Summary
פרוטוקול זה מציג שיטה חסכונית ויעילה להערכה כמותית של מיקרו-ארכיטקטורה של עצם במודל עכברי של אוסטאופורוזיס על ידי שילוב של צביעת Hematoxylin-Eosin (HE) וטכניקות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (Micro-CT).
Abstract
מיקרו-מבנה עצם מתייחס לסידור ואיכות רקמת העצם ברמה המיקרוסקופית. הבנת מיקרו-מבנה העצם של השלד חיונית להשגת תובנה לגבי הפתופיזיולוגיה של אוסטאופורוזיס ושיפור הטיפול בה. עם זאת, טיפול בדגימות עצם יכול להיות מורכב בשל תכונותיהן הקשות והצפופות. שנית, תוכנה מיוחדת מקשה על עיבוד וניתוח תמונה. בפרוטוקול זה, אנו מציגים פתרון חסכוני וקל לשימוש לניתוח מיקרו-מבנה עצם טרבקולרית. צעדים מפורטים ואמצעי זהירות מסופקים. Micro-CT היא טכניקת הדמיה תלת-ממדית (תלת-ממדית) לא הרסנית המספקת תמונות ברזולוציה גבוהה של מבנה העצם הטרבקולרית. היא מאפשרת הערכה אובייקטיבית וכמותית של איכות העצם, ולכן היא נחשבת לשיטת תקן הזהב להערכת איכות העצם. עם זאת, היסטומורפומטריה נותרה הכרחית מכיוון שהיא מציעה פרמטרים חיוניים ברמת התא, המגשרת על הפער בין הערכות דו-ממדיות (2D) ותלת-ממדיות של דגימות עצם. באשר לטכניקות ההיסטולוגיות, בחרנו להסיר את רקמת העצם ולאחר מכן לבצע הטבעה מסורתית של פרפין. לסיכום, שילוב של שתי שיטות אלה יכול לספק מידע מקיף ומדויק יותר על מיקרו-מבנה העצם.
Introduction
אוסטאופורוזיס היא מחלת עצם מטבולית נפוצה, במיוחד בקרב קשישים, והיא קשורה לסיכון מוגבר לשברים שבירים. ככל שאוסטאופורוזיס הופך נפוץ יותר בסין1, יהיה ביקוש גובר לחקר מבני העצם של בעלי חיים קטנים 2,3. השיטות הקודמות למדידת אובדן עצם מסתמכות על התוצאות של ספיגת קרני רנטגן דו-ממדית באנרגיה כפולה. עם זאת, זה לא לוכד את השינויים במיקרו-מבנה האדריכלי של עצם הטרבקולר, שהוא גורם מפתח לחוזק השלד4. המיקרו-מבנה של העצם משפיע על חוזקה, נוקשותה ועמידותה בפני שברים. על ידי השוואת מיקרו-ארכיטקטורה של עצם במצבים נורמליים ופתולוגיים, ניתן לזהות שינויים במורפולוגיה, במבנה ובתפקוד של רקמת העצם הנגרמים על ידי אוסטאופורוזיס. מידע זה תורם להבנת התפתחות אוסטאופורוזיס והקשר שלה למחלות אחרות.
הדמיית טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (Micro-CT) הפכה לאחרונה לטכניקה פופולרית להערכת מורפולוגיה של העצם, שם היא יכולה לספק נתונים מדויקים ומקיפים על מבנה העצם ופרמטרים של צפיפות כגון שבר נפח עצם, עובי והפרדה 5,6. יחד עם זאת, תוצאות Micro-CT יכולות להיות מושפעות מתוכנת הניתוח7. שיטות שונות של רכישה, הערכה ודיווח של תמונות משמשות מערכות מיקרו-CT מסחריות שונות. חוסר עקביות זה מקשה על השוואה ופירוש התוצאות המדווחות על ידי מחקרים שונים5. כמו כן, היא אינה יכולה כיום להחליף את ההיסטומורפומטריה של העצם במתן מידע לחוקרים על פרמטרים ברמה התאית במערכת השלד8. בינתיים, טכניקות היסטולוגיות מאפשרות תצפית ישירה ומדידה של המורפולוגיה המיקרוסקופית של העצם. צביעת Hematoxylin ו- eosin (HE) היא טכניקת צביעה נפוצה המשמשת בהיסטולוגיה כדי לדמיין את המבנה הכללי של תאים ורקמות. הוא משמש לזיהוי נוכחות של רקמת העצם ואת microarchitecture שלה.
מאמר זה משתמש במיקרו-CT בשילוב עם טכניקת חיתוך רקמות (צביעת Hematoxylin-Eosin [HE]) כדי לאסוף תמונות של רקמת עצם ולבצע ניתוח כמותי של עצם טרבקולרית כדי להעריך את השינויים במיקרו-מבנה העצם במודל עכבר אוסטאופורוזיס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול בעלי החיים אושר על ידי הוועדה האתית לבעלי חיים של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית (מספר שיא: 2020-34). נקבות עכברי C57BL/6J (בנות 12 שבועות, n = 14) חולקו לשתי קבוצות באופן אקראי, קבוצה המופעלת על ידי דמה (קבוצת Sham, n = 7) וקבוצת מודל (קבוצת OVX, n = 7). בעלי החיים נרכשו מספק מסחרי (ראו טבלת חומרים). כל העכברים הוחזקו בכלובים נפרדים בטמפרטורה של 22-26 מעלות צלזיוס עם לחות של 45%-55%, הורשו להסתגל לסביבתם החדשה למשך שבוע אחד, וסיפקו גישה חופשית למים ולתזונה. כל הניסויים בבעלי חיים נערכו באוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית, וכל המאמצים נעשו כדי למזער את סבלם של בעלי החיים.
1. הכנת מודל בעלי חיים
- מרדימים עכבר בן 12 שבועות על ידי הזרקה intraperitoneal עם 1.25% Avertin (Tribromoethanol באלכוהול טרט-עמיל, ראה טבלה של חומרים) במינון של 0.02 מ"ל / גרם. מקם את העכבר הנוטה לניתוח על שולחן ניתוחים סטרילי, ושתק את גפיו על ידי הדבקתן המאובטחת.
- השתמש מספריים (ראה טבלה של חומרים) כדי לקצץ כל שיער שעלול להשפיע על הפעולה הכירורגית.
הערה: מומלץ להימנע מנזק לעור בעת הכנת אתר הניתוח. - שטפו ידיים ביסודיות ולבשו כפפות כירורגיות. יש לחטא את גב העכבר שלוש פעמים בפובידון-יוד (ראו טבלת חומרים), ולהשתמש בגזה רפואית (ראו טבלת חומרים) כדי לייבש אותו.
הערה: היזהר; הרטבת השיער במהלך החיטוי עלולה להוביל להיפותרמיה לאחר הניתוח בעכברים. - בצע חתך באורך של כ-0.5-1.0 ס"מ, הממוקם במרחק של 1 ס"מ משליש מקו האמצע של גב העכבר, באמצעות אזמל (ראה טבלת חומרים). מפרידים בעדינות את הפאשיה וחותכים דרך השריר בעזרת מספריים לרקמות (ראו טבלת חומרים) עד שהשחלה נראית לעין. קשרו את כלי הדם שמסביב עם תפרים שאינם נספגים (ראו טבלת חומרים) והסירו את השחלה.
- יש לשטוף את החלל בתמיסת מלח 0.9%, ולאחר מכן לתפור בנפרד את העור, השריר והפאשיה (ראו טבלת חומרים).
- חזור על אותו רצף צעדים בצד השני.
- הסר שומן פרי-שחלות באותו גודל כמו השחלה, ובצע את אותו הליך כירורגי שהוזכר לעיל עבור השלבים הנותרים כדי לבסס את המודל המופעל דמה.
- יש לאפשר תקופת החלמה של שבוע לאחר הניתוח. לאחר 8 שבועות, מודלים עכבר osteoporotic יוקמו בהצלחה 9,10.
2. סריקת Micro-CT
- הרדימו את העכבר על ידי שאיפת CO2 עודפת. הסר רקמות רכות רבות ככל האפשר מעצם הירך של העכבר לאחר המתת חסד וקבל דגימה טרייה לסריקה.
הערה: אמנם אין פתרון מושלם לשימור דגימות, אך ניתן לנקוט צעדים מסוימים כדי למקסם את האיכות של תוצאות סריקת Micro-CT. לפני הקיבוע, דאגו להסיר כמה שיותר רקמות מסביב. פורמלין או פורמלין חוצץ היא שיטת הקיבוע המועדפת ביותר עם אחסון ב- PBS11,12. - לחץ פעמיים על סמל התוכנה של מערכת ההדמיה micro-CT בשולחן העבודה כדי להפעיל את המערכת (ראה טבלת חומרים). בחר מיטה לדוגמה התואמת לשדה הראייה לדוגמה (FOV) של 18 מ"מ x 18 מ"מ. טען את מיטת הדגימה המתאימה למכונה וסגור את הצוהר.
- לחץ על לחצן ' התחמם' בלוח הבקרה.
הערה: נדרש זמן חימום קצר. אין לנסות לפתוח את הצוהר בעת יצירת צילומי רנטגן. בדוק את אור הרנטגן בלוח הקדמי ובצג המחשב כדי לוודא אם נוצרים צילומי רנטגן. - לחץ/י על הכפתור ״ תפריט״ כדי להגדיר מסד נתונים חדש, ואז צור/י מדגם חדש ולמד/י.
- בחר ידני מהרשימה הנפתחת תפריט והזן ערכי מתח וזרם מותאמים אישית בלוח הבקרה. הגדר מתח (kV) ל- 90, זרם (μA) ל- 80, מצב סריקה לרזולוציה גבוהה, 14 דקות ו- FOV (מ"מ) ל- 18 מ"מ x 18 מ"מ.
הערה: עיין במדריך עבור מערכות מיקרו CT שונות כדי להגדיר את הפרמטרים המתאימים. - מקם את העצם היטב עם סרט פלסטיק במיטת הדגימה. סגור את הצוהר. ודא שהנושא ממורכז בדיוק בחלון לכידת X על-ידי לחיצה על לחצני הכוונון במכשיר.
הערה: התאמת הדגימה חייבת להיות איטית ועדינה כדי למנוע ממנה ליפול למכונה בטעות. - לחץ על לחצן התחל כדי להתחיל בסריקת CT.
3. ניתוח נתוני CT
- הזן את התוכנה (ראה טבלת חומרים) ובחר את הנתונים לניתוח. לחץ על Sub והגדר את גודל הפיקסל ל- 10 μm. הזז ושנה את גודל אזור העניין (ROI) כך שיכלול את עצם הירך הדיסטלית מעל לוחית הצמיחה. לחץ על התחל (ראה איור 1).
הערה: גודל הפיקסל לשחזור תת-נפח נבחר ב-10 מיקרומטר מכיוון שעובי טרבקולה ההדמיה הוערך בכ-20-30 מיקרומטר בהתבסס על נתונים היסטולוגיים ממחקרים קודמים13. אם יחס האות לרעש אינו מספיק לעיבוד נתונים, יש לבצע סריקה ברזולוציה גבוהה של שעה אחת. - לחץ על ניתוח 3D כפתור כדי לקבל את שחזור 3D שנוצר.
- ייצא את הנתונים ממערכת micro-CT למחשב לניתוח.
- ייבא את נתוני ה- CT המשוחזרים. לחץ/י על ״ עבד את מחשבון התמונות״ > מכן לחץ/י על Region Pad > Interactive. התאם את תיבת הסימון הצהובה להחזר ההשקעה המתאים.
הערה: אזור העניין (ROI) מתחיל בערך 540 מיקרומטר פרוקסימלי ללוחית הצמיחה ומשתרע 1600 מיקרומטר בסמיכות כדי להעריך את חילוף החומרים בפועל של העצם ואת שיפוץ. - בחר את ההרחבה Bone Microarchitecture Analysis (BMA) (ראה טבלת חומרים). לחץ על Segment Cortex ולאחר מכן על Segment Trabeculae.
הערה: הן עצם טרבקולרית והן עצם קליפת המוח) נבחרות באופן אוטומטי. בדרך כלל אין צורך בכוונון ידני. - לחץ על שמור מפת אובייקטים סופית ולאחר מכן לחץ על מדידת עצם כדי לחשב מדדים מורפומטריים של עצם.
הערה: רק צפיפות מינרלים יחסית של העצם (BMD) חושבה כאן מכיוון שלא נוספה בקרה.
4. הסתיידות של רקמת העצם
- קבע את דגימות העצם בפרפורמלדהיד 4% (ראה טבלת חומרים) למשך 24 שעות. שטפו את הדגימות שלוש פעמים עם PBS (ראו טבלת חומרים) במשך 20 דקות בכל פעם.
- שטפו את הרקמה שלוש פעמים במים מזוקקים במשך 20 דקות בכל פעם. מעבירים את הרקמה לתמיסת הסתיידות המכילה EDTA (ראו טבלת חומרים) ומסתיידים למשך 30 יום עם שינוי תמיסה שבועי עד לנקודת הקצה.
הערה: דקירת מחט, צביטת יד והידוק משמשים לסיום הסתיידות כאשר רקמת העצם הופכת רכה, או שאין תחושה של התנגדות בעת מחטים. השיטה הפיזית של גילוי יכול לגרום נזק מסוים למבנה הרקמה, אז לנסות למנוע כוח מוגזם או בדיקות חוזרות. - הוציאו את הרקמה מהקיבוע והשתמשו באזמל כדי לחתוך את הרקמה במכסה אדים. שים את הרקמה החתוכה ואת התווית המתאימה בקופסת התייבשות.
- שים את קופסת ההתייבשות בסל ומייבש אותה במעבד רקמות (ראה טבלת חומרים) עם אלכוהול מדורג (75% אתנול במשך 4 שעות, 85% אתנול במשך 2 שעות, 90% אתנול במשך 2 שעות, 95% אתנול במשך 1 שעות, אתנול נטול מים במשך 30 דקות, אתנול נטול מים II במשך 30 דקות, קסילן I במשך 5-10 דקות, קסילן II למשך 5-10 דקות, שעווה I למשך שעה אחת, שעווה II למשך שעה אחת, שעווה III למשך שעה אחת).
- השתמש במכונת הטבעה (ראה טבלת חומרים) כדי להטמיע את הרקמה הספוגה בשעווה. יוצקים את השעווה המומסת לקופסת הטבעה ומניחים את הרקמה מקופסת ההתייבשות לפני שהשעווה מתקשה.
- לכוון את הרקמה בהתאם למשטח ההטבעה ולהצמיד את התווית המתאימה. מצננים על שולחן הקפאה בטמפרטורה של -20°C (ראו טבלת חומרים). הסירו את גוש השעווה מקופסת ההטבעה לאחר המיצוק וקצצו את גוש השעווה לפי הצורך (ראו טבלת חומרים).
- חתכו את גוש השעווה החתוך לשקופיות בעובי 3 מיקרומטר על מיקרוטום (ראו טבלת חומרים). ציפו את המגלשות על מים חמים בטמפרטורה של 40°C במכונה לפיזור רקמות (ראו טבלת חומרים) כדי לשטח את הרקמה ולגרוף אותן במגלשה.
- אופים בתנור של 60 מעלות צלזיוס (ראו טבלת חומרים) עד שהמים מתאדים והשעווה נמסה. יש להוציא ולאחסן בטמפרטורת החדר (RT) לשימוש מאוחר יותר.
5. הוא מכתים
- שים את המגלשות בקסילן I למשך 20 דקות, ולאחר מכן בקסילן II למשך 20 דקות. יתר על כן, לשים את המגלשות אתנול נטול מים I ואתנול נטול מים II במשך 5 דקות כל אחד, 75% אלכוהול במשך 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף את המגלשות עם מי ברז (ראה טבלה של חומרים).
- יש לדגור בהמטוקסילין (ראו טבלת חומרים) למשך 3-5 דקות. הבדיל בין הדגימות בתמיסת חומצה הידרוכלורית (ראה טבלת חומרים). טפלו בשקופיות בתמיסת אמוניה (ראו טבלת חומרים) להדבקה, ולאחר מכן שטפו את המגלשות במים.
- הכניסו את המגלשות ל-85%, 95% אלכוהול הדרגתי להתייבשות והכתימו בתמיסת אאוזין (ראו טבלת חומרים) למשך 5 דקות.
- שים את המגלשות אתנול נטול מים I במשך 5 דקות, אתנול נטול מים II במשך 5 דקות, אתנול נטול מים III במשך 5 דקות. טפלו בשקופיות עם קסילן I למשך 5 דקות, קסילן II למשך 5 דקות, והרכיבו עם בלסם ניטרלי (ראו טבלת חומרים).
- בחנו כל שקופית מתחת למיקרוסקופ. לאחר מכן, בחרו את הפרוסות המייצגות לסריקה פנורמית (ראו טבלת חומרים).
הערה: נדרשות לפחות שלוש פרוסות רצופות לכל דגימה. לפני סריקה פנורמית, יש לבדוק את הפרוסות תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהן שלמות וברורות. ודא כי חלל מח העצם, עצם קליפת המוח, ואת העצם בוטל מוצגים במלואם וכי סוגים שונים של תאי עצם ניתן לראות.
6. ניתוח תמונות HE
- פתח תמונות HE באמצעות תוכנת CaseViewer (ראה טבלת חומרים). בחר את אזור העניין (ROI) בשקופית ושמור אותו כתמונה צבעונית.
הערה: בחירת החזר ההשקעה עולה בקנה אחד עם התוכנה שהוזכרה לעיל. - פתחו את התמונה ב-ImageJ (ראו טבלת חומרים). בחרו בכלי שרביט מסרגל הכלים. לחץ על עצם הטרבקולר.
- התאם את הגדרות הסיבולת והרצף לפי הצורך. עברו אל 'התאמות > תמונה' >'שחור-לבן ' ולחצו על הלחצן 'אשר'. חזור על השלבים עבור אזורים אחרים של העצם.
- הפוך את הבחירה ומלא אותה בצבע לבן. שמרו את התמונה כמסיכה לניתוח (ראו איור 2).
הערה: לקבלת המתודולוגיה המפורטת, עיין בעבודה שפורסמה בעבר14. - פתח את המסיכה בתוכנת הניתוח15,16 (ראה טבלת חומרים). הפעל תהליך > בינארי > Make Binary כדי להמיר את התמונה הצבעונית לתמונה בינארית.
- השתמש בתוסף 17 (ראה טבלת חומרים) בתוכנה כדי לנתח פרמטרים מבניים: שטח הפעלה/מקטע נפח כדי לחשב נפח עצם לנפח כולל של עצם (BV/TV [%])18,19.
הערה: שיטה זו ישימה עבור עצם trabeculae ומח עצם, מילוי החזר ההשקעה כולו בתמונות HE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתוח מיקרו-CT
מדדנו את הפרמטרים המיקרו-אדריכליים הטרבקולריים בעכברים משתי הקבוצות ודיווחנו על הערכים הממוצעים שלהם ועל SDs בטבלה 1. ההתפלגות של כמה פרמטרים (כלומר, היחס בין נפח העצם לנפח הרקמה הכולל, עובי טרבקולרי, הפרדה טרבקולרית) בתוך כל קבוצה מודגמת באיור 3.
תוצאות אלה מצביעות על הבדלים משמעותיים בין עכברים מקבוצת OVX לקבוצת Sham עבור מספר פרמטרים שהוערכו ממיקרו-CT. כלומר, היחס בין נפח העצם לנפח הרקמה הכולל (BV/TV) בקבוצת OVX היה נמוך ב-3% מזה שבקבוצת Sham. עובי הטרבקולר בעכברים של OVX היה נמוך יותר מאשר בקבוצת Sham, עם אחוז הפרש יחסי של 39.3%. ההפרדה הטרבקולרית בעכברי OVX הייתה גדולה יותר מזו שבעכברי שאם. איור 4 מציג תצוגות תלת-ממדיות של ROI טרבקולרי שחולצו מנפח עצם משוחזר עבור כל קבוצה. בהשוואה לקבוצת Sham (איור 4A), צפיפות העצם של עכברים לאחר כריתת השחלות, הטרבקולה הייתה דלילה והראתה אוסטאופורוזיס (איור 4B).
ניתוח מכתים HE
בנוסף, ניתוח היסטופתולוגי אישר את השינויים שנמצאו בניתוח Micro-CT. לאחר 8 שבועות, צביעת HE הראתה שהעצם הטרבקולרית (אדומה) מתחת ללוחית הצמיחה של עצם הירך הדיסטלית של עכברים לאחר OVX הופחתה בהשוואה לקבוצת Sham, וכמעט ולא היה מבנה טרבקולרי עבה ברור, ומספר רב של גרגירים דמויי שומן הופיעו (איור 5A). בהתבסס על ניתוח כמותי של מקטעי רקמות, לעכברי OVX היה פחות שטח עצם טרבקולרית מאשר לעכברי Sham (איור 5B).
איור 1: צילום מסך של הממשק של שחזור נפח משנה. שחזור תת-נפח במלבן הירוק כדי להגיע עד 10 מיקרומטר בשדה ראייה של 5.12 מ"מ x 5.12 מ"מ (FOV). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: בניית מסיכת תמונה בשחור-לבן. (A1-A3): HE תמונות מקבוצת Sham (סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר). עצם trabeculae מוצגים בשחור בתוך האזור שנבחר ורקמות אחרות בלבן. (ב1-ב3) תמונות של קבוצת OVX (סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השוואה של פרמטרים מיקרו-מבניים של טרבקולה פמורלית דיסטלית בין קבוצות OVX ו-Sham . (A) היחס בין נפח העצם לנפח הרקמה הכולל (BV/TV [%]) בקבוצת OVX היה נמוך מזה שבקבוצת Sham. (ב) עובי הטרבקולרי (TB.Th [μm]) בעכברים של OVX היה נמוך יותר מאשר בקבוצת Sham. (C) ההפרדה הטרבקולרית (TB.sp [μm]) בעכברי OVX הייתה גדולה יותר מאשר בעכברי שאם. *P < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונות מיקרו-CT מייצגות של עצם הטרבקולר בעצם הירך הדיסטלית. בהשוואה לקבוצת (A) Sham, צפיפות העצם של עכברים לאחר כריתת שחלות (B) הראתה טרבקולה דלילה והראתה אוסטאופורוזיס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניתוח היסטולוגי של אזור העצם הטרבקולרית בעצם הירך הדיסטלית של קבוצות OVX ו-Sham. (A) תמונות מייצגות מוכתמות ב-HE, של עצם הירך הדיסטלית בכל קבוצה (סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר). חיצים שחורים מראים trabeculae. (B) ניתוח כמותי של אזור העצם הטרבקולרית של נפח הרקמה הכולל בהחזר ההשקעה שנבחר. *P < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| פרמטר | קבוצה המופעלת על ידי Sham (SHAM) (n = 5). |
קבוצת כריתת שחלות (OVX) (n = 5). |
ערך P |
| יחס נפח עצם לנפח רקמה כולל (%) | 7.3 ± 0.9 | 6.8 ± 0.5 | 0.012* |
| עובי טרבקולרי (μm) | 79.7 ± 5.5 | 85.9 ± 6.0 | 0.013* |
| היפרדות טרבקולרית (מיקרומטר) | 212.1 ± 8.7 | 249.4 ± 8.3 | 0.015* |
| ערכים הם הממוצע ± SD. * שונה באופן משמעותי (פ<0.05). |
|||
טבלה 1: פרמטרים של עצם טרבקולרית המוערכים ממיקרו-CT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אוסטאופורוזיס יכול להוביל לשברים תכופים, שהם יקרים, יכולים לגרום לכאב, נכות או אפילו מוות, ולהשפיע קשות על איכות החיים של חולים20. במהלך השנים הוכר מודל כריתת השחלות כאחת השיטות הסטנדרטיות לחקר אוסטאופורוזיס21. המודל הפרה-קליני הנפוץ ביותר בבעלי חיים לאוסטאופורוזיס הוא חולדה שעברה כריתת שחלות (OVX). למרות זאת, רוב המחקר על המנגנונים של הפרעות עצם, כולל אוסטאופורוזיס, נערך באמצעות עכברים22. כדי לבסס מודל אוסטאופורוזיס בעכברות C57/BL6J בוגרות, כריתת השחלות מבוצעת בגיל 12 שבועות, שהוא הזמן האופטימלי להליך זה. עכברים הם בוגרים ופוריים מגיל 8-12 שבועות, ולכריתת השחלות יש השפעה משמעותית על מסת העצם שלהם בשלב זה10. מחקרים קודמים הראו כי לפני 12 שבועות, עצמות העכברים גדלות במהירות, והאינדיקטורים של מורפולוגיה של העצם, BMD וביומכניקה של העצם עולים במהירות. ה-BMD הכולל וה-BMD של העצם בקליפת המוח נמצאים בקורלציה משמעותית עם גיל העכברים. עם זאת, לאחר 12 שבועות, חילוף החומרים של העצם של עכברים נכנס לתקופה יציבה, ואת האינדיקטורים לעיל נוטים להיות יציבים23,24.
מיקרו-ארכיטקטורה של העצם הוצעה כגורם העיקרי המשפיע על שבריריות העצם, ללא תלות ב-BMD. שבריריות העצם של אוסטאופורוזיס אינה מוסברת במלואה על ידי גירעון במסת העצם. BMD יכול להסביר רק 60%-70% מחוזק העצם25. במונחים של הרכב מבני, עצם קליפת המוח מהווה 80% ממסת העצם, בעוד עצם מבטלת מציגה רק 10% מהמדידות לאחר איבוד 50% ממסת העצם, דבר המצביע על כך שמדידות מסת עצם לבדן אינן מספיקות כדי להעריך את אובדן מסת העצם. בנוסף לנפח העצם, שינויים מבניים בטרבקולה של העצם הם קריטיים לחוזק העצם. עצם Cancellous מכיל רקמת מח עצם hematopoietic או רקמת שומן. פני השטח שלו גדולים למדי, בערך פי שמונה מזה של עצם קליפת המוח. שטח פנים גדול זה המחובר למח העצם מאפשר לעצם המבוטלת להיות בעלת שיעור המרת עצם גבוה למדי. לכן בחרנו את המיקרו-מבנה של עצם trabeculae כאינדיקטור העיקרי להתבוננות בשינויים אוסטיאופורוטיים. רקמת העצם הטרבקולרית בשלד עוברת כל הזמן שיפוץ במהלך הצמיחה, במהלכו טרבקולי עצם חדשים שנוצרו מחליפים את הקיימים ויוצרים עצם ספוגית משנית. לכן, בתנאים רגילים, ניתוח מורפומטרי של עצם טרבקולרית מתמקד בעיקר באזור העצם הספוגית המשנית. רקמת עצם ספוגית ראשונית, לעומת זאת, היא מבנה מולד ויציב יחסית שאינו משופץ ולכן יש להוציא אותו מהניתוח. בדרך כלל, העצם במרחק מסוים מצלחת הצמיחה יכולה להיחשב כשיפוץ רקמה פעיל. לכן, בחרנו אזור עניין (ROI) שמתחיל מ 540 מיקרומטר מעל צלחת הצמיחה ומשתרע על 1600 מיקרומטר בכיוון הפרוקסימלי לניתוח. על פי הממצאים שלנו, עכברים מפגינים מאפיינים מיקרו-מבניים שונים מאוד באזורים טרבקולריים לאחר כריתת השחלות.
טכנולוגיית Micro-CT המשמשת במחקר זה היא טכניקת הדמיה תלת ממדית לא הרסנית שפותחה בעשורים האחרונים ומיושמת בהדרגה במחקר הפרמקולוגי של צמחי מרפא אתנו-רפואיים. הוא מספק הבנה ברורה של המיקרו-מבנה הפנימי של הדגימה מבלי להרוס אותה. באשר לבדיקה ההיסטופתולוגית, שיטת שיבוץ השרף פוגעת בפעילות האנזים ובאנטיגניות החלבונים ולא ניתן להשתמש בה באופן אמין להיסטוכימיה או לאימונוהיסטוכימיה26. ניתן לשלב את שיבוץ הפרפין המסורתי עם טכניקות כגון אימונוהיסטוכימיה (IHC), הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) ומיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM) כדי לזהות כמותית חומרים בשפע נמוך ברקמת העצם ברמה המולקולרית, ובכך להשיג הבנה עמוקה יותר של המנגנונים והוויסות של חילוף החומרים בעצם. סורק השקופיות הפנורמי יכול להמיר במהירות שקופיות לתמונות דיגיטליות ברזולוציה גבוהה, מה שמאפשר לנתח כמותית נתוני היסטומורפולוגיית עצם באמצעות תוכנת מחשב. לסיכום, השילוב של מיקרו-CT והיסטומורפולוגיה של העצם יכול לספק הערכה מפורטת ומדויקת יותר של מיקרו-מבנה עצם.
באופן מסורתי, הערכת איכות העצם הוגבלה במידה רבה לספיגת קרני רנטגן באנרגיה כפולה (DXA), טומוגרפיה ממוחשבת ברזולוציה מוגבלת, או הדמיית תהודה מגנטית מאתגרת מבחינה טכנית27. למרות שלשילוב של שתי הטכניקות יש יתרונות ייחודיים, יש לו גם מגבלות. ראשית, למרות שמיקרו-CT מאפשר ניטור רציף ארוך טווח של אותה חיה, הדמיה in vivo של מיקרו-מבנים שלדיים בחיות קטנות חיות, במיוחד עכברים, עדיין מאתגרת מבחינה טכנית28. שנית, היעדר פרוטוקול מובנה ומוכר בינלאומית לרכישה וניתוח של נתונים ממכשירים או משתמשים שונים מקשה על השוואת מערכי נתונים ושחזור תוצאות מחקר בין מחקרים. שלישית, בשל המאפיינים של Micro-CT, חשיפה לקרינה מייננת היא בלתי נמנעת. רביעית, למרות שהפרוטוקול הפשוט והחסכוני שלנו יכול לספק ניתוח כמותי של תמונות עצם מוכתמות HE, הוא מבוסס בעיקר על אסטרטגיית סגמנטציה חצי אוטומטית, שהיא מייגעת יותר משיטות אוטומטיות מורכבות.
לסיכום, היישום של טכנולוגיה זו יביא ללא ספק תנופה גדולה לחקר אוסטאופורוזיס באתנורפואה במהלך תהליך החיפוש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המנהל המחוזי של סצ'ואן לרפואה סינית מסורתית (2021YJ0175) ופרויקט חדשנות המחקר לתארים מתקדמים של בית הספר לרפואה קלינית (LCYJSKT2023-11), אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
| Ammonia Solution | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anatomical Forceps | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J3C030 | |
| Anhydrous Ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Automatic Dyeing Machine | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
| Bone Microarchitecture Analysis Add-on | AnalyzeDirect, Inc | ||
| C57BL/6J mice | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Carrier Slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Coverslips | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Decalcification Solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Delicate Scissors | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | ZJA010 | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fiji: ImageJ | National Institutes of Health, USA | ||
| Film Sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| Freezing Table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| H&E Staining Kit | Leagene | DH0020 | |
| Hydrochloric Acid Solution | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| ImageJ2 Plugin | BoneJ 7.0.16 | ||
| Medical Gauze | Shandong Ang Yang Medical Technology Co. | ||
| Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures | Ethicon, Inc. | SA84G | |
| Needle Holder | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J32010 | |
| Neutral Balsam | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| PANNORAMIC Digital Slide Scanners | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Povidone-iodine solution 5% | Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Quantum GX2 microCT Imaging System | PerkinElmer, Inc. | ||
| Rotary Microtome | Thermo scientific | HM325 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Scan & Browse Software | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
| Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves | Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd | 22B141EO | |
| Sodium Chloride Solution 0.9% | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Sterile Hypodermic Syringes for Single Use | Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd | ||
| Sterile Medical Suture Needles | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | PW8068 | |
| Tissue Processor | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Tissue Spreading and Baking Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Tribromoethanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M2920 | |
| Wax Trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Wang, J., et al. The prevalence of osteoporosis in China, a community based cohort study of osteoporosis. Frontiers in Public Health. 11, 1084005 (2023).
- Stein, M., et al. Why animal experiments are still indispensable in bone research: A statement by the European Calcified Tissue Society. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (8), 1045-1061 (2023).
- Kerschan-Schindl, K., Papageorgiou, M., Föger-Samwald, U., Butylina, M., Weber, M., Pietschmann, P. Assessment of bone microstructure by micro CT in C57BL/6J mice for sex-specific differentiation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 14585 (2022).
- Fonseca, H., Moreira-Gonçalves, D., Coriolano, H. J. A., Duarte, J. A. Bone quality: the determinants of bone strength and fragility. Sports Medicine. 44, 37-53 (2014).
- Bouxsein, M. L., Boyd, S. K., Christiansen, B. A., Guldberg, R. E., Jepsen, K. J., Müller, R. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Akhter, M. P., Recker, R. R. High resolution imaging in bone tissue research-review. Bone. 143, 115620 (2021).
- Mys, K., et al. Quantification of 3D microstructural parameters of trabecular bone is affected by the analysis software. Bone. 142, 115653 (2021).
- Chavassieux, P., Chapurlat, R. Interest of bone histomorphometry in bone pathophysiology investigation: Foundation, present, and future. Frontiers in Endocrinology. 13, 907914 (2022).
- Komori, T.
- Zhu, S., et al. Ovariectomy-induced bone loss in TNFα and IL6 gene knockout mice is regulated by different mechanisms. Journal of Molecular Endocrinology. 60 (3), 185-198 (2018).
- Baum, T., et al. Osteoporosis imaging: effects of bone preservation on MDCT-based trabecular bone microstructure parameters and finite element models. BMC Medical Imaging. 15, 22 (2015).
- Nazarian, A., Hermannsson, B. J., Muller, J., Zurakowski, D., Snyder, B. D. Effects of tissue preservation on murine bone mechanical properties. Journal of Biomechanics. 42 (1), 82-86 (2009).
- Martín-Badosa, E., Amblard, D., Nuzzo, S., Elmoutaouakkil, A., Vico, L., Peyrin, F. Excised bone structures in mice: imaging at three-dimensional synchrotron radiation micro CT. Radiology. 229 (3), 921-928 (2003).
- Egan, K. P., Brennan, T. A., Pignolo, R. J. Bone histomorphometry using free and commonly available software. Histopathology. 61 (6), 1168-1173 (2012).
- Brandi, M. L. Microarchitecture, the key to bone quality. Rheumatology. 48 (suppl_4), iv3-iv8 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Domander, R., Felder, A. A., Doube, M.
- Parfitt, A. M., et al. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units: report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. Journal of Bone and Mineral Research. 2 (6), 595-610 (1987).
- Kazama, J. J., Koda, R., Yamamoto, S., Narita, I., Gejyo, F., Tokumoto, A. Cancellous bone volume is an indicator for trabecular bone connectivity in dialysis patients. Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 5 (2), 292-298 (2010).
- Watts, N. B. Postmenopausal osteoporosis: A clinical review. Journal of Women's Health. 27 (9), 1093-1096 (2018).
- Thompson, D. D., Simmons, H. A., Pirie, C. M., Ke, H. Z. FDA Guidelines and animal models for osteoporosis. Bone. 17 (4), S125-S133 (1995).
- Iwaniec, U. T., Yuan, D., Power, R. A., Wronski, T. J. Strain-dependent variations in the response of cancellous bone to ovariectomy in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (7), 1068-1074 (2006).
- Ferguson, V. L., Ayers, R. A., Bateman, T. A., Simske, S. J. Bone development and age-related bone loss in male C57BL/6J mice. Bone. 33 (3), 387-398 (2003).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (8), 1197-1207 (2007).
- Seeman, E. The structural and biomechanical basis of the gain and loss of bone strength in women and men. Endocrinology and Metabolism Clinics. 32 (1), 25-38 (2003).
- Ticha, P., et al. A novel cryo-embedding method for in-depth analysis of craniofacial mini pig bone specimens. Scientific Reports. 10 (1), 19510 (2020).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology. 47 (suppl_4), iv9-iv16 (2008).
- Zaw Thin, M., Moore, C., Snoeks, T., Kalber, T., Downward, J., Behrens, A. Micro-CT acquisition and image processing to track and characterize pulmonary nodules in mice. Nature Protocols. 18 (3), 990-1015 (2023).
