Summary
이 프로토콜은 Hematoxylin-Eosin(HE) 염색과 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(Micro-CT) 기술을 결합하여 골다공증 마우스 모델에서 뼈 미세구조의 정량적 평가를 위한 경제적이고 효율적인 방법을 제시합니다.
Abstract
뼈 미세구조는 미세한 수준에서 뼈 조직의 배열과 품질을 말합니다. 골격의 뼈 미세구조를 이해하는 것은 골다공증의 병태생리학에 대한 통찰력을 얻고 치료를 개선하는 데 매우 중요합니다. 그러나 뼈 샘플을 다루는 것은 단단하고 조밀한 특성으로 인해 복잡할 수 있습니다. 둘째, 전문 소프트웨어는 이미지 처리 및 분석을 어렵게 만듭니다. 이 프로토콜에서는 섬유주 뼈 미세구조 분석을 위한 비용 효율적이고 사용하기 쉬운 솔루션을 제시합니다. 자세한 단계와 주의 사항이 제공됩니다. Micro-CT는 섬유주 뼈 구조의 고해상도 이미지를 제공하는 비파괴 3차원(3D) 이미징 기술입니다. 이를 통해 뼈의 질을 객관적이고 정량적으로 평가할 수 있으며, 이것이 뼈의 질 평가를 위한 황금 표준 방법으로 널리 간주되는 이유입니다. 그러나 조직형태측정법은 중요한 세포 수준 매개변수를 제공하여 뼈 표본의 2차원(2D)과 3D 평가 사이의 격차를 해소하기 때문에 여전히 필수 불가결합니다. 조직학적 기법의 경우, 뼈 조직을 석회질을 제거한 다음 전통적인 파라핀 삽입을 수행하기로 결정했습니다. 요약하면, 이 두 가지 방법을 결합하면 뼈 미세구조에 대한 보다 포괄적이고 정확한 정보를 제공할 수 있습니다.
Introduction
골다공증은 특히 노인에게 흔한 대사성 뼈 질환이며 취약성 골절의 위험 증가와 관련이 있습니다. 중국에서 골다공증이 더 흔해짐에 따라1 작은 동물의 뼈 구조를 연구하는 수요가 증가할 것이다 2,3. 뼈 손실을 측정하는 이전 방법은 2차원 이중 에너지 X선 흡수 측정법의 결과에 의존합니다. 그러나 이것은 골격 강도의 핵심 요소인 섬유주 뼈의 구조적 미세구조 변화를 포착하지 못한다4. 뼈의 미세 구조는 강도, 강성 및 파괴 저항에 영향을 미칩니다. 정상 상태와 병리학적 상태의 뼈 미세구조를 비교하여 골다공증으로 인한 뼈 조직의 형태, 구조, 기능의 변화를 확인할 수 있습니다. 이 정보는 골다공증의 발병 및 다른 질병과의 연관성을 이해하는 데 기여합니다.
마이크로 컴퓨터 단층 촬영(Micro-CT) 영상은 최근 골의 형태 평가에 널리 사용되는 기법이 되었으며, 골의 구조와 골밀도 매개변수(예: 골용적 분율, 두께, 분리)에 대한 정확하고 포괄적인 데이터를 제공할 수 있다 5,6. 동시에, Micro-CT 결과는 분석 소프트웨어(7)에 의해 영향을 받을 수 있다. 다양한 상용 Micro-CT 시스템에서는 다양한 이미지 획득, 평가 및 보고 방법을 사용합니다. 이러한 불일치로 인해 서로 다른 연구에서 보고된 결과를 비교하고 해석하기 어렵다5. 또한, 현재 골격계의 세포 수준 매개변수에 대한 정보를 연구자들에게 제공하는 뼈 조직형학을 대체할 수 없다8. 한편, 조직학적 기법을 통해 뼈의 미세한 형태를 직접 관찰하고 측정할 수 있습니다. 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색은 세포와 조직의 일반적인 구조를 시각화하기 위해 조직학에서 사용되는 일반적인 염색 기법입니다. 뼈 조직과 미세 구조의 존재를 식별하는 데 사용됩니다.
이 논문에서는 조직 슬라이싱 기술(Hematoxylin-Eosin [HE] 염색)과 결합된 Micro-CT를 사용하여 뼈 조직 이미지를 수집하고 섬유주 뼈의 정량 분석을 수행하여 골다공증 마우스 모델에서 뼈 미세 구조의 변화를 평가합니다.
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Protocol
동물 프로토콜은 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine의 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다(기록 번호: 2020-34). 암컷 C57BL/6J 마우스(생후 12주령, n=14)를 무작위로 두 그룹, 즉 가짜 조작 그룹(Sham 그룹, n=7)과 모델 그룹(OVX 그룹, n=7)으로 나누었다. 동물은 상업 공급자로부터 구입했습니다( 재료 표 참조). 모든 쥐는 습도 45%-55%의 22-26°C에서 개별 케이지에 보관하고 1주일 동안 새로운 환경에 적응하도록 하고 물과 식단을 자유롭게 이용할 수 있도록 했습니다. 모든 동물 실험 연구는 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine에서 수행되었으며 동물의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.
1. 동물 모델 준비
- 12주 된 마우스에 0.02mL/g의 용량으로 1.25% 아베르틴(tert-아밀 알코올의 트리브로모에탄올, 재료 표 참조)을 복강 내 주사하여 마취합니다. 엎드린 쥐를 멸균 수술대에 놓고 팔다리를 단단히 테이프로 고정합니다.
- 가위( 재료 표 참조)를 사용하여 외과 수술에 영향을 줄 수 있는 머리카락을 다듬습니다.
알림: 수술 부위를 준비하는 동안 피부 손상을 피하는 것이 좋습니다. - 손을 깨끗이 씻고 수술용 장갑을 착용하십시오. 포비돈 요오드로 쥐의 등을 세 번 소독하고(재료 표 참조) 의료용 거즈(재료 표 참조)를 사용하여 말립니다.
알림: 주의하십시오. 소독 중에 머리카락이 너무 젖으면 생쥐의 수술 후 저체온증이 발생할 수 있습니다. - 메스를 사용하여 쥐 등 정중선의 1/3에서 1cm 떨어진 곳에 약 0.5-1.0cm 길이로 절개합니다( 재료 표 참조). 근막을 부드럽게 분리하고 난소가 보일 때까지 조직 가위( 재료 표 참조)로 근육을 자릅니다. 비흡수성 봉합사로 주변 혈관을 결찰하고( 자료표 참조) 난소를 제거합니다.
- 0.9% 식염수를 사용하여 캐비티를 헹구고 피부, 근육 및 근막을 별도로 봉합합니다( 재료 표 참조).
- 반대쪽에서도 동일한 단계를 반복합니다.
- 난소와 같은 크기의 난소 주위 지방을 제거하고 나머지 단계에 대해 위에서 언급한 것과 동일한 수술 절차를 수행하여 가짜 수술 모델을 확립합니다.
- 수술 후 1주일의 회복 기간을 두십시오. 8주 후, 골다공증성 마우스 모델은 성공적으로 확립될 것이다 9,10.
2. Micro-CT 스캔
- 과도한CO2 흡입으로 쥐를 안락사시키십시오. 안락사 후 쥐 대퇴골에서 가능한 한 많은 연조직을 제거하고 스캔을 위해 신선한 샘플을 얻습니다.
참고: 샘플 보존을 위한 완벽한 솔루션은 없지만 Micro-CT 스캔 결과의 품질을 극대화하기 위해 특정 단계를 수행할 수 있습니다. 고정하기 전에 가능한 한 많은 주변 조직을 제거하도록 주의하십시오. 포르말린 또는 완충 포르말린은 PBS11,12에서 보관과 함께 고정하는 가장 바람직한 방법입니다. - 바탕 화면에서 micro-CT 이미징 시스템 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하여 시스템을 시작합니다( 재료 표 참조). 18mm x 18mm의 시야(FOV)와 호환되는 샘플 베드를 선택합니다. 적절한 샘플 베드를 기계에 넣고 해치를 닫습니다.
- 제어판에서 워밍업 버튼을 클릭합니다.
알림: 짧은 예열 시간이 필요했습니다. X-ray가 생성될 때 해치를 열려고 하지 마십시오. 전면 패널과 컴퓨터 모니터의 X-Ray On 표시등을 확인하여 X-ray 가 생성되고 있는지 확인합니다. - 메뉴 버튼을 클릭하여 새 데이터베이스를 설정한 다음 새 샘플과 스터디를 만듭니다.
- Menu(메뉴) 드롭다운 목록에서 Manual(수동)을 선택하고 Control Panel(제어판)에 사용자 정의 전압 및 전류 값을 입력합니다. 전압(kV)을 90으로, 전류(μA)를 80으로, 스캔 모드를 고해상도, 14분으로, FOV(mm)를 18mm x 18mm로 설정합니다.
알림: 적절한 매개변수를 설정하려면 다양한 마이크로 CT 시스템의 설명서를 참조하십시오. - 샘플 베드에 플라스틱 필름으로 뼈를 단단히 놓습니다. 해치를 닫습니다. 기기의 조정 버튼을 눌러 피사체가 X-capture 창의 중앙에 정확하게 오도록 합니다.
알림: 샘플 조정amp실수로 기계에 떨어지지 않도록 느리고 부드러워야 합니다. - 시작 버튼을 클릭하여 CT 스캔을 시작합니다.
3. CT 데이터 분석
- 소프트웨어( 재료 표 참조)를 입력하고 분석할 데이터를 선택합니다. Sub 를 클릭하고 Pixel Size 를 10μm로 설정합니다. 관심 영역(ROI)을 이동하고 크기를 조정하여 성장판 위의 대퇴골 원위부를 포함합니다. Start( 시작 )를 클릭합니다( 그림 1 참조).
참고: 소부피 재구성 픽셀 크기는 10μm에서 선택하였는데, 이는 이미징 섬유주의 두께가 이전 연구13의 조직학적 데이터를 기반으로 약 20-30μm로 추정되었기 때문이다. 신호 대 잡음비가 데이터 처리에 충분하지 않은 경우 고해상도 1시간 스캔을 수행해야 합니다. - 3D 해석 버튼을 클릭하여 결과 3D 재구성을 가져옵니다.
- 분석을 위해 micro-CT 시스템에서 컴퓨터로 데이터를 내보냅니다.
- 재구성된 CT 데이터를 가져옵니다. Process > Image Calculator(이미지 계산기 처리)를 클릭한 다음 Region Pad > Interactive(대화형)를 클릭합니다. 노란색 체크박스를 적절한 ROI로 조정합니다.
참고: 관심 영역(ROI)은 성장판에서 약 540μm 근위부에서 시작하여 실제 뼈 대사 및 리모델링을 평가하기 위해 근위부로 1600μm 확장됩니다. - BMA(Bone Microarchitecture Analysis) 애드온을 선택합니다(재료 표 참조). Segment Cortex를 클릭한 다음 Segment Trabeculae를 클릭합니다.
알림: 섬유주와 피질골이 모두 자동으로 선택됩니다. 일반적으로 수동 조정이 필요하지 않습니다. - 최종 오브젝트 맵 저장(Save Final Object Map) 을 클릭한 다음 본 측정(Measure Bone) 을 클릭하여 본 형태 인덱스를 계산합니다.
참고: 대조군이 추가되지 않았기 때문에 여기서는 상대 골밀도(BMD)만 계산했습니다.
4. 뼈 조직의 석회질 제거
- 뼈 표본을 4% 파라포름알데히드( 재료 표 참조)에 24시간 동안 고정합니다. PBS( 재료 표 참조)로 매번 20분 동안 표본을 세 번 세척합니다.
- 매번 20분 동안 증류수로 조직을 세 번 헹굽니다. 조직을 EDTA가 함유된 석회질 제거 용액( 재료 표 참조)으로 옮기고 종점까지 매주 용액을 교체하면서 30일 동안 석회질을 제거합니다.
알림: 바늘 찌르기, 손 꼬집기 및 clamping은 뼈 조직이 부드러워지거나 바늘을 꿰맬 때 저항감이 없을 때 석회질 제거를 종료하는 데 사용됩니다. 물리적 검출 방법은 조직 구조에 약간의 손상을 줄 수 있으므로 과도한 힘이나 반복적인 테스트를 피하십시오. - 고정액에서 조직을 꺼내고 메스를 사용하여 흄 후드에서 조직을 다듬습니다. 손질한 조직과 해당 라벨을 탈수 상자에 넣습니다.
- 탈수 상자를 바구니에 넣고 그라디언트 알코올 (75 시간 동안 4 % 에탄올, 2 시간 동안 85 % 에탄올, 2 시간 동안 90 % 에탄올, 1 시간 동안 95 % 에탄올, 30 분 동안 무수 에탄올, 30 분 동안 무수 에탄올 II, 5-10 분 동안 크실렌 I, 크실렌 II 5-10분, 왁스 I 1시간, 왁스 II 1시간, 왁스 III 1시간).
- 매립기( 재료 표 참조)를 사용하여 왁스에 적신 조직을 매립합니다. 녹인 왁스를 매립 상자에 붓고 왁스가 굳기 전에 탈수 상자에서 티슈를 놓습니다.
- 임베딩 표면에 따라 조직의 방향을 지정하고 해당 라벨을 부착합니다. -20°C 냉동 테이블에서 식힙니다( 재료 표 참조). 응고 후 임베딩 상자에서 왁스 블록을 제거하고 필요에 따라 왁스 블록을 다듬습니다( 재료 표 참조).
- 손질된 왁스 블록을 마이크로톰에 3μm 두께의 슬라이드로 자릅니다( 재료 표 참조). 조직 살포 기계( 재료 표 참조)의 40°C 따뜻한 물에 슬라이드를 띄워 조직을 평평하게 만들고 슬라이드로 퍼냅니다.
- 물이 증발하고 왁스가 녹을 때까지 60°C 오븐( 재료 표 참조)에서 굽습니다. 나중에 사용할 수 있도록 꺼내서 실온(RT)에 보관하십시오.
5. HE 염색
- 슬라이드를 크실렌 I에 20분 동안 넣은 다음 크실렌 II에 20분 동안 넣습니다. 또한, 슬라이드를 무수 에탄올 I과 무수 에탄올 II에 각각 5분, 75% 알코올을 5분 동안 넣은 다음 슬라이드를 수돗물로 세척합니다( 재료 표 참조).
- 헤마톡실린( 재료 표 참조)에서 3-5분 동안 배양합니다. 염산 용액으로 시편을 구별합니다( 재료 표 참조). 슬라이드를 암모니아 용액( 재료 표 참조)으로 처리하여 블루잉한 다음 슬라이드를 물로 씻습니다.
- 탈수를 위해 슬라이드를 85%, 95% 그래디언트 알코올에 넣고 에오신 용액( 재료 표 참조)으로 5분 동안 염색합니다.
- 슬라이드를 무수 에탄올 I에 5분, 무수 에탄올 II에 5분, 무수 에탄올 III에 5분 동안 넣습니다. 슬라이드를 크실렌 I으로 5분, 크실렌 II로 5분 동안 처리하고 중성 발삼으로 장착합니다( 재료 표 참조).
- 현미경으로 각 슬라이드를 검사합니다. 그런 다음 파노라마 스캔을 위한 대표 슬라이스를 선택합니다( 재료 표 참조).
참고: 각 샘플에 대해 최소 3개의 연속 슬라이스가 필요합니다. 파노라마 스캔 전에 슬라이스가 완전하고 깨끗한지 확인하기 위해 현미경으로 검사해야 합니다. 골수강, 피질골, 해면골이 완전히 표시되고 다양한 유형의 골세포를 볼 수 있는지 확인합니다.
6. HE 이미지 분석
- CaseViewer 소프트웨어로 HE 이미지를 엽니다( 재료 표 참조). 슬라이드에서 관심 영역(ROI)을 선택하고 컬러 이미지로 저장합니다.
알림: ROI 선택은 위에서 언급한 소프트웨어와 일치합니다. - ImageJ에서 이미지를 엽니다( 재료 표 참조). 도구 모음에서 [지팡이 도구]를 선택합니다. 섬유주 뼈를 클릭합니다.
- 필요에 따라 공차 및 연속 설정을 조정합니다. Image > Adjustments > Black & White(흑백 조정 )로 이동하여 OK(확인)를 클릭합니다. 뼈의 다른 부분에 대해 이 단계를 반복합니다.
- 선택 영역을 반전하고 흰색으로 채웁니다. 분석을 위해 이미지를 마스크로 저장합니다(그림 2 참조).
참고: 자세한 방법론은 이전에 출판된 연구14를 참조하십시오. - 해석 소프트웨어15,16에서 마스크를 오픈한다(재료 표 참조). Process > Binary > Make Binary를 실행하여 컬러 이미지를 이진 이미지로 변환합니다.
- 소프트웨어에서 플러그인 17(재료 표 참조)을 사용하여 구조적 매개변수를 분석합니다: Run Area/Volume Fraction을 사용하여 골격의 총 부피에 대한 뼈 부피를 계산합니다(BV/TV [%])18,19.
참고: 이 방법은 골섬유주 및 골수에 적용할 수 있으며 HE 이미지의 전체 ROI를 채웁니다.
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Representative Results
Micro-CT 분석
우리는 두 그룹의 마우스에서 섬유주 미세아키텍처 매개변수를 측정하고 표 1에 평균값과 SD를 보고했습니다. 각 그룹 내에서 일부 매개변수(즉, 총 조직 부피에 대한 뼈 부피의 비율, 섬유주 두께, 섬유주 분리)의 분포는 그림 3에 나와 있습니다.
이러한 결과는 Micro-CT에서 추정된 여러 매개변수에 대해 OVX와 Sham 그룹의 마우스 간에 상당한 차이가 있음을 나타냅니다. 즉, OVX 그룹의 총 조직 용적(BV/TV)에 대한 뼈 용적의 비율은 Sham 그룹보다 3% 낮았습니다. OVX 마우스의 섬유주 두께는 Sham 그룹의 섬유주 두께보다 낮았으며, 상대적 차이 비율은 39.3%였다. OVX 마우스의 섬유주 분리는 샴 마우스의 섬유주 분리보다 더 컸습니다. 그림 4 는 각 그룹에 대해 재구성된 골량에서 추출한 섬유주 ROI의 3D 디스플레이를 보여줍니다. 난소 절제술 후 쥐의 골밀도인 Sham 그룹(그림 4A)과 비교했을 때, 섬유주는 희박하고 골다공증을 보였다(그림 4B).
HE 염색 분석
또한 조직병리학적 분석을 통해 Micro-CT 분석에서 발견된 변화를 확인했습니다. 8주 후 HE 염색 결과 OVX 후 마우스의 대퇴골 원위 성장판 아래의 섬유주 뼈(빨간색)가 Sham 그룹에 비해 감소했으며 뚜렷한 두꺼운 섬유주 구조가 거의 없었으며 많은 수의 지방과 유사한 과립이 나타났습니다(그림 5A). 조직 절편의 정량적 분석에 기초하여, OVX 마우스는 Sham 마우스보다 섬유주 뼈 면적이 더 적었습니다(그림 5B).
그림 1: 하위 볼륨 재구성 인터페이스의 스크린샷. 5.12mm x 5.12mm 시야(FOV)에서 10μm까지 내려가기 위한 녹색 직사각형의 하위 볼륨 재구성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 흑백의 이미지 마스크 구성. (A1-A3): 가짜 그룹의 HE 이미지(스케일 바 = 200μm). 뼈 섬유주는 선택한 부위 내에서 검은색으로 표시되고 다른 조직은 흰색으로 표시됩니다. (나1-나3) OVX 그룹 이미지(스케일 바 = 200μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: OVX와 Sham 그룹 간 원위 대퇴골 섬유주의 미세구조 파라미터 비교. (A) OVX 그룹의 총 조직 부피(BV/TV [%])에 대한 뼈 부피의 비율은 Sham 그룹보다 낮았습니다. (비) OVX 마우스의 섬유주 두께(TB.Th[μm])는 Sham 그룹보다 낮았습니다. (C) OVX 마우스의 섬유주 분리(TB.sp[μm])는 Sham 마우스보다 컸다. *P < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 대퇴골 원위부의 섬유주 뼈의 대표적인 Micro-CT 이미지. (A) Sham 그룹과 비교했을 때, 난소 절제술 후 마우스의 골밀도는 희박한 섬유주를 나타내고 골다공증을 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: OVX 및 Sham 그룹의 대퇴골 원위 섬유주 뼈 부위의 조직학적 분석. (A) 각 그룹의 대퇴골 원위부의 대표적인 HE 염색 이미지(척도 막대 = 500μm). 검은색 화살표는 섬유주를 나타냅니다. (B) 선택한 ROI에서 총 조직 부피의 섬유주 뼈 면적의 정량적 분석. *P < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 매개 변수 | 가짜 운영 그룹(SHAM) (n = 5)입니다. |
난소 절제술 그룹(OVX) (n = 5)입니다. |
P 값 |
| 뼈 부피 대 총 조직 부피 비율(%) | 7.3 ± 0.9 | 4.2 ± 0.5 | 0.012* |
| 섬유주 두께(μm) | 79.5 ± 5.5 | 53.4 ± 6.0 | 0.013* |
| 섬유주 분리(μm) | 212.5 ± 8.7 | 249.4 ± 8.3 | 0.015* |
| 값은 평균± SD입니다. * 현저하게 다릅니다 (P<0 .05). |
|||
표 1: Micro-CT에서 추정한 섬유주 뼈 매개변수.
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Discussion
골다공증은 빈번한 골절로 이어질 수 있으며, 이는 비용이 많이 들고, 통증, 장애 또는 사망을 유발할 수 있으며, 환자의 삶의 질에 심각한 영향을 미칠 수 있다20. 수년에 걸쳐 난소 절제술 모델은 골다공증을 연구하는 표준 방법 중 하나로 인정받고있다 21. 골다공증에 대한 가장 일반적인 전임상 동물 모델은 난소 절제술(OVX) 쥐입니다. 그럼에도 불구하고, 골다공증을 포함한 뼈 질환의 메커니즘에 대한 대부분의 연구는 마우스를 사용하여 수행되었다22. 성인 암컷 C57/BL6J 마우스에서 골다공증 모델을 확립하기 위해 이 시술을 위한 최적의 시기인 생후 12주에 난소 절제술을 시행합니다. 생쥐는 생후 8-12주부터 성숙하고 생식력이 있으며, 난소 절제술은 이 시기에 골량에 상당한 영향을 미친다10. 이전 연구에 따르면 12주 이전에 쥐의 뼈는 빠르게 성장하고 뼈 형태, BMD 및 뼈 생체 역학의 지표가 빠르게 증가합니다. 총 골밀도(BMD)와 대뇌피질 뼈 골밀도(cortical bone BMD)는 생쥐의 나이와 유의미한 상관관계가 있습니다. 그러나 12주 후 마우스의 뼈 대사는 안정된 기간에 들어가고 위의 지표는 안정적인 경향이 있습니다23,24.
뼈 미세건축은 골밀도와 무관하게 뼈 취약성에 영향을 미치는 주요 요인으로 제안되었습니다. 골다공증의 뼈 취약성은 골량의 결핍으로 완전히 설명되지 않습니다. 골밀도는 뼈 강도의 60%-70%만 설명할 수 있다25. 구조적 구성 측면에서 대뇌 피질골은 골량의 80%를 차지하는 반면, 해면골은 골량의 50%를 잃은 후 측정값의 10%만 나타내므로 골량 측정만으로는 골량 손실을 평가하기에 충분하지 않습니다. 뼈의 부피 외에도 뼈 섬유주의 구조적 변화는 뼈의 강도에 매우 중요합니다. 칸셀루스 뼈에는 조혈 골수 조직 또는 지방 조직이 포함되어 있습니다. 표면은 상당히 커서 피질 뼈보다 약 8 배 더 큽니다. 골수와 연결된 이 넓은 표면적은 해면골이 상당히 높은 골 전환율을 가질 수 있도록 합니다. 이것이 우리가 골다공증 변화를 관찰하기 위한 주요 지표로 뼈 섬유주의 미세구조를 선택한 이유입니다. 골격의 섬유주 뼈 조직은 성장 과정에서 지속적으로 리모델링을 거치며, 이 과정에서 새로 형성된 뼈 섬유주가 기존 뼈를 대체하고 2차 해면골을 형성합니다. 따라서 정상적인 조건에서 섬유주 뼈의 형태학적 분석은 주로 2차 해면골 영역에 초점을 맞춥니다. 반면에 1차 해면골 조직은 선천적으로 존재하고 비교적 안정적인 구조로 리모델링되지 않으므로 분석에서 제외해야 합니다. 일반적으로 성장판에서 일정 거리 내에 있는 뼈는 조직을 활발하게 리모델링하는 것으로 볼 수 있다. 따라서 분석을 위해 성장판 위 540μm에서 시작하여 근위 방향으로 1600μm에 걸쳐 있는 관심 영역(ROI)을 선택했습니다. 우리의 연구 결과에 따르면, 생쥐는 난소 절제술 후 섬유주 영역에서 매우 다른 미세 구조적 특성을 나타낸다.
본 연구에서 사용된 Micro-CT 기술은 최근 수십 년 동안 개발된 비파괴 3D 이미징 기술로 민족 약초의 약리학적 연구에 점차 적용되고 있습니다. 시료를 파괴하지 않고 시료의 내부 미세 구조를 명확하게 이해할 수 있습니다. 조직병리학적 검사의 경우, 수지 내장법은 효소 활성과 단백질 항원성을 손상시키며, 조직화학이나 면역조직화학에 안정적으로 사용할 수 없다26. 기존의 파라핀 임베딩은 면역조직화학(IHC), 형광 제자리 혼성화(FISH) 및 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)과 같은 기술과 결합하여 분자 수준에서 뼈 조직의 저농도 물질을 정량적으로 검출할 수 있으므로 뼈 대사의 메커니즘과 조절에 대한 더 깊은 이해를 얻을 수 있습니다. 파노라마 슬라이드 스캐너는 슬라이드를 고해상도 디지털 이미지로 빠르게 변환할 수 있으므로 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 뼈 조직형 데이터를 정량적으로 분석할 수 있습니다. 요약하면, Micro-CT와 뼈 조직형학의 조합은 뼈 미세 구조에 대한 보다 상세하고 정확한 평가를 제공할 수 있습니다.
전통적으로 골의 질 평가는 주로 이중 에너지 X선 흡수 측정법(DXA), 제한된 해상도의 컴퓨터 단층 촬영 또는 기술적으로 까다로운 자기 공명 영상으로 제한되었습니다27. 두 기술의 조합에는 고유한 장점이 있지만 한계도 있습니다. 첫째, Micro-CT는 동일한 동물에 대한 장기간의 지속적인 모니터링을 가능하게 하지만, 살아있는 작은 동물, 특히 생쥐의 골격 미세구조의 생체 내 이미징은 여전히 기술적으로 까다롭다28. 둘째, 다양한 기기 또는 사용자로부터 데이터를 수집하고 분석하기 위한 구조화되고 국제적으로 인정된 프로토콜이 없기 때문에 데이터 세트를 비교하고 연구 결과를 여러 연구에서 재현하기가 어렵습니다. 셋째, Micro-CT의 특성상 전리방사선 피폭이 불가피하다. 넷째, 당사의 간단하고 경제적인 프로토콜은 HE로 염색된 뼈 이미지의 정량적 분석을 제공할 수 있지만, 이는 주로 복잡한 자동화 방법보다 더 힘든 반자동 분할 전략을 기반으로 합니다.
결론적으로, 이 기술의 적용은 의심할 여지 없이 탐사 과정에서 민족 의학의 골다공증 연구에 큰 자극을 줄 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 쓰촨성 중의약관리국(2021YJ0175)과 청두중의과대학 임상의학대학원 연구혁신 프로젝트(LCYJSKT2023-11)의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
| Ammonia Solution | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anatomical Forceps | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J3C030 | |
| Anhydrous Ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Automatic Dyeing Machine | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
| Bone Microarchitecture Analysis Add-on | AnalyzeDirect, Inc | ||
| C57BL/6J mice | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Carrier Slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Coverslips | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Decalcification Solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Delicate Scissors | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | ZJA010 | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fiji: ImageJ | National Institutes of Health, USA | ||
| Film Sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| Freezing Table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| H&E Staining Kit | Leagene | DH0020 | |
| Hydrochloric Acid Solution | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| ImageJ2 Plugin | BoneJ 7.0.16 | ||
| Medical Gauze | Shandong Ang Yang Medical Technology Co. | ||
| Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures | Ethicon, Inc. | SA84G | |
| Needle Holder | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J32010 | |
| Neutral Balsam | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| PANNORAMIC Digital Slide Scanners | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Povidone-iodine solution 5% | Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Quantum GX2 microCT Imaging System | PerkinElmer, Inc. | ||
| Rotary Microtome | Thermo scientific | HM325 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Scan & Browse Software | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
| Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves | Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd | 22B141EO | |
| Sodium Chloride Solution 0.9% | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Sterile Hypodermic Syringes for Single Use | Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd | ||
| Sterile Medical Suture Needles | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | PW8068 | |
| Tissue Processor | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Tissue Spreading and Baking Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Tribromoethanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M2920 | |
| Wax Trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
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