Summary
Bu protokol, Hematoksilen-Eozin (HE) boyama ve mikro-bilgisayarlı tomografi (Mikro-BT) tekniklerini birleştirerek osteoporozun fare modelinde kemik mikromimarisinin kantitatif değerlendirilmesi için ekonomik ve etkili bir yöntem sunar.
Abstract
Kemik mikro yapısı, kemik dokusunun mikroskobik düzeyde düzenlenmesini ve kalitesini ifade eder. İskeletin kemik mikro yapısını anlamak, osteoporozun patofizyolojisi hakkında bilgi edinmek ve tedavisini geliştirmek için çok önemlidir. Bununla birlikte, sert ve yoğun özellikleri nedeniyle kemik örneklerinin işlenmesi karmaşık olabilir. İkincisi, özel yazılımlar görüntü işlemeyi ve analizini zorlaştırır. Bu protokolde, trabeküler kemik mikroyapı analizi için uygun maliyetli ve kullanımı kolay bir çözüm sunuyoruz. Ayrıntılı adımlar ve önlemler verilmiştir. Mikro-BT, trabeküler kemik yapısının yüksek çözünürlüklü görüntülerini sağlayan tahribatsız üç boyutlu (3D) bir görüntüleme tekniğidir. Kemik kalitesinin objektif ve kantitatif değerlendirmesine izin verir, bu nedenle kemik kalitesi değerlendirmesi için altın standart yöntem olarak kabul edilir. Bununla birlikte, histomorfometri, kemik örneklerinin iki boyutlu (2D) ve 3D değerlendirmeleri arasındaki boşluğu dolduran önemli hücresel düzeyde parametreler sunduğu için vazgeçilmez olmaya devam etmektedir. Histolojik tekniklere gelince, kemik dokusunu dekalsifiye etmeyi ve ardından geleneksel parafin yerleştirmeyi seçtik. Özetle, bu iki yöntemin birleştirilmesi kemik mikroyapısı hakkında daha kapsamlı ve doğru bilgi sağlayabilir.
Introduction
Osteoporoz, özellikle yaşlılar arasında yaygın bir metabolik kemik hastalığıdır ve kırılganlık kırığı riskinin artmasıyla ilişkilidir. Osteoporoz Çin'dedaha yaygın hale geldikçe1, küçük hayvanların kemik yapılarını incelemek için artan bir talep olacaktır 2,3. Kemik kaybını ölçmenin önceki yöntemleri, iki boyutlu çift enerjili x-ışını absorpsiyometrisinin sonuçlarına dayanmaktadır. Bununla birlikte, bu, iskelet gücü için önemli bir faktör olan trabeküler kemiğin mimari mikro yapısındaki değişiklikleri yakalamaz4. Kemiğin mikro yapısı, mukavemetini, sertliğini ve kırılma direncini etkiler. Normal ve patolojik durumdaki kemik mikromimarisini karşılaştırarak, osteoporozun neden olduğu kemik dokusu morfolojisi, yapısı ve fonksiyonundaki değişiklikler tanımlanabilir. Bu bilgi, osteoporoz gelişiminin ve diğer hastalıklarla ilişkisinin anlaşılmasına katkıda bulunur.
Mikro bilgisayarlı tomografi (Mikro-BT) görüntüleme, kemik hacmi fraksiyonu, kalınlığı ve ayrılması gibi kemik yapısı ve yoğunluk parametreleri hakkında doğru ve kapsamlı veriler sağlayabildiği kemik morfolojisi değerlendirmesi için son zamanlarda popüler bir teknik haline gelmiştir 5,6. Aynı zamanda, Mikro-CT sonuçları analiz yazılımındanetkilenebilir 7. Çeşitli ticari Mikro-BT sistemleri tarafından farklı görüntü elde etme, değerlendirme ve raporlama yöntemleri kullanılmaktadır. Bu tutarsızlık, farklı çalışmalarla bildirilen sonuçların karşılaştırılmasını ve yorumlanmasını zorlaştırmaktadır5. Ayrıca, araştırmacılara iskelet sistemindeki hücresel düzeydeki parametreler hakkında bilgi sağlamada şu anda kemik histomorfometrisinin yerini alamaz8. Bu arada, histolojik teknikler, kemiğin mikroskobik morfolojisinin doğrudan gözlemlenmesine ve ölçülmesine izin verir. Hematoksilen ve eozin (HE) boyama, histolojide hücrelerin ve dokuların genel yapısını görselleştirmek için kullanılan yaygın bir boyama tekniğidir. Kemik dokusunun varlığını ve mikro mimarisini tanımlamak için kullanılır.
Bu makale, bir osteoporoz fare modelinde kemik mikroyapısındaki değişiklikleri değerlendirmek için kemik dokusu görüntülerini toplamak ve trabeküler kemiğin kantitatif analizini yapmak için doku dilimleme tekniği (Hematoksilen-Eozin [HE] boyama) ile birlikte Mikro-BT kullanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan protokolü, Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (Kayıt numarası: 2020-34). Dişi C57BL / 6J fareleri (12 haftalık, n = 14) rastgele iki gruba ayrıldı, sahte olarak çalıştırılan bir grup (Sham grubu, n = 7) ve bir model grubu (OVX grubu, n = 7). Hayvanlar ticari bir tedarikçiden satın alındı (bkz. Tüm fareler 22-26 °C'de %45-55 nem oranına sahip ayrı kafeslerde tutuldu, 1 hafta boyunca yeni ortamlarına uyum sağlamaları sağlandı, suya ve diyete serbest erişim sağlandı. Tüm hayvan deney çalışmaları Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi'nde yapıldı ve hayvanların acı çekmesini en aza indirmek için tüm çabalar gösterildi.
1. Hayvan modeli hazırlama
- 12 haftalık fareyi 0.02 mL / g'lık bir dozajda% 1.25 Avertin (tert-amil alkol içinde tribromoetanol, Malzeme Tablosuna bakınız) ile intraperitoneal enjeksiyonla uyuşturun. Fareyi steril bir cerrahi ameliyat masasına yüzüstü yatırın ve uzuvlarını güvenli bir şekilde bantlayarak hareketsiz hale getirin.
- Cerrahi operasyonu etkileyebilecek saçları kesmek için makas kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın).
NOT: Ameliyat bölgesi hazırlanırken cilt hasarından kaçınılması önerilir. - Ellerinizi iyice yıkayın ve cerrahi eldiven giyin. Farenin sırtını povidon-iyot ile üç kez dezenfekte edin (Malzeme Tablosuna bakın) ve kurutmak için tıbbi gazlı bez kullanın (Malzeme Tablosuna bakın).
NOT: Dikkatli olun; Dezenfeksiyon sırasında saçın çok ıslanması, farelerde ameliyat sonrası hipotermiye neden olabilir. - Bir neşter kullanarak farenin sırtının orta hattının üçte birinden 1 cm uzakta bulunan yaklaşık 0,5-1,0 cm uzunluğunda bir kesi yapın (bkz. Fasyayı nazikçe ayırın ve yumurtalık görünene kadar kas makasıyla (Malzeme Tablosuna bakınız) kesin. Çevredeki kan damarlarını emilmeyen dikişlerle bağlayın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve yumurtalığı çıkarın.
- % 0.9 salin solüsyonu kullanarak boşluğu durulayın, ardından cildi, kası ve fasyayı ayrı ayrı dikin (bkz.
- Diğer tarafta aynı adım sırasını tekrarlayın.
- Yumurtalık ile aynı büyüklükteki peri-yumurtalık yağını çıkarın ve sahte ameliyat modelini oluşturmak için kalan adımlar için yukarıda belirtilen aynı cerrahi prosedürü uygulayın.
- Ameliyattan sonra 1 haftalık bir iyileşme süresi tanıyın. 8 hafta sonra, osteoporotik fare modelleri başarıyla kurulacaktır 9,10.
2. Mikro-CT taraması
- Fareyi aşırı CO2 inhalasyonu ile ötenazi yapın. Ötenaziden sonra fare uyluk kemiğinden mümkün olduğunca fazla yumuşak doku çıkarın ve tarama için yeni bir örnek alın.
NOT: Numunenin korunması için mükemmel bir çözüm olmasa da, Mikro-CT tarama sonuçlarının kalitesini en üst düzeye çıkarmak için belirli adımlar atılabilir. Fiksasyondan önce, mümkün olduğunca fazla çevre dokusunu çıkarmaya özen gösterin. Formalin veya tamponlu formalin, PBS11,12'de depolama ile en çok tercih edilen fiksasyon yöntemidir. - Sistemi başlatmak için masaüstündeki mikro-CT görüntüleme sistemi yazılımı simgesine çift tıklayın (bkz. 18 mm x 18 mm'lik örnek görüş alanı (FOV) ile uyumlu bir örnek yatak seçin. Uygun numune yatağını makineye yükleyin ve kapağı kapatın.
- Denetim Masası'ndaki Isınma düğmesine tıklayın.
NOT: Kısa bir ısınma süresi gerekliydi. X-ışınları üretilirken kapağı açmaya çalışmayın. X-ışınlarının üretilip üretilmediğini doğrulamak için ön paneldeki ve bilgisayar monitöründeki X-Ray Açık ışığını kontrol edin. - Yeni bir veritabanı ayarlamak için Menü düğmesine tıklayın, ardından yeni bir örnek oluşturun ve çalışın.
- Menü açılır listesinden Manuel'i seçin ve Denetim Masası'na özel voltaj ve akım değerleri girin. Voltajı (kV) 90'a, Akımı (μA) 80'e, Tarama Modu'nu Yüksek çözünürlük, 14 dk'ya ve FOV'u (mm) 18 mm x 18 mm'ye ayarlayın.
NOT: Uygun parametreleri ayarlamak için farklı mikro BT sistemlerinin kılavuzuna bakın. - Kemiği numune yatağına plastik film ile güvenli bir şekilde yerleştirin. Kapağı kapatın. Makinedeki ayar düğmelerine basarak konunun X-yakalama penceresinde tam olarak ortalandığından emin olun.
NOT: Yanlışlıkla makineye düşmesini önlemek için numunenin ayarlanması yavaş ve nazik olmalıdır. - CT taramasını başlatmak için Başlat düğmesine tıklayın.
3. CT veri analizi
- Yazılıma girin (Malzeme Tablosuna bakın) ve analiz edilecek verileri seçin. Sub'a tıklayın ve Pixel Size'ı 10 μm olarak ayarlayın. İlgilenilen bölgeyi (ROI) büyüme plakasının üzerindeki distal femuru içerecek şekilde hareket ettirin ve yeniden boyutlandırın. Başlat'a tıklayın (bkz. Şekil 1).
NOT: Önceki çalışmalardan elde edilen histolojik verilere dayanarak görüntüleme trabeküllerinin kalınlığının yaklaşık 20-30 μm olduğu tahmin edildiğinden, alt hacim rekonstrüksiyon piksel boyutu 10 μm olarak seçilmiştir13. Sinyal-gürültü oranı veri işleme için yetersizse, yüksek çözünürlüklü 1 saatlik bir tarama gerçekleştirilmelidir. - Ortaya çıkan 3B rekonstrüksiyonu almak için Analiz 3B düğmesini tıklayın.
- Verileri analiz için mikro-CT sisteminden bilgisayara aktarın.
- Yeniden yapılandırılmış CT verilerini içe aktarın. Görüntü Hesaplayıcı> İşlem'i tıklayın, sonra Bölge Paneli'ni > Etkileşimli'yi tıklayın. Sarı onay kutusunu uygun ROI'ye ayarlayın.
NOT: İlgilenilen bölge (ROI), büyüme plağının proksimalinden yaklaşık 540 μm başlar ve gerçek kemik metabolizmasını ve yeniden şekillenmesini değerlendirmek için proksimal olarak 1600 μm uzanır. - Kemik Mikromimarisi Analizi (BMA) eklentisini seçin (bkz. Segment Cortex'e ve ardından Segment Trabeculae'ye tıklayın.
NOT: Hem trabeküler hem de kortikal kemik otomatik olarak seçilir. Normalde manuel ayar gerekmez. - Son Nesne Haritasını Kaydet'e tıklayın ve ardından kemik morfometrik indekslerini hesaplamak için Kemiği Ölç'e tıklayın.
NOT: Burada sadece rölatif kemik mineral yoğunluğu (KMY) hesaplandı, çünkü herhangi bir kontrol eklenmedi.
4. Kemik dokusunun dekalsifikasyonu
- Kemik örneklerini 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Numuneleri her seferinde 20 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın ( Malzeme Tablosuna bakın).
- Dokuyu her seferinde 20 dakika boyunca damıtılmış suyla üç kez durulayın. Dokuyu EDTA içeren bir dekalsifikasyon solüsyonuna aktarın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve son noktaya kadar haftalık solüsyon değişikliği ile 30 gün boyunca kireçten arındırın.
NOT: İğne batırma, el kıstırma ve klempleme, kemik dokusu yumuşadığında veya iğneleme sırasında direnç hissi olmadığında dekalsifikasyonu sonlandırmak için kullanılır. Fiziksel tespit yöntemi doku yapısında bir miktar hasara neden olabilir, bu nedenle aşırı kuvvet veya tekrarlanan testlerden kaçınmaya çalışın. - Dokuyu fiksatiften çıkarın ve dokuyu çeker ocakta kesmek için bir neşter kullanın. Kesilen dokuyu ve ilgili etiketi bir dehidrasyon kutusuna koyun.
- Dehidrasyon kutusunu bir sepete koyun ve gradyan alkol (4 saat boyunca %75 etanol, 2 saat boyunca %85 etanol, 2 saat boyunca %90 etanol, 1 saat boyunca %95 etanol, 30 dakika boyunca susuz etanol, 30 dakika susuz etanol II, 5-10 dakika ksilen I, 5-10 dakika ksilen II, 1 saat balmumu I, 1 saat balmumu II, 1 saat balmumu III).
- Balmumu ile ıslatılmış dokuyu gömmek için bir gömme makinesi ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanın. Erimiş balmumu bir gömme kutusuna dökün ve balmumu sertleşmeden önce dokuyu dehidrasyon kutusundan yerleştirin.
- Dokuyu gömme yüzeyine göre yönlendirin ve ilgili etiketi yapıştırın. -20 °C'lik bir dondurma masasında soğutun (bkz. Katılaştıktan sonra balmumu bloğunu gömme kutusundan çıkarın ve balmumu bloğunu gerektiği gibi düzeltin (bkz.
- Kesilmiş balmumu bloğunu bir mikrotom üzerinde 3 μm kalınlığında slaytlar halinde kesin (bkz. Slaytları 40 °C ılık suda bir doku yayma makinesinde (Malzeme Tablosuna bakın) yüzdürerek dokuyu düzleştirin ve bir slaytla toplayın.
- 60 °C fırında ( Malzeme Tablosuna bakın) su buharlaşana ve balmumu eriyene kadar pişirin. Daha sonra kullanmak üzere çıkarın ve oda sıcaklığında (RT) saklayın.
5. HE boyama
- Slaytları 20 dakika ksilen I'e, ardından 20 dakika ksilen II'ye koyun. Ayrıca, slaytları her biri 5 dakika susuz etanol I ve susuz etanol II'ye, 5 dakika boyunca %75 alkole koyun ve ardından slaytları musluk suyuyla yıkayın (bkz.
- Hematoksilen içinde 3-5 dakika inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakınız). Numuneleri bir hidroklorik asit çözeltisi ile ayırt edin (Malzeme Tablosuna bakınız). Slaytlara mavileşme için bir amonyak çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) uygulayın ve ardından slaytları suyla yıkayın.
- Slaytları dehidrasyon için %85, %95 gradyan alkole koyun ve 5 dakika boyunca eozin solüsyonu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile boyayın.
- Slaytları 5 dakika susuz etanol I, 5 dakika susuz etanol II ve 5 dakika susuz etanol III içine koyun. Slaytlara 5 dakika ksilen I, 5 dakika ksilen II uygulayın ve nötr balsam ile monte edin (Malzeme Tablosuna bakın).
- Her slaydı mikroskop altında inceleyin. Ardından, panoramik tarama için temsili dilimleri seçin (bkz.
NOT: Her numune için en az üç ardışık dilim gereklidir. Panoramik taramadan önce, dilimlerin tam ve net olduklarından emin olmak için mikroskop altında incelenmesi gerekir. Kemik iliği boşluğunun, kortikal kemiğin ve süngerimsi kemiğin tam olarak görüntülendiğinden ve farklı kemik hücrelerinin görülebildiğinden emin olun.
6. HE görüntü analizi
- HE görüntülerini CaseViewer yazılımıyla açın (bkz. Slaytta ilgilendiğiniz bölgeyi (ROI) seçin ve renkli görüntü olarak kaydedin.
NOT: ROI seçimi, yukarıda belirtilen yazılımla tutarlıdır. - Görüntüyü ImageJ'de açın (Malzeme Tablosu'na bakın). Araç çubuğundan Değnek aracını seçin. Trabeküler kemiğe tıklayın.
- Tolerans ve bitişik ayarları gerektiği gibi ayarlayın. Görüntü > Ayarlamaları > Siyah Beyaz'a gidin ve Tamam'a tıklayın. Kemiğin diğer bölgeleri için adımları tekrarlayın.
- Seçimi ters çevirin ve beyaz renkle doldurun. Görüntüyü analiz için maske olarak kaydedin (bkz. Şekil 2).
NOT: Ayrıntılı metodoloji için daha önce yayınlanmış çalışmayabakın 14. - Maskeyi analiz yazılımında15,16 açın (bkz. Malzeme Tablosu). Renkli görüntüyü ikili görüntüye dönüştürmek için İkili Yap >> İkili İşlemi Çalıştır'ı çalıştırın.
- Yapısal parametreleri analiz etmek için yazılımdaki eklenti17'yi (Malzeme Tablosuna bakın) kullanın: Kemik hacmini toplam kemik hacmine (BV/TV [%])18,19 hesaplamak için Alan/Hacim Fraksiyonunu çalıştırın.
NOT: Bu yöntem, kemik trabekülleri ve kemik iliği için geçerlidir ve HE görüntülerindeki tüm ROI'yi doldurur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikro-BT analizi
Her iki gruptan farelerde trabeküler mikromimari parametreleri ölçtük ve ortalama değerlerini ve SD'lerini Tablo 1'de bildirdik. Bazı parametrelerin (yani kemik hacminin toplam doku hacmine oranı, trabeküler kalınlık, trabeküler ayrım) her grup içindeki dağılımı Şekil 3'te gösterilmiştir.
Bu sonuçlar, Micro-CT'den tahmin edilen bir dizi parametre için OVX ve Sham grubu fareler arasında önemli farklılıklar olduğunu göstermektedir. Yani, OVX grubundaki kemik hacminin toplam doku hacmine (BV/TV) oranı, Sham grubundakinden %3 daha düşüktü. OVX farelerinde trabeküler kalınlık, Sham grubundakilerden daha düşüktü ve nispi fark yüzdesi% 39.3'tü. OVX farelerinde trabeküler ayrılma, Sham farelerindekinden daha büyüktü. Şekil 4 , her grup için yeniden yapılandırılmış kemik hacminden çıkarılan Trabeküler ROI'lerin 3D görüntülerini göstermektedir. Sham grubu (Şekil 4A) ile karşılaştırıldığında, ovariektomi sonrası farelerin kemik yoğunluğu, trabeküller seyrekti ve osteoporoz gösterdi (Şekil 4B).
HE boyama analizi
Ek olarak, histopatolojik analiz, Mikro-BT analizinde bulunan değişiklikleri doğruladı. 8 hafta sonra, HE boyama, OVX'ten sonra farelerin distal femurunun büyüme plakasının altındaki trabeküler kemiğin (kırmızı) Sham grubuna kıyasla azaldığını ve neredeyse hiç belirgin kalın trabeküler yapı olmadığını ve çok sayıda yağ benzeri granülün ortaya çıktığını gösterdi (Şekil 5A). Doku kesitlerinin kantitatif analizine dayanarak, OVX fareleri Sham faresinden daha az trabeküler kemik alanına sahipti (Şekil 5B).
Şekil 1: Alt birim rekonstrüksiyonu arayüzünün ekran görüntüsü. 5,12 mm x 5,12 mm görüş alanında (FOV) 10 μm'ye kadar inmek için yeşil dikdörtgen içinde bir alt hacim rekonstrüksiyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Siyah beyaz görüntü maskesi yapısı. (A1-A3): Sham grubundan HE Görüntüler (Ölçek çubuğu = 200 μm). Kemik trabekülleri seçilen bölge içinde siyah, diğer dokular beyaz olarak gösterilir. (B1-B3) OVX grubunun görüntüleri (Ölçek çubuğu = 200 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Distal femoral trabeküllerin mikroyapısal parametrelerinin OVX ve Sham grupları arasında karşılaştırılması . (A) OVX grubundaki kemik hacminin toplam doku hacmine oranı (BV / TV [%]) Sham grubundakinden daha düşüktü. (B) OVX farelerinde trabeküler kalınlık (TB.Th [μm]) Sham grubundan daha düşüktü. (C) OVX farelerinde trabeküler ayrılma (TB.sp [μm]) Sham farelerinden daha büyüktü. *P < 0,05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Distal femurdaki trabeküler kemiğin temsili Mikro-BT görüntüleri. (A) Sham grubu ile karşılaştırıldığında, ovariektomi (B) sonrası farelerin kemik yoğunluğu seyrek trabeküller gösterdi ve osteoporoz gösterdi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: OVX ve Sham gruplarının distal femurundaki trabeküler kemik alanının histolojik analizi. (A) Her grupta distal femurun temsili HE boyalı görüntüleri (Ölçek çubuğu = 500 μm). Siyah oklar trabekülleri gösterir. (B) Seçilen ROI'deki toplam doku hacminin trabeküler kemik alanının kantitatif analizi. *P < 0,05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Parametre | Şam tarafından işletilen grup (SHAM) (n = 5). |
Ovariektomi grubu (OVX) (n = 5). |
P Değeri |
| Kemik hacmi-toplam doku hacmi oranı (%) | 7.3 ± 0.9 | 4.2 ± 0.5 | 0.012* |
| Trabeküler kalınlık (μm) | 79,5 ± 5,5 | 53.4 ± 6.0 | 0.013* |
| Trabeküler ayırma (μm) | 212.5 ± 8.7 | 249.4 ± 8.3 | 0.015* |
| Değerler SD'± ortalamasıdır. * Önemli ölçüde farklı (P<0 .05). |
|||
Tablo 1: Mikro-BT'den tahmin edilen trabeküler kemik parametreleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Osteoporoz, maliyetli olan, ağrıya, sakatlığa ve hatta ölüme neden olabilen ve hastaların yaşam kalitesini ciddi şekilde etkileyebilen sık kırıklara yol açabilir20. Yıllar geçtikçe, ovariektomi modeli osteoporozu incelemek için standart yöntemlerden biri olarak kabul edilmiştir21. Osteoporoz için en yaygın preklinik hayvan modeli yumurtalıklı (OVX) sıçandır. Buna rağmen, osteoporoz da dahil olmak üzere kemik bozukluklarının mekanizmalarına ilişkin araştırmaların çoğu fareler22 kullanılarak yapılmıştır. Yetişkin dişi C57 / BL6J farelerinde bir osteoporoz modeli oluşturmak için, bu prosedür için en uygun zaman olan 12 haftalıkken ovariektomi yapılır. Fareler 8-12 haftalıktan itibaren olgun ve doğurgandır ve ovariektomi şu anda kemik kütleleri üzerinde önemli bir etkiye sahiptir10. Önceki çalışmalar, 12 haftadan önce farelerin kemiklerinin hızla büyüdüğünü ve kemik morfolojisi, KMY ve kemik biyomekaniği göstergelerinin hızla arttığını göstermektedir. Toplam KMY ve kortikal kemik KMY'si farelerin yaşı ile önemli ölçüde ilişkilidir. Bununla birlikte, 12 hafta sonra, farelerin kemik metabolizması stabil bir döneme girer ve yukarıdaki göstergeler stabil olma eğilimindedir23,24.
Kemik mikromimarisi, KMY'den bağımsız olarak kemik kırılganlığını etkileyen birincil faktör olarak önerilmiştir. Osteoporozun kemik kırılganlığı, kemik kütlesindeki bir eksiklik ile tam olarak açıklanamaz. KMY, kemik gücünün sadece %60-70'ini açıklayabilir25. Yapısal bileşim açısından, kortikal kemik kemik kütlesinin %80'ini oluştururken, süngerimsi kemik, kemik kütlesinin %50'sini kaybettikten sonra ölçümlerin sadece %10'unu sergiler, bu da kemik kütlesi ölçümlerinin tek başına kemik kütlesi kaybını değerlendirmek için yeterli olmadığını düşündürür. Kemik hacmine ek olarak, kemik trabeküllerindeki yapısal değişiklikler kemik gücü için kritik öneme sahiptir. Kansellöz kemik, hematopoetik kemik iliği dokusu veya yağ dokusu içerir. Yüzeyi oldukça büyüktür, kortikal kemiğinkinden yaklaşık sekiz kat daha büyüktür. Kemik iliğine bağlı bu geniş yüzey alanı, süngerimsi kemiğin oldukça yüksek bir kemik dönüşüm oranına sahip olmasını sağlar. Bu nedenle osteoporotik değişiklikleri gözlemlemek için ana gösterge olarak kemik trabeküllerinin mikro yapısını seçtik. İskeletteki trabeküler kemik dokusu, büyüme sırasında sürekli olarak yeniden şekillenir, bu sırada yeni oluşan kemik trabekülleri mevcut olanların yerini alır ve ikincil süngerimsi kemik oluşturur. Bu nedenle, normal koşullarda, trabeküler kemiğin morfometrik analizi esas olarak ikincil süngerimsi kemik alanına odaklanır. Primer süngerimsi kemik dokusu ise doğuştan mevcut ve nispeten stabil bir yapıdır ve yeniden şekillenmemiştir ve bu nedenle analizden çıkarılması gerekir. Genel olarak, büyüme plağından belirli bir mesafedeki kemik, dokuyu aktif olarak yeniden şekillendiren olarak düşünülebilir. Bu nedenle, analiz için büyüme plakasının 540 μm yukarısından başlayan ve proksimal yönde 1600 μm'ye yayılan bir ilgi alanı (ROI) seçtik. Bulgularımıza göre, fareler ovariektomi sonrası trabeküler bölgelerde çok farklı mikroyapısal özellikler sergilemektedir.
Bu çalışmada kullanılan Mikro-BT teknolojisi, son yıllarda geliştirilen tahribatsız bir 3D görüntüleme tekniğidir ve yavaş yavaş etnomedicinal bitkilerin farmakolojik çalışmasına uygulanmaktadır. Numunenin iç mikro yapısının tahrip edilmeden net bir şekilde anlaşılmasını sağlar. Histopatolojik incelemeye gelince, reçine gömme yöntemi enzim aktivitesine ve protein antijenisitesine zarar verir ve histokimya veya immünohistokimya için güvenilir bir şekilde kullanılamaz26. Geleneksel parafin gömme, immünohistokimya (IHC), floresan in situ Hibridizasyon (FISH) ve konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) gibi tekniklerle birleştirilerek kemik dokusundaki düşük bolluktaki maddeleri moleküler düzeyde kantitatif olarak tespit edebilir, böylece kemik metabolizmasının mekanizmaları ve düzenlenmesi hakkında daha derin bir anlayış kazanır. Panoramik slayt tarayıcı, slaytları hızlı bir şekilde yüksek çözünürlüklü dijital görüntülere dönüştürebilir ve bu da bilgisayar yazılımı kullanarak kemik histomorfolojisi verilerini nicel olarak analiz etmeyi mümkün kılar. Özetle, Mikro-BT ve kemik histomorfolojisinin kombinasyonu, kemik mikroyapısının daha ayrıntılı ve doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlayabilir.
Geleneksel olarak, kemik kalitesinin değerlendirilmesi büyük ölçüde çift enerjili X-ışını absorbsiyometrisi (DXA), sınırlı çözünürlüklü bilgisayarlı tomografi veya teknik olarak zorlu manyetik rezonans görüntüleme ile sınırlıydı27. İki tekniğin kombinasyonunun kendine özgü avantajları olmasına rağmen, sınırlamaları da vardır. Birincisi, Mikro-BT aynı hayvanın uzun süreli sürekli izlenmesine izin verse de, canlı küçük hayvanlarda, özellikle farelerde iskelet mikro yapılarının in vivo görüntülenmesi hala teknik olarak zordur28. İkincisi, farklı araçlardan veya kullanıcılardan veri elde etmek ve analiz etmek için yapılandırılmış ve uluslararası kabul görmüş bir protokolün olmaması, veri kümelerini karşılaştırmayı ve çalışmalar arasında araştırma sonuçlarını yeniden üretmeyi zorlaştırmaktadır. Üçüncüsü, Mikro-BT'nin özellikleri nedeniyle iyonlaştırıcı radyasyona maruz kalma kaçınılmazdır. Dördüncüsü, basit ve ekonomik protokolümüz HE ile boyanmış kemik görüntülerinin kantitatif analizini sağlayabilse de, esas olarak karmaşık otomatik yöntemlerden daha zahmetli olan yarı otomatik bir segmentasyon stratejisine dayanmaktadır.
Sonuç olarak, bu teknolojinin uygulanması, keşif sürecinde etnotıpta osteoporoz araştırmalarına şüphesiz büyük bir ivme kazandıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Sichuan İl Geleneksel Çin Tıbbı İdaresi (2021YJ0175) ve Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Klinik Tıp Okulu (LCYJSKT2023-11) Lisansüstü Araştırma İnovasyon Projesi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
| Ammonia Solution | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anatomical Forceps | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J3C030 | |
| Anhydrous Ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Automatic Dyeing Machine | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
| Bone Microarchitecture Analysis Add-on | AnalyzeDirect, Inc | ||
| C57BL/6J mice | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Carrier Slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Coverslips | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Decalcification Solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Delicate Scissors | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | ZJA010 | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fiji: ImageJ | National Institutes of Health, USA | ||
| Film Sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| Freezing Table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| H&E Staining Kit | Leagene | DH0020 | |
| Hydrochloric Acid Solution | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| ImageJ2 Plugin | BoneJ 7.0.16 | ||
| Medical Gauze | Shandong Ang Yang Medical Technology Co. | ||
| Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures | Ethicon, Inc. | SA84G | |
| Needle Holder | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J32010 | |
| Neutral Balsam | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| PANNORAMIC Digital Slide Scanners | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Povidone-iodine solution 5% | Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Quantum GX2 microCT Imaging System | PerkinElmer, Inc. | ||
| Rotary Microtome | Thermo scientific | HM325 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Scan & Browse Software | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
| Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves | Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd | 22B141EO | |
| Sodium Chloride Solution 0.9% | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Sterile Hypodermic Syringes for Single Use | Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd | ||
| Sterile Medical Suture Needles | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | PW8068 | |
| Tissue Processor | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Tissue Spreading and Baking Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Tribromoethanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M2920 | |
| Wax Trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Wang, J., et al. The prevalence of osteoporosis in China, a community based cohort study of osteoporosis. Frontiers in Public Health. 11, 1084005 (2023).
- Stein, M., et al. Why animal experiments are still indispensable in bone research: A statement by the European Calcified Tissue Society. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (8), 1045-1061 (2023).
- Kerschan-Schindl, K., Papageorgiou, M., Föger-Samwald, U., Butylina, M., Weber, M., Pietschmann, P. Assessment of bone microstructure by micro CT in C57BL/6J mice for sex-specific differentiation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 14585 (2022).
- Fonseca, H., Moreira-Gonçalves, D., Coriolano, H. J. A., Duarte, J. A. Bone quality: the determinants of bone strength and fragility. Sports Medicine. 44, 37-53 (2014).
- Bouxsein, M. L., Boyd, S. K., Christiansen, B. A., Guldberg, R. E., Jepsen, K. J., Müller, R. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Akhter, M. P., Recker, R. R. High resolution imaging in bone tissue research-review. Bone. 143, 115620 (2021).
- Mys, K., et al. Quantification of 3D microstructural parameters of trabecular bone is affected by the analysis software. Bone. 142, 115653 (2021).
- Chavassieux, P., Chapurlat, R. Interest of bone histomorphometry in bone pathophysiology investigation: Foundation, present, and future. Frontiers in Endocrinology. 13, 907914 (2022).
- Komori, T.
- Zhu, S., et al. Ovariectomy-induced bone loss in TNFα and IL6 gene knockout mice is regulated by different mechanisms. Journal of Molecular Endocrinology. 60 (3), 185-198 (2018).
- Baum, T., et al. Osteoporosis imaging: effects of bone preservation on MDCT-based trabecular bone microstructure parameters and finite element models. BMC Medical Imaging. 15, 22 (2015).
- Nazarian, A., Hermannsson, B. J., Muller, J., Zurakowski, D., Snyder, B. D. Effects of tissue preservation on murine bone mechanical properties. Journal of Biomechanics. 42 (1), 82-86 (2009).
- Martín-Badosa, E., Amblard, D., Nuzzo, S., Elmoutaouakkil, A., Vico, L., Peyrin, F. Excised bone structures in mice: imaging at three-dimensional synchrotron radiation micro CT. Radiology. 229 (3), 921-928 (2003).
- Egan, K. P., Brennan, T. A., Pignolo, R. J. Bone histomorphometry using free and commonly available software. Histopathology. 61 (6), 1168-1173 (2012).
- Brandi, M. L. Microarchitecture, the key to bone quality. Rheumatology. 48 (suppl_4), iv3-iv8 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Domander, R., Felder, A. A., Doube, M.
- Parfitt, A. M., et al. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units: report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. Journal of Bone and Mineral Research. 2 (6), 595-610 (1987).
- Kazama, J. J., Koda, R., Yamamoto, S., Narita, I., Gejyo, F., Tokumoto, A. Cancellous bone volume is an indicator for trabecular bone connectivity in dialysis patients. Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 5 (2), 292-298 (2010).
- Watts, N. B. Postmenopausal osteoporosis: A clinical review. Journal of Women's Health. 27 (9), 1093-1096 (2018).
- Thompson, D. D., Simmons, H. A., Pirie, C. M., Ke, H. Z. FDA Guidelines and animal models for osteoporosis. Bone. 17 (4), S125-S133 (1995).
- Iwaniec, U. T., Yuan, D., Power, R. A., Wronski, T. J. Strain-dependent variations in the response of cancellous bone to ovariectomy in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (7), 1068-1074 (2006).
- Ferguson, V. L., Ayers, R. A., Bateman, T. A., Simske, S. J. Bone development and age-related bone loss in male C57BL/6J mice. Bone. 33 (3), 387-398 (2003).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (8), 1197-1207 (2007).
- Seeman, E. The structural and biomechanical basis of the gain and loss of bone strength in women and men. Endocrinology and Metabolism Clinics. 32 (1), 25-38 (2003).
- Ticha, P., et al. A novel cryo-embedding method for in-depth analysis of craniofacial mini pig bone specimens. Scientific Reports. 10 (1), 19510 (2020).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology. 47 (suppl_4), iv9-iv16 (2008).
- Zaw Thin, M., Moore, C., Snoeks, T., Kalber, T., Downward, J., Behrens, A. Micro-CT acquisition and image processing to track and characterize pulmonary nodules in mice. Nature Protocols. 18 (3), 990-1015 (2023).
