Summary
Dieses Protokoll stellt eine kostengünstige und effiziente Methode zur quantitativen Bewertung der Knochenmikroarchitektur in einem Mausmodell der Osteoporose dar, indem Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung und Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) kombiniert werden.
Abstract
Die Knochenmikrostruktur bezieht sich auf die Anordnung und Qualität des Knochengewebes auf mikroskopischer Ebene. Das Verständnis der Knochenmikrostruktur des Skeletts ist entscheidend, um Einblicke in die Pathophysiologie der Osteoporose zu gewinnen und ihre Behandlung zu verbessern. Die Handhabung von Knochenproben kann jedoch aufgrund ihrer harten und dichten Eigenschaften komplex sein. Zweitens erschwert spezialisierte Software die Bildverarbeitung und -analyse. In diesem Protokoll stellen wir eine kostengünstige und einfach zu handhabende Lösung für die trabekuläre Knochenmikrostrukturanalyse vor. Detaillierte Schritte und Vorsichtsmaßnahmen werden bereitgestellt. Mikro-CT ist ein zerstörungsfreies dreidimensionales (3D) Bildgebungsverfahren, das hochauflösende Bilder der trabekulären Knochenstruktur liefert. Sie ermöglicht die objektive und quantitative Bewertung der Knochenqualität, weshalb sie weithin als Goldstandardmethode zur Beurteilung der Knochenqualität gilt. Die Histomorphometrie bleibt jedoch unverzichtbar, da sie entscheidende Parameter auf zellulärer Ebene liefert und die Lücke zwischen zweidimensionalen (2D) und 3D-Beurteilungen von Knochenproben schließt. Was die histologischen Techniken betrifft, so haben wir uns dafür entschieden, das Knochengewebe zu entkalken und dann eine traditionelle Paraffineinbettung durchzuführen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination dieser beiden Methoden umfassendere und genauere Informationen über die Knochenmikrostruktur liefern kann.
Introduction
Osteoporose ist eine weit verbreitete metabolische Knochenerkrankung, insbesondere bei älteren Menschen, und geht mit einem erhöhten Risiko für Fragilitätsfrakturen einher. Da Osteoporose in China immer häufiger vorkommt1, wird es eine wachsende Nachfrage nach der Untersuchung der Knochenstrukturen von Kleintieren geben 2,3. Die bisherigen Methoden zur Messung des Knochenschwunds beruhen auf den Ergebnissen der zweidimensionalen Dual-Energy-Röntgenabsorptiometrie. Dies erfasst jedoch nicht die Veränderungen in der architektonischen Mikrostruktur des Trabekelknochens, die ein Schlüsselfaktor für die Skelettfestigkeit ist4. Die Mikrostruktur des Knochens beeinflusst seine Festigkeit, Steifigkeit und Bruchfestigkeit. Durch den Vergleich der Knochenmikroarchitektur in normalen und pathologischen Zuständen können durch Osteoporose verursachte Veränderungen der Morphologie, Struktur und Funktion des Knochengewebes identifiziert werden. Diese Informationen tragen zum Verständnis der Entstehung von Osteoporose und ihres Zusammenhangs mit anderen Krankheiten bei.
Die Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) hat sich in letzter Zeit zu einer beliebten Technik für die Beurteilung der Knochenmorphologie entwickelt, wo sie genaue und umfassende Daten zu Knochenstruktur- und Dichteparametern wie Knochenvolumenanteil, -dicke und -trennung liefern kann 5,6. Gleichzeitig können die Mikro-CT-Ergebnisse durch die Analysesoftware7 beeinflusst werden. Verschiedene Methoden der Bildaufnahme, -auswertung und -befundung werden von verschiedenen kommerziellen Mikro-CT-Systemen verwendet. Diese Inkonsistenz macht es schwierig, die Ergebnisse verschiedener Studien zu vergleichen und zu interpretieren5. Außerdem kann sie die Knochenhistomorphometrie derzeit nicht ersetzen, da sie den Forschern Informationen über Parameter auf zellulärer Ebene im Skelettsystem liefert8. Histologische Techniken ermöglichen die direkte Beobachtung und Messung der mikroskopischen Morphologie des Knochens. Die Hämatoxylin- und Eosinfärbung (HE) ist eine gängige Färbetechnik, die in der Histologie verwendet wird, um die allgemeine Struktur von Zellen und Geweben sichtbar zu machen. Es wird verwendet, um das Vorhandensein von Knochengewebe und seine Mikroarchitektur zu identifizieren.
In diesem Artikel wird Mikro-CT in Kombination mit einer Gewebeschneidetechnik (Hämatoxylin-Eosin [HE]-Färbung) verwendet, um Knochengewebebilder zu sammeln und eine quantitative Analyse des trabekulären Knochens durchzuführen, um die Veränderungen der Knochenmikrostruktur in einem Osteoporose-Mausmodell zu bewerten.
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Protocol
Das Tierprotokoll wurde von der Tierethikkommission der Chengdu University of Traditional Chinese Medicine genehmigt (Datensatznummer: 2020-34). Weibliche C57BL/6J-Mäuse (12 Wochen alt, n = 14) wurden nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen eingeteilt, eine scheinoperierte Gruppe (Sham-Gruppe, n = 7) und eine Modellgruppe (OVX-Gruppe, n = 7). Die Tiere wurden von einem kommerziellen Lieferanten gekauft (siehe Materialtabelle). Alle Mäuse wurden in Einzelkäfigen bei 22-26 °C und 45%-55% Luftfeuchtigkeit gehalten, durften sich 1 Woche lang an ihre neue Umgebung anpassen und hatten freien Zugang zu Wasser und Futter. Alle tierexperimentellen Studien wurden an der Chengdu University of Traditional Chinese Medicine durchgeführt, und es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden der Tiere zu minimieren.
1. Vorbereitung des Tiermodells
- Die 12 Wochen alte Maus wird durch intraperitoneale Injektion mit 1,25 % Avertin (Tribromethanol in tert-Amylalkohol, siehe Materialtabelle) in einer Dosierung von 0,02 ml/g anästhesiert. Positionieren Sie die Maus in Bauchlage auf einem sterilen chirurgischen Operationstisch und immobilisieren Sie ihre Gliedmaßen, indem Sie sie sicher abkleben.
- Verwenden Sie eine Schere (siehe Materialtabelle), um alle Haare zu schneiden, die den chirurgischen Eingriff beeinträchtigen könnten.
HINWEIS: Es wird empfohlen, Hautschäden bei der Vorbereitung des Operationsfeldes zu vermeiden. - Waschen Sie sich gründlich die Hände und ziehen Sie OP-Handschuhe an. Desinfizieren Sie den Rücken der Maus dreimal mit Povidon-Jod (siehe Materialtabelle) und trocknen Sie ihn mit medizinischer Gaze (siehe Materialtabelle) ab.
HINWEIS: Seien Sie vorsichtig; Wenn die Haare während der Desinfektion zu nass werden, kann dies bei Mäusen zu einer postoperativen Unterkühlung führen. - Mit einem Skalpell einen etwa 0,5-1,0 cm langen Schnitt machen, der 1 cm von einem Drittel der Mittellinie des Rückens der Maus entfernt ist (siehe Materialtabelle). Trennen Sie die Faszie vorsichtig ab und durchtrennen Sie den Muskel mit einer Gewebeschere (siehe Materialtabelle), bis der Eierstock sichtbar ist. Die umgebenden Blutgefäße werden mit nicht resorbierbaren Nähten ligiert (siehe Materialtabelle) und der Eierstock entfernt.
- Spülen Sie den Hohlraum mit 0,9%iger Kochsalzlösung aus und vernähen Sie dann Haut, Muskel und Faszien separat (siehe Materialtabelle).
- Wiederholen Sie die gleiche Schrittfolge auf der anderen Seite.
- Entfernen Sie perivarielles Fett in der gleichen Größe wie der Eierstock und führen Sie das oben beschriebene chirurgische Verfahren für die verbleibenden Schritte zur Etablierung des scheinoperierten Modells durch.
- Planen Sie eine Erholungsphase von 1 Woche nach der Operation ein. Nach 8 Wochen werden osteoporotische Mausmodelleerfolgreich etabliert 9,10.
2. Mikro-CT-Scan
- Euthanasie der Maus durch übermäßiges Einatmen von CO2 - Inhalation. Entfernen Sie nach der Euthanasie so viel Weichgewebe wie möglich aus dem Oberschenkelknochen der Maus und entnehmen Sie eine frische Probe zum Scannen.
HINWEIS: Es gibt zwar keine perfekte Lösung für die Probenkonservierung, aber es können bestimmte Schritte unternommen werden, um die Qualität der Mikro-CT-Scanergebnisse zu maximieren. Achten Sie vor der Fixierung darauf, so viel umliegendes Gewebe wie möglich zu entfernen. Formalin oder gepuffertes Formalin ist die am meisten bevorzugte Methode der Fixierung mit Speicherung in PBS11,12. - Doppelklicken Sie auf das Softwaresymbol des Mikro-CT-Bildgebungssystems auf dem Desktop, um das System zu starten (siehe Materialtabelle). Wählen Sie ein Probenbett, das mit dem Sichtfeld (FOV) von 18 mm x 18 mm kompatibel ist. Laden Sie das entsprechende Probenbett in die Maschine und schließen Sie die Klappe.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Aufwärmen in der Systemsteuerung.
HINWEIS: Es war eine kurze Aufwärmzeit erforderlich. Versuchen Sie nicht, die Klappe zu öffnen, wenn Röntgenstrahlen erzeugt werden. Überprüfen Sie die Röntgenanzeige an der Vorderseite und auf dem Computermonitor, um zu bestätigen, ob Röntgenstrahlen erzeugt werden. - Klicken Sie auf die Schaltfläche Menü , um eine neue Datenbank festzulegen, und erstellen Sie dann eine neue Stichprobe und Studie.
- Wählen Sie Manuell aus der Dropdown-Liste Menü und geben Sie benutzerdefinierte Spannungs- und Stromwerte in die Systemsteuerung ein. Stellen Sie die Spannung (kV ) auf 90, den Strom (μA ) auf 80, den Scan-Modus auf Hohe Auflösung, 14 Minuten und das Sichtfeld (mm) auf 18 mm x 18 mm ein.
HINWEIS: Lesen Sie das Handbuch für verschiedene Mikro-CT-Systeme, um die entsprechenden Parameter einzustellen. - Positionieren Sie den Knochen mit Kunststofffolie sicher im Probenbett. Schließen Sie die Luke. Stellen Sie sicher, dass das Motiv im X-Capture-Fenster genau zentriert ist, indem Sie die Einstelltasten am Gerät drücken.
HINWEIS: Das Einstellen der Probe muss langsam und vorsichtig erfolgen, um zu vermeiden, dass sie versehentlich in die Maschine fällt. - Klicken Sie auf die Schaltfläche Start , um den CT-Scan zu starten.
3. CT-Datenanalyse
- Rufen Sie die Software auf (siehe Materialtabelle) und wählen Sie die zu analysierenden Daten aus. Klicken Sie auf Sub und stellen Sie die Pixelgröße auf 10 μm ein. Verschieben Sie die Region of Interest (ROI) und ändern Sie ihre Größe, um den distalen Oberschenkelknochen über der Wachstumsfuge einzuschließen. Klicken Sie auf Start (siehe Abbildung 1).
ANMERKUNG: Die Pixelgröße der Subvolume-Rekonstruktion wurde auf 10 μm gewählt, da die Dicke der abbildenden Trabekel auf der Grundlage histologischer Daten aus früheren Studien auf etwa 20-30 μm geschätzt wurde13. Reicht das Signal-Rausch-Verhältnis für die Datenverarbeitung nicht aus, muss ein hochauflösender 1-h-Scan durchgeführt werden. - Klicken Sie auf die Schaltfläche 3D-Analyse, um die resultierende 3D-Rekonstruktion zu erhalten.
- Exportieren Sie die Daten aus dem Mikro-CT-System zur Analyse auf den Computer.
- Importieren Sie die rekonstruierten CT-Daten. Klicken Sie auf "> Bildrechner verarbeiten" und dann auf "Region-Pad > Interaktiv". Passen Sie das gelbe Kontrollkästchen an den entsprechenden ROI an.
HINWEIS: Die Region of Interest (ROI) beginnt etwa 540 μm proximal der Wachstumsfuge und erstreckt sich proximal um 1600 μm, um den tatsächlichen Knochenstoffwechsel und -umbau zu beurteilen. - Wählen Sie das Add-on Knochenmikroarchitekturanalyse (BMA) aus (siehe Materialtabelle). Klicken Sie auf Kortex segmentieren und dann auf Trabekel segmentieren.
HINWEIS: Sowohl der Trabekelknochen als auch der kortikale Knochen werden automatisch ausgewählt. In der Regel ist keine manuelle Einstellung erforderlich. - Klicken Sie auf Endgültige Objektzuordnung speichern und dann auf Knochen messen , um die morphometrischen Knochenindizes zu berechnen.
HINWEIS: Hier wurde nur die relative Knochenmineraldichte (BMD) berechnet, da keine Kontrolle hinzugefügt wurde.
4. Entkalkung von Knochengewebe
- Fixieren Sie die Knochenproben 24 h lang in 4%igem Paraformaldehyd (siehe Materialtabelle). Waschen Sie die Proben dreimal mit PBS (siehe Materialtabelle) für jeweils 20 Minuten.
- Spülen Sie das Gewebe dreimal mit destilliertem Wasser für jeweils 20 Minuten ab. Das Gewebe wird in eine EDTA-haltige Entkalkungslösung überführt (siehe Materialtabelle) und 30 Tage lang mit einem wöchentlichen Lösungswechsel bis zum Endpunkt entkalkt.
HINWEIS: Nadelstiche, Handkneifen und Klemmen werden verwendet, um die Entkalkung zu beenden, wenn das Knochengewebe weich wird oder beim Nadeln kein Widerstand mehr vorhanden ist. Die physikalische Nachweismethode kann die Gewebestruktur beschädigen, daher sollten Sie versuchen, übermäßige Krafteinwirkung oder wiederholte Tests zu vermeiden. - Nehmen Sie das Gewebe aus dem Fixiermittel und schneiden Sie es mit einem Skalpell in einem Abzug ab. Legen Sie das abgeschnittene Taschentuch und das dazugehörige Etikett in eine Dörrbox.
- Die Trocknungsbox in einen Korb legen und in einem Gewebeprozessor (siehe Materialtabelle) mit Gradientenalkohol (75 % Ethanol für 4 h, 85 % Ethanol für 2 h, 90 % Ethanol für 2 h, 95 % Ethanol für 1 h, wasserfreies Ethanol für 30 min, wasserfreies Ethanol II für 30 min, Xylol I für 5-10 min, Xylol II für 5-10 min, Wachs I für 1 h, Wachs II für 1 h, Wachs III für 1 h).
- Verwenden Sie eine Einbettmaschine (siehe Materialtabelle), um das wachsgetränkte Gewebe einzubetten. Gießen Sie das geschmolzene Wachs in eine Einbettbox und legen Sie das Gewebe aus der Dehydrierungsbox ein, bevor das Wachs aushärtet.
- Richten Sie das Gewebe entsprechend der Einbettungsfläche aus und bringen Sie das entsprechende Etikett an. Auf einem Gefriertisch bei -20 °C abkühlen lassen (siehe Materialtabelle). Entfernen Sie den Wachsblock nach dem Erstarren aus der Einbettbox und schneiden Sie den Wachsblock nach Bedarf ab (siehe Materialtabelle).
- Schneiden Sie den getrimmten Wachsblock auf einem Mikrotom in 3 μm dicke Objektträger (siehe Materialtabelle). Schwimmen Sie die Objektträger in 40 °C warmem Wasser auf einer Gewebespreizmaschine (siehe Materialtabelle), um das Gewebe flach zu drücken, und schöpfen Sie es mit einem Objektträger auf.
- Im Ofen bei 60 °C backen (siehe Materialtabelle), bis das Wasser verdunstet und das Wachs schmilzt. Zur späteren Verwendung herausnehmen und bei Raumtemperatur (RT) lagern.
5. HE-Färbung
- Legen Sie die Objektträger für 20 Minuten in Xylol I, dann für 20 Minuten in Xylol II. Des Weiteren werden die Objektträger für jeweils 5 Minuten in wasserfreies Ethanol I und wasserfreies Ethanol II und 5 Minuten lang in 75%igen Alkohol gelegt und dann mit Leitungswasser gewaschen (siehe Materialtabelle).
- In Hämatoxylin (siehe Materialtabelle) 3-5 Minuten inkubieren. Differenzieren Sie die Proben mit einer Salzsäurelösung (siehe Materialtabelle). Behandeln Sie die Objektträger mit einer Ammoniaklösung (siehe Materialtabelle), um sie zu bläuen, und waschen Sie die Objektträger dann mit Wasser.
- Legen Sie die Objektträger zur Dehydrierung in 85 %, 95 % Gradientenalkohol und färben Sie sie 5 Minuten lang mit Eosinlösung (siehe Materialtabelle).
- Legen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in wasserfreies Ethanol I, 5 Minuten in wasserfreies Ethanol II und 5 Minuten in wasserfreies Ethanol III. Behandeln Sie die Objektträger 5 Minuten lang mit Xylol I, 5 Minuten mit Xylol II und montieren Sie sie mit neutralem Balsam (siehe Materialtabelle).
- Untersuchen Sie jeden Objektträger unter dem Mikroskop. Wählen Sie dann die repräsentativen Schichten für das Panoramascannen aus (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Für jede Probe sind mindestens drei aufeinanderfolgende Schichten erforderlich. Vor dem Panoramascannen müssen die Schichten unter dem Mikroskop untersucht werden, um sicherzustellen, dass sie vollständig und klar sind. Stellen Sie sicher, dass die Knochenmarkhöhle, der kortikale Knochen und der spongiöse Knochen vollständig dargestellt werden und dass verschiedene Arten von Knochenzellen zu sehen sind.
6. HE-Bildanalyse
- Öffnen Sie HE-Bilder mit der CaseViewer-Software (siehe Materialtabelle). Wählen Sie den Interessenbereich (ROI) auf der Folie aus, und speichern Sie ihn als Farbbild.
HINWEIS: Die Auswahl des ROI stimmt mit der oben genannten Software überein. - Öffnen Sie das Bild in ImageJ (siehe Materialtabelle). Wählen Sie das Zauberstab-Werkzeug aus der Symbolleiste aus. Klicken Sie auf den Trabekelknochen.
- Passen Sie die Einstellungen für die Toleranz und die angrenzenden Bereiche nach Bedarf an. Gehen Sie zu Bild > Anpassungen > Schwarzweiß und klicken Sie auf OK. Wiederholen Sie die Schritte für andere Bereiche des Knochens.
- Kehren Sie die Auswahl um und füllen Sie sie mit weißer Farbe. Speichern Sie das Bild zur Analyse als Maske (siehe Abbildung 2).
HINWEIS: Die detaillierte Methodik finden Sie in der zuvor veröffentlichten Arbeit14. - Öffnen Sie die Maske in der Analysesoftware15,16 (siehe Materialtabelle). Führen Sie > Binärdatei verarbeiten > Binär erstellen, um das Farbbild in ein Binärbild zu konvertieren.
- Verwenden Sie das Plugin 17 (siehe Materialtabelle) in der Software, um strukturelle Parameter zu analysieren: Run Area/Volume Fraction zur Berechnung des Knochenvolumens zum Gesamtvolumen des Knochens (BV/TV [%])18,19.
HINWEIS: Diese Methode ist für Knochentrabekel und Knochenmark anwendbar und füllt den gesamten ROI in den HE-Bildern aus.
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Representative Results
Mikro-CT-Analyse
Wir haben die trabekulären mikroarchitektonischen Parameter bei Mäusen beider Gruppen gemessen und ihre Mittelwerte und SDs in Tabelle 1 angegeben. Die Verteilung einiger Parameter (d. h. das Verhältnis von Knochenvolumen zu Gesamtgewebevolumen, Trabekeldicke, Trabekeltrennung) innerhalb jeder Gruppe ist in Abbildung 3 dargestellt.
Diese Ergebnisse deuten auf signifikante Unterschiede zwischen Mäusen der OVX- und Sham-Gruppe für eine Reihe von Parametern hin, die mit Hilfe von Mikro-CT geschätzt wurden. Das Verhältnis von Knochenvolumen zu Gesamtgewebevolumen (BV/TV) war nämlich in der OVX-Gruppe um 3 % niedriger als in der Sham-Gruppe. Die trabekuläre Dicke bei OVX-Mäusen war geringer als bei Mäusen der Sham-Gruppe, mit einem relativen Differenzprozentsatz von 39,3 %. Die trabekuläre Trennung war bei OVX-Mäusen größer als bei Sham-Mäusen. Abbildung 4 zeigt 3D-Darstellungen der trabekulären ROIs, die aus dem rekonstruierten Knochenvolumen für jede Gruppe extrahiert wurden. Verglichen mit der Sham-Gruppe (Abbildung 4A), der Knochendichte von Mäusen nach Ovariektomie, waren die Trabekel spärlich und zeigten Osteoporose (Abbildung 4B).
Analyse der HE-Färbung
Darüber hinaus bestätigte die histopathologische Analyse die in der Mikro-CT-Analyse festgestellten Veränderungen. Nach 8 Wochen zeigte die HE-Färbung, dass der trabekuläre Knochen (rot) unter der Wachstumsfuge des distalen Femurs von Mäusen nach OVX im Vergleich zur Sham-Gruppe reduziert war, und es gab fast keine offensichtliche dicke Trabekelstruktur, und eine große Anzahl von fettartigen Körnchen erschien (Abbildung 5A). Basierend auf der quantitativen Analyse von Gewebeschnitten wiesen die OVX-Mäuse eine geringere trabekuläre Knochenfläche auf als die Scheinmäuse (Abbildung 5B).
Abbildung 1: Screenshot der Oberfläche der Subvolume-Rekonstruktion. Eine Subvolume-Rekonstruktion im grünen Rechteck, um in einem Sichtfeld von 5,12 mm x 5,12 mm (FOV) auf 10 μm zu kommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Aufbau der Bildmaske in Schwarz-Weiß. (A1-A3): HE-Bilder aus der Sham-Gruppe (Maßstabsleiste = 200 μm). Knochentrabekel werden innerhalb der ausgewählten Region schwarz und andere Gewebe weiß dargestellt. (B1-B3) Bilder der OVX-Gruppe (Maßstabsleiste = 200 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Vergleich der mikrostrukturellen Parameter der distalen femoralen Trabekel zwischen OVX- und Sham-Gruppe. (A) Das Verhältnis von Knochenvolumen zu Gesamtgewebevolumen (BV/TV [%]) war in der OVX-Gruppe niedriger als in der Sham-Gruppe. (B) Die trabekuläre Dicke (TB.Th [μm]) war bei OVX-Mäusen geringer als in der Sham-Gruppe. (C) Die trabekuläre Trennung (TB.sp [μm]) war bei OVX-Mäusen größer als bei Sham-Mäusen. *P < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Mikro-CT-Aufnahmen des trabekulären Knochens im distalen Femur. Im Vergleich zur (A) Sham-Gruppe zeigte die Knochendichte der Mäuse nach Ovariektomie (B) spärliche Trabekel und Osteoporose. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Histologische Analyse des trabekulären Knochenbereichs im distalen Femur der OVX- und Sham-Gruppen. (A) Repräsentative HE-gefärbte Bilder des distalen Femurs in jeder Gruppe (Maßstabsbalken = 500 μm). Schwarze Pfeile zeigen Trabekelen. (B) Die quantitative Analyse der trabekulären Knochenfläche des gesamten Gewebevolumens im ausgewählten ROI. *P < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Parameter | Scheinbetriebene Gruppe (SHAM) (n = 5). |
Ovariektomie-Gruppe (OVX) (n = 5). |
P-Wert |
| Verhältnis von Knochenvolumen zu Gesamtgewebevolumen (%) | 7,3 ± 0,9 | 4,2 ± 0,5 | 0.012* |
| Trabekeldicke (μm) | 79,5 ± 5,5 | 53,4 ± 6,0 | 0.013* |
| Trabekuläre Trennung (μm) | 212,5 ± 8,7 | 249,4 ± 8,3 | 0.015* |
| Die Werte sind der Mittelwert ± SD. * Signifikant unterschiedlich (P<0 .05). |
|||
Tabelle 1: Trabekuläre Knochenparameter, geschätzt durch Mikro-CT.
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Discussion
Osteoporose kann zu häufigen Frakturen führen, die kostspielig sind, Schmerzen, Behinderungen oder sogar den Tod verursachen und die Lebensqualität der Patienten ernsthaft beeinträchtigenkönnen 20. Im Laufe der Jahre hat sich das Modell der Ovariektomie als eine der Standardmethoden zur Untersuchung von Osteoporose21 durchgesetzt. Das häufigste präklinische Tiermodell für Osteoporose ist die ovariektomierte (OVX) Ratte. Trotzdem wurde der Großteil der Forschung zu den Mechanismen von Knochenerkrankungen, einschließlich Osteoporose, an Mäusen durchgeführt22. Um ein Osteoporose-Modell bei erwachsenen weiblichen C57/BL6J-Mäusen zu etablieren, wird die Ovariektomie im Alter von 12 Wochen durchgeführt, was der optimale Zeitpunkt für dieses Verfahren ist. Mäuse sind im Alter von 8-12 Wochen reif und fruchtbar, und die Ovariektomie hat zu diesem Zeitpunkt einen signifikanten Einfluss auf ihre Knochenmasse10. Frühere Studien zeigen, dass die Knochen von Mäusen vor 12 Wochen schnell wachsen und die Indikatoren für Knochenmorphologie, BMD und Knochenbiomechanik schnell ansteigen. Die Gesamt-BMD und die kortikale Knochen-BMD korrelieren signifikant mit dem Alter der Mäuse. Nach 12 Wochen tritt der Knochenstoffwechsel von Mäusen jedoch in eine stabile Phase ein, und die oben genannten Indikatoren sind tendenziell stabil23,24.
Die Knochenmikroarchitektur wurde als primärer Einflussfaktor auf die Knochenfragilität vorgeschlagen, unabhängig von der BMD. Die Knochenbrüchigkeit der Osteoporose lässt sich nicht vollständig durch ein Defizit an Knochenmasse erklären. Die Knochendichte kann nur 60%-70% der Knochenstärke erklären25. In Bezug auf die strukturelle Zusammensetzung macht der kortikale Knochen 80 % der Knochenmasse aus, während der spongiöse Knochen nach dem Verlust von 50 % der Knochenmasse nur 10 % der Messungen aufweist, was darauf hindeutet, dass Knochenmassemessungen allein nicht ausreichen, um den Verlust der Knochenmasse zu beurteilen. Neben dem Knochenvolumen sind strukturelle Veränderungen der Knochentrabekel entscheidend für die Knochenfestigkeit. Cancellous bone enthält hämatopoetisches Knochenmarkgewebe oder Fettgewebe. Seine Oberfläche ist ziemlich groß, etwa achtmal größer als die des kortikalen Knochens. Diese große Oberfläche, die mit dem Knochenmark verbunden ist, ermöglicht es dem spongiösen Knochen, eine relativ hohe Knochenumwandlungsrate zu haben. Aus diesem Grund haben wir die Mikrostruktur der Knochentrabekel als Hauptindikator für die Beobachtung osteoporotischer Veränderungen gewählt. Das trabekuläre Knochengewebe im Skelett wird während des Wachstums ständig umgebaut, wobei neu gebildete Knochentrabekel die vorhandenen ersetzen und sekundären schwammigen Knochen bilden. Daher konzentriert sich die morphometrische Analyse des trabekulären Knochens unter normalen Bedingungen hauptsächlich auf den sekundären schwammigen Knochenbereich. Primäres schwammiges Knochengewebe hingegen ist eine angeborene und relativ stabile Struktur, die nicht umgebaut wird und daher von der Analyse ausgeschlossen werden muss. Im Allgemeinen kann der Knochen innerhalb eines bestimmten Abstands von der Wachstumsfuge als aktiv umbauendes Gewebe betrachtet werden. Daher haben wir für die Analyse eine Region of Interest (ROI) ausgewählt, die bei 540 μm oberhalb der Wachstumsfuge beginnt und 1600 μm in proximaler Richtung überspannt. Nach unseren Erkenntnissen weisen Mäuse nach einer Ovariektomie sehr unterschiedliche mikrostrukturelle Merkmale in trabekulären Regionen auf.
Die in dieser Studie verwendete Mikro-CT-Technologie ist ein zerstörungsfreies 3D-Bildgebungsverfahren, das in den letzten Jahrzehnten entwickelt wurde und nach und nach auf die pharmakologische Untersuchung von ethnomedizinischen Kräutern angewendet wird. Es bietet ein klares Verständnis der inneren Mikrostruktur der Probe, ohne sie zu zerstören. Was die histopathologische Untersuchung betrifft, so schädigt die Harzeinbettungsmethode die Enzymaktivität und die Proteinantigenität und kann nicht zuverlässig für die Histochemie oder Immunhistochemie verwendet werden26. Die traditionelle Paraffineinbettung kann mit Techniken wie Immunhistochemie (IHC), Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und konfokalem Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) kombiniert werden, um Substanzen mit geringer Häufigkeit im Knochengewebe auf molekularer Ebene quantitativ zu detektieren und so ein tieferes Verständnis der Mechanismen und der Regulation des Knochenstoffwechsels zu erlangen. Der Panorama-Objektträgerscanner kann Objektträger schnell in hochauflösende digitale Bilder umwandeln, so dass es möglich ist, Knochenhistomorphologiedaten mithilfe von Computersoftware quantitativ zu analysieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination von Mikro-CT und Knochenhistomorphologie eine detailliertere und genauere Beurteilung der Knochenmikrostruktur ermöglichen kann.
Traditionell beschränkte sich die Beurteilung der Knochenqualität weitgehend auf die Dual-Energy-Röntgenabsorptiometrie (DXA), die Computertomographie mit begrenzter Auflösung oder die technisch anspruchsvolle Magnetresonanztomographie27. Obwohl die Kombination der beiden Techniken ihre einzigartigen Vorteile hat, hat sie auch ihre Grenzen. Erstens: Obwohl die Mikro-CT eine langfristige kontinuierliche Überwachung desselben Tieres ermöglicht, ist die In-vivo-Bildgebung von Skelettmikrostrukturen bei lebenden Kleintieren, insbesondere Mäusen, immer noch eine technische Herausforderung28. Zweitens erschwert das Fehlen eines strukturierten und international anerkannten Protokolls für die Erfassung und Analyse von Daten von verschiedenen Instrumenten oder Nutzern den Vergleich von Datensätzen und die Reproduktion von Forschungsergebnissen über Studien hinweg. Drittens ist aufgrund der Eigenschaften der Mikro-CT eine Exposition gegenüber ionisierender Strahlung unvermeidlich. Viertens: Obwohl unser einfaches und kostengünstiges Protokoll eine quantitative Analyse von HE-gefärbten Knochenbildern ermöglicht, basiert es hauptsächlich auf einer halbautomatischen Segmentierungsstrategie, die mühsamer ist als komplexe automatisierte Methoden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Anwendung dieser Technologie der Osteoporoseforschung in der Ethnomedizin während des Forschungsprozesses zweifellos einen großen Impuls verleihen wird.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Sichuan Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine (2021YJ0175) und dem Graduate Research Innovation Project der School of Clinical Medicine (LCYJSKT2023-11) der Chengdu University of Traditional Chinese Medicine unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
| Ammonia Solution | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anatomical Forceps | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J3C030 | |
| Anhydrous Ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Automatic Dyeing Machine | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
| Bone Microarchitecture Analysis Add-on | AnalyzeDirect, Inc | ||
| C57BL/6J mice | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Carrier Slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Coverslips | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Decalcification Solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Delicate Scissors | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | ZJA010 | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fiji: ImageJ | National Institutes of Health, USA | ||
| Film Sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| Freezing Table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| H&E Staining Kit | Leagene | DH0020 | |
| Hydrochloric Acid Solution | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| ImageJ2 Plugin | BoneJ 7.0.16 | ||
| Medical Gauze | Shandong Ang Yang Medical Technology Co. | ||
| Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures | Ethicon, Inc. | SA84G | |
| Needle Holder | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J32010 | |
| Neutral Balsam | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| PANNORAMIC Digital Slide Scanners | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Povidone-iodine solution 5% | Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Quantum GX2 microCT Imaging System | PerkinElmer, Inc. | ||
| Rotary Microtome | Thermo scientific | HM325 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Scan & Browse Software | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
| Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves | Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd | 22B141EO | |
| Sodium Chloride Solution 0.9% | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Sterile Hypodermic Syringes for Single Use | Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd | ||
| Sterile Medical Suture Needles | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | PW8068 | |
| Tissue Processor | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Tissue Spreading and Baking Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Tribromoethanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M2920 | |
| Wax Trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
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