
| Wax Trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Wang, J., et al. The prevalence of osteoporosis in China, a community based cohort study of osteoporosis. Frontiers in Public Health. 11, 1084005 (2023).
- Stein, M., et al. Why animal experiments are still indispensable in bone research: A statement by the European Calcified Tissue Society. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (8), 1045-1061 (2023).
- Kerschan-Schindl, K., Papageorgiou, M., Föger-Samwald, U., Butylina, M., Weber, M., Pietschmann, P. Assessment of bone microstructure by micro CT in C57BL/6J mice for sex-specific differentiation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 14585 (2022).
- Fonseca, H., Moreira-Gonçalves, D., Coriolano, H. J. A., Duarte, J. A. Bone quality: the determinants of bone strength and fragility. Sports Medicine. 44, 37-53 (2014).
- Bouxsein, M. L., Boyd, S. K., Christiansen, B. A., Guldberg, R. E., Jepsen, K. J., Müller, R. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Akhter, M. P., Recker, R. R. High resolution imaging in bone tissue research-review. Bone. 143, 115620 (2021).
- Mys, K., et al. Quantification of 3D microstructural parameters of trabecular bone is affected by the analysis software. Bone. 142, 115653 (2021).
- Chavassieux, P., Chapurlat, R. Interest of bone histomorphometry in bone pathophysiology investigation: Foundation, present, and future. Frontiers in Endocrinology. 13, 907914 (2022).
- Komori, T.
- Zhu, S., et al. Ovariectomy-induced bone loss in TNFα and IL6 gene knockout mice is regulated by different mechanisms. Journal of Molecular Endocrinology. 60 (3), 185-198 (2018).
- Baum, T., et al. Osteoporosis imaging: effects of bone preservation on MDCT-based trabecular bone microstructure parameters and finite element models. BMC Medical Imaging. 15, 22 (2015).
- Nazarian, A., Hermannsson, B. J., Muller, J., Zurakowski, D., Snyder, B. D. Effects of tissue preservation on murine bone mechanical properties. Journal of Biomechanics. 42 (1), 82-86 (2009).
- Martín-Badosa, E., Amblard, D., Nuzzo, S., Elmoutaouakkil, A., Vico, L., Peyrin, F. Excised bone structures in mice: imaging at three-dimensional synchrotron radiation micro CT. Radiology. 229 (3), 921-928 (2003).
- Egan, K. P., Brennan, T. A., Pignolo, R. J. Bone histomorphometry using free and commonly available software. Histopathology. 61 (6), 1168-1173 (2012).
- Brandi, M. L. Microarchitecture, the key to bone quality. Rheumatology. 48 (suppl_4), iv3-iv8 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Domander, R., Felder, A. A., Doube, M.
- Parfitt, A. M., et al. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units: report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. Journal of Bone and Mineral Research. 2 (6), 595-610 (1987).
- Kazama, J. J., Koda, R., Yamamoto, S., Narita, I., Gejyo, F., Tokumoto, A. Cancellous bone volume is an indicator for trabecular bone connectivity in dialysis patients. Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 5 (2), 292-298 (2010).
- Watts, N. B. Postmenopausal osteoporosis: A clinical review. Journal of Women's Health. 27 (9), 1093-1096 (2018).
- Thompson, D. D., Simmons, H. A., Pirie, C. M., Ke, H. Z. FDA Guidelines and animal models for osteoporosis. Bone. 17 (4), S125-S133 (1995).
- Iwaniec, U. T., Yuan, D., Power, R. A., Wronski, T. J. Strain-dependent variations in the response of cancellous bone to ovariectomy in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (7), 1068-1074 (2006).
- Ferguson, V. L., Ayers, R. A., Bateman, T. A., Simske, S. J. Bone development and age-related bone loss in male C57BL/6J mice. Bone. 33 (3), 387-398 (2003).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (8), 1197-1207 (2007).
- Seeman, E. The structural and biomechanical basis of the gain and loss of bone strength in women and men. Endocrinology and Metabolism Clinics. 32 (1), 25-38 (2003).
- Ticha, P., et al. A novel cryo-embedding method for in-depth analysis of craniofacial mini pig bone specimens. Scientific Reports. 10 (1), 19510 (2020).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology. 47 (suppl_4), iv9-iv16 (2008).
- Zaw Thin, M., Moore, C., Snoeks, T., Kalber, T., Downward, J., Behrens, A. Micro-CT acquisition and image processing to track and characterize pulmonary nodules in mice. Nature Protocols. 18 (3), 990-1015 (2023).
