Summary
このプロトコルはヘマトキシリンEosin (HE)の汚損およびマイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)の技術の結合によって骨粗しょう症のマウス モデルの骨のmicroarchitectureの量的な評価のための経済的で、有効な方法を示す。
Abstract
骨の微細構造とは、顕微鏡レベルでの骨組織の配置と質を指します。骨格の骨微細構造を理解することは、骨粗鬆症の病態生理学への洞察を得て、その治療を改善するために重要です。ただし、骨サンプルの取り扱いは、硬くて密度の高い特性のために複雑になる可能性があります。第二に、専用のソフトウェアが画像処理と分析を困難にします。このプロトコルでは、海綿骨の微細構造解析のための費用対効果が高く使いやすいソリューションを紹介します。詳細な手順と注意事項が記載されています。マイクロCTは、海綿骨構造の高解像度画像を提供する非破壊3次元(3D)イメージング技術です。骨質を客観的かつ定量的に評価できるため、骨質評価のゴールドスタンダード手法として広く認められています。しかし、組織球計測は、骨標本の2次元(2D)評価と3D評価の間のギャップを埋める重要な細胞レベルのパラメータを提供するため、依然として不可欠です。組織学的手法に関しては、骨組織を脱灰してから、従来のパラフィン包埋を行うことを選択しました。要約すると、これら2つの方法を組み合わせることで、骨の微細構造に関するより包括的で正確な情報を得ることができます。
Introduction
骨粗鬆症は、特に高齢者に蔓延する代謝性骨疾患であり、脆弱性骨折のリスク増加と関連しています。中国で骨粗鬆症が蔓延するにつれて1、小動物の骨構造を研究する需要が高まるでしょう2,3。骨量減少を測定する以前の方法は、2次元二重エネルギーX線吸収測定の結果に依存しています。しかし、これでは骨格強度の重要な要素である海綿骨の構造微細構造の変化を捉えることはできません4。骨の微細構造は、その強度、剛性、および骨折抵抗に影響を与えます。正常状態と病理状態の骨マイクロアーキテクチャを比較することにより、骨粗鬆症によって引き起こされる骨組織の形態、構造、および機能の変化を特定できます。この情報は、骨粗鬆症の発症と他の疾患との関連を理解するのに役立ちます。
マイクロコンピュータ断層撮影(Micro-CT)イメージングは、骨の体積分率、厚さ、分離などの骨構造と密度パラメータに関する正確で包括的なデータを提供できる、骨形態評価のための最近の一般的な技術となっています5,6。同時に、マイクロCTの結果は、解析ソフトウェア7によって影響を受ける可能性がある。画像の取得、評価、およびレポート作成のさまざまな方法は、さまざまな市販のマイクロCTシステムで使用されています。この不一致により、異なる研究によって報告された結果を比較して解釈することが困難になります5。また、現在のところ、骨格系の細胞レベルのパラメータに関する情報を研究者に提供する上で、骨組織形成術に取って代わることはできません8。一方、組織学的手法により、骨の顕微鏡的形態を直接観察および測定することができます。ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色は、細胞や組織の一般的な構造を可視化するために組織学で使用される一般的な染色技術です。これは、骨組織とそのマイクロアーキテクチャの存在を特定するために使用されます。
本稿では、骨粗鬆症マウスモデルにおいて、マイクロCTと組織スライス技術(ヘマトキシリン-エオシン[HE]染色)を組み合わせて骨組織画像を収集し、海綿骨の定量的解析を行い、骨粗鬆症マウスモデルにおける骨微細構造の変化を評価します。
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Protocol
動物プロトコルは、成都中医薬大学の動物倫理委員会によって承認されています(記録番号:2020-34)。雌のC57BL/6Jマウス(12週齢、n=14)を、偽手術群(偽群、n=7)とモデル群(OVX群、n=7)の2群に無作為に分けた。動物は商業供給業者から購入しました( 材料表を参照)。すべてのマウスを22〜26°C、湿度45%〜55%の個別のケージに入れ、新しい環境に1週間適応させ、水と餌を自由に摂取できるようにしました。すべての動物実験研究は成都中医薬大学で実施され、動物の苦痛を最小限に抑えるためにあらゆる努力が払われました。
1. 動物モデル作製
- 1.25%アベルチン(tert-アミルアルコール中のトリブロモエタノール、 材料表を参照)を0.02 mL / gの投与量で腹腔内注射により、12週齢のマウスに麻酔をかけます。.マウスを滅菌手術台にうつ伏せに置き、手足をしっかりとテーピングして固定します。
- はさみ( 材料表を参照)を使用して、外科手術に影響を与える可能性のある髪の毛をトリミングします。
注意: 手術部位を準備している間は、皮膚の損傷を避けることをお勧めします。 - 手をよく洗い、手術用手袋を着用してください。マウスの背中をポビドンヨードで3回消毒し(材料表を参照)、医療用ガーゼ(材料表を参照)を使用して乾かします。
注:注意してください。消毒中に毛を濡らしすぎると、マウスの術後低体温症につながる可能性があります。 - メスを使用して、マウスの背中の正中線の3分の1から1 cm離れた場所に、長さ約0.5〜1.0 cmの切開を行います( 材料表を参照)。筋膜をそっと分離し、卵巣が見えるまで組織ハサミ( 材料表を参照)で筋肉を切り取ります。周囲の血管を非吸収性縫合糸で結紮し( 材料表を参照)、卵巣を摘出します。
- 0.9%生理食塩水を使用して空洞をすすぎ、皮膚、筋肉、筋膜を別々に縫合します( 材料表を参照)。
- 反対側で同じ手順を繰り返します。
- 卵巣と同じ大きさの卵巣周囲脂肪を除去し、残りのステップで上記と同じ手術手順を実行して、偽手術モデルを確立します。
- 手術後1週間の回復期間を目安にしてください。8週間後、骨粗鬆症マウスモデルが正常に確立されます9,10。
2. マイクロCTスキャン
- 過剰なCO2 吸入によりマウスを安楽死させる。安楽死後、マウスの大腿骨からできるだけ多くの軟部組織を切除し、スキャン用の新鮮なサンプルを採取します。
注:サンプル保存のための完璧なソリューションはありませんが、マイクロCTスキャン結果の品質を最大限に高めるために、特定の手順を踏むことができます。固定する前に、周囲の組織をできるだけ取り除くように注意してください。ホルマリンまたは緩衝ホルマリンは、PBS11,12に保存して固定する最も好ましい方法です。 - デスクトップのマイクロCTイメージングシステムソフトウェアアイコンをダブルクリックして、システムを起動します( 材料表を参照)。18 mm x 18 mmのサンプル視野(FOV)に対応したサンプルベッドを選択してください。適切なサンプルベッドを機械にセットし、ハッチを閉じます。
- コントロールパネルのウォームアップボタンをクリックします。
注意: 短いウォームアップ時間が必要でした。X線発生中はハッチを開かないでください。フロントパネルとコンピュータモニタのX 線点灯 ライトをチェックして、X線が発生しているかどうかを確認します。 - メニューボタンをクリックして新しいデータベースを設定し、新しいサンプルを作成して調査します。
- [メニュー]ドロップダウンリストから[手動]を選択し、コントロールパネルにカスタム電圧と電流の値を入力します。電圧 (kV) を 90 に、電流 (μA) を 80 に、スキャン モードを 高解像度、14 分、FOV (mm) を 18 mm x 18 mm に設定します。
注意: 適切なパラメータを設定するには、さまざまなマイクロCTシステムのマニュアルを参照してください。 - サンプルベッドにプラスチックフィルムで骨をしっかりと配置します。ハッチを閉じます。本機の調整ボタンを押して、被写体がX-captureウィンドウの中央に正確に収まるようにします。
注意: サンプルの調整は、誤って機械に落ちないように、ゆっくりと穏やかに行う必要があります。 - [ 開始 ]ボタンをクリックして、CTスキャンを開始します。
3. CTデータ解析
- ソフトウェア( 材料表を参照)に入り、解析するデータを選択します。[ サブ] をクリックし、[ ピクセル サイズ ] を 10 μm に設定します。関心領域(ROI)を移動してサイズを変更し、成長プレートの上の大腿骨遠位部を含めます。[ スタート ]をクリックします( 図1を参照)。
注:以前の研究からの組織学的データに基づいて、画像小柱の厚さは約20〜30μmと推定されたため、サブボリューム再構成ピクセルサイズは10μmで選択されました13。信号対雑音比がデータ処理に不十分な場合は、高解像度の1時間スキャンを実行する必要があります。 - [ 解析 3D ] ボタンをクリックして、結果の 3D 再構成を取得します。
- マイクロCTシステムからコンピューターにデータをエクスポートして分析します。
- 再構成したCTデータをインポートします。 「イメージ>演算を処理」をクリックしてから、「 インタラクティブ>領域パッド」をクリックします。黄色のチェックボックスを適切なROIに調整します。
注:関心領域(ROI)は、成長板の近位約540μmから始まり、近位に1600μm伸びて、実際の骨代謝とリモデリングを評価します。 - Bone Microarchitecture Analysis (BMA) アドオンを選択します ( 材料表を参照)。 [Segment Cortex ] をクリックし、次に [Segment Trabeculae] をクリックします。
注:小柱骨と皮質骨の両方が自動的に選択されます。通常、手動調整は必要ありません。 - [ Save Final Object Map ] をクリックし、 次に [Measure Bone ] をクリックして、ボーン モルフォメトリック インデックスを計算します。
注:対照が追加されていないため、ここでは相対骨塩密度(BMD)のみが計算されました。
4.骨組織の脱灰
- 骨標本を4%パラホルムアルデヒド( 材料表参照)で24時間固定します。試料をPBS( 材料表参照)で3回、毎回20分間洗浄します。
- ティッシュを蒸留水で3回、毎回20分間すすぎます。組織をEDTAを含む脱灰溶液( 材料表を参照)に移し、エンドポイントまで毎週溶液を交換して30日間脱灰します。
注:針刺し、手でつまむ、およびクランプは、骨組織が柔らかくなったとき、またはニードリング時に抵抗感がなくなったときに脱灰を終了するために使用されます。物理的な検出方法では、組織構造に損傷を与える可能性があるため、過度の力や繰り返しの検査は避けてください。 - 固定液から組織を取り出し、メスを使用してドラフトで組織をトリミングします。トリミングしたティッシュと対応するラベルを脱水ボックスに入れます。
- 脱水ボックスをバスケットに入れ、グラジエントアルコール(75%エタノールで4時間、85%エタノールで2時間、90%エタノールで2時間、95%エタノールで1時間、無水エタノールで30分、無水エタノールII.を30分、キシレンIで5〜10分)で組織処理装置( 材料表を参照)で脱水します。 キシレンIIを5〜10分、ワックスIを1時間、ワックスIIを1時間、ワックスIIIを1時間)。
- 包埋機( 材料表を参照)を使用して、ワックスに浸した組織を埋め込みます。溶かしたワックスを包埋ボックスに注ぎ、ワックスが固まる前に脱水ボックスからティッシュを置きます。
- 包埋面に合わせて組織を方向付け、対応するラベルを貼り付けます。-20°Cの冷凍テーブルで冷却します( 材料表を参照)。固化後、ワックスブロックを包埋ボックスから取り出し、必要に応じてワックスブロックをトリミングします( 材料表を参照)。
- トリミングしたワックスブロックをミクロトーム上で厚さ3 μmのスライドにカットします( 材料表を参照)。スライドをティッシュ散布機( 材料表参照)の40°Cの温水に浮かべて組織を平らにし、スライドですくい上げます。
- 60°Cのオーブン( 材料表を参照)で、水分が蒸発してワックスが溶けるまで焼きます。後で使用するために取り出して室温(RT)で保管してください。
5. HE染色
- スライドをキシレンIに20分間入れ、次にキシレンIIに20分間入れます。さらに、スライドを無水エタノールIと無水エタノールIIにそれぞれ5分間、75%アルコールに5分間入れた後、スライドを水道水で洗浄します( 材料表を参照)。
- ヘマトキシリン( 材料表を参照)中で3〜5分間インキュベートします。塩酸溶液で試料を区別します( 材料表を参照)。スライドをアンモニア溶液( 材料表を参照)で処理して青くしてから、スライドを水で洗浄します。
- スライドを85%、95%グラジエントアルコールに浸して脱水し、エオシン溶液( 材料表を参照)で5分間染色します。
- スライドを無水エタノールIに5分間、無水エタノールIIに5分間、無水エタノールIIIに5分間入れます。スライドをキシレンIで5分間、キシレンIIで5分間処理し、中性バルサムでマウントします( 材料表を参照)。
- 各スライドを顕微鏡で調べます。次に、パノラマスキャン用の代表的なスライスを選択します( 材料表を参照)。
注:各サンプルには、少なくとも3つの連続したスライスが必要です。パノラマスキャンの前に、スライスを顕微鏡で検査して、スライスが完全で鮮明であることを確認する必要があります。骨髄腔、皮質骨、海綿骨が完全に表示され、さまざまな種類の骨細胞が見えることを確認します。
6. HE画像解析
- CaseViewerソフトウェアでHE画像を開きます( 材料表を参照)。スライド上の関心領域 (ROI) を選択し、カラー画像として保存します。
注:ROIの選択は、上記のソフトウェアと一致しています。 - ImageJ で画像を開きます ( 材料表を参照)。ツールバーから ワンド ツールを選択します。海綿骨をクリックします。
- 必要に応じて、許容値と連続した設定を調整します。 Image > Adjustments > Black & White に移動し、 OK をクリックします。骨の他の領域についても手順を繰り返します。
- 選択範囲を反転し、白色で塗りつぶします。画像を解析用のマスクとして保存します (図 2 を参照)。
注:詳細な方法論については、以前に公開された作業14を参照してください。 - 解析ソフトウェア15、16 でマスクを開く( 材料表参照)。 [バイナリ>処理 > バイナリを作成] を実行して 、カラー イメージをバイナリ イメージに変換します。
- ソフトウェアのプラグイン17(材料表を参照)を使用して、構造パラメータを分析します:Run Area/Volume Fractionを使用して、骨の総体積に対する骨の体積を計算します(BV/TV [%])18,19。
注:この方法は、骨小柱と骨髄に適用でき、HE画像のROI全体を埋めます。
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Representative Results
マイクロCT解析
両群のマウスで線維柱帯の微細構造パラメータを測定し、その平均値とSDを表1に報告した。各グループ内のいくつかのパラメータ(すなわち、総組織体積に対する骨体積の比率、海綿の厚さ、線維柱帯の分離)の分布を図3に示します。
これらの結果は、マイクロCTから推定されたいくつかのパラメータについて、OVX群と偽群のマウス間で有意差があることを示している。すなわち、OVX群の骨容積と総組織容積(BV/TV)の比率は、Sham群よりも3%低かった。OVXのマウスの小柱の厚さは、Shamグループのマウスよりも低く、相対的な差の割合は39.3%でした。OVXマウスの線維柱帯分離は、偽マウスのそれよりも大きかった。 図4 は、各グループの再建された骨量から抽出された小柱ROIの3D表示を示しています。卵巣摘出術後のマウスの骨密度は、Sham群(図4A)と比較して、小柱はまばらで、骨粗鬆症を示しました(図4B)。
HE染色分析
また、病理組織学的解析により、マイクロCT解析で認められた変化が確認されました。8週間後のHE染色では、OVX後のマウス大腿骨遠位部の成長板下の小柱骨(赤色)がSham群と比較して縮小し、明らかな厚い小柱構造がほとんどなく、脂肪様顆粒が多数出現したことが示された(図5A)。組織切片の定量分析に基づくと、OVXマウスは偽マウスよりも海綿骨面積が小さかった(図5B)。
図1:サブボリューム再構築のインターフェースのスクリーンショット。 5.12 mm x 5.12 mmの視野(FOV)で10 μmまで下がった緑色の長方形のサブボリューム再構成。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:白黒の画像マスク構成。 (A1-A3):HE Shamグループの画像(スケールバー=200μm)。骨小柱は、選択した領域内で黒で表示され、他の組織は白で表示されます。(B1-B3)OVX群の画像(スケールバー=200μm)。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:OVX群とSham群の遠位大腿骨小柱の微細構造パラメータの比較。 (A)OVX群の骨体積と全組織体積(BV/TV[%])の比率は、Sham群よりも低かった。(イ)OVXのマウスの線維柱帯の厚さ(TB.Th[μm])は、Sham群よりも低かった。(C)OVXマウスの線維柱帯分離(TB.sp[μm])は、偽マウスよりも大きかった。*P < 0.05です。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:大腿骨遠位部の海綿骨の代表的なマイクロCT画像。卵巣摘出術後のマウスの骨密度は、(A)偽群と比較して、まばらな小柱を示し、骨粗鬆症を示した。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:OVX群と偽群の大腿骨遠位部の海綿骨領域の組織学的分析。 (A)各群の大腿骨遠位端の代表的なHE染色画像(スケールバー=500μm)。黒い矢印は小柱を示しています。(B) 選択したROIの総組織体積の海綿骨面積の定量的分析。*P < 0.05です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| パラメーター | 偽運営グループ(SHAM) (n = 5) です。 |
卵巣摘出群(OVX) (n = 5) です。 |
P 値 |
| 骨容積対総組織体積比(%) | 7.3 ± 0.9 | 4.2 ± 0.5 | 0.012* |
| 海綿の厚さ(μm) | 79.5 ± 5.5 | 53.4 ± 6.0 | 0.013* |
| 小柱分離(μm) | 212.5 ± 8.7 | 249.4 ± 8.3 | 0.015* |
| 値は SD ±平均です。 *有意に異なる(P<0 .05)。 |
|||
表1:マイクロCTから推定された海綿骨パラメータ。
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Discussion
骨粗鬆症は頻繁な骨折につながる可能性があり、費用がかかり、痛み、障害、さらには死を引き起こす可能性があり、患者の生活の質に深刻な影響を与える可能性があります20。何年にもわたって、卵巣摘出術モデルは骨粗鬆症を研究するための標準的な方法の1つとして認識されてきました21。骨粗鬆症の最も一般的な前臨床動物モデルは、卵巣摘出術(OVX)ラットです。それにもかかわらず、骨粗鬆症を含む骨障害のメカニズムに関する研究の大部分は、マウスを用いて行われてきた22。成体雌のC57/BL6Jマウスで骨粗鬆症モデルを確立するために、卵巣摘出術は、この手順に最適な時期である12週齢で行われます。マウスは8〜12週齢で成熟し、受胎可能であり、卵巣摘出術はこの時点で骨量に大きな影響を与えます10。以前の研究では、12週前にマウスの骨が急速に成長し、骨の形態、BMD、および骨の生体力学の指標が急速に増加することが示されています。総BMDと皮質骨BMDは、マウスの年齢と有意な相関がある。しかし、12週間後、マウスの骨代謝は安定期に入り、上記の指標は安定する傾向がある23,24。
骨マイクロアーキテクチャは、BMDとは無関係に、骨の脆弱性に影響を与える主要な要因として提案されています。骨粗鬆症の骨の脆弱性は、骨量の不足によって完全には説明できません。BMDは骨強度の60%〜70%しか説明できません25。構造組成の面では、皮質骨は骨量の80%を占めているのに対し、海綿骨は骨量の50%を失った後の測定値の10%しか示さず、骨量測定だけでは骨量減少を評価するのに十分ではないことを示唆しています。骨の体積に加えて、骨小柱の構造変化は骨の強度にとって重要です。海綿骨には、造血骨髄組織または脂肪組織が含まれます。その表面は非常に大きく、皮質骨の約8倍の大きさです。骨髄に接続されたこの大きな表面積により、海綿骨はかなり高い骨変換率を持つことができます。そのため、骨粗鬆症の変化を観察するための主要な指標として骨小柱の微細構造を選択しました。骨格の小柱骨組織は、成長中に絶えずリモデリングを受けており、その間に新しく形成された骨小柱が既存の骨小柱に置き換わり、二次海綿状骨を形成します。したがって、通常の状態では、海綿骨の形態解析は主に二次海綿骨領域に焦点を当てています。一方、一次海綿状骨組織は、先天的に存在し、比較的安定した構造であり、リモデリングされていないため、分析から除外する必要があります。一般に、成長板から一定の距離内にある骨は、積極的にリモデリング組織と見なすことができる。そこで、成長板の上方540μmから始まり、近位方向に1600μmに及ぶ関心領域(ROI)を解析用に選択しました。私たちの発見によると、マウスは卵巣摘出術後の小柱領域で非常に異なる微細構造特性を示します。
本研究で用いたマイクロCT技術は、ここ数十年で開発された非破壊3Dイメージング技術であり、民族薬草の薬理学的研究に徐々に適用されつつあります。これにより、サンプルを破壊することなく、サンプルの内部微細構造を明確に理解できます。病理組織学的検査に関しては、樹脂包埋法は酵素活性やタンパク質抗原性を損ない、組織化学や免疫組織化学に確実に用いることができない26。従来のパラフィン包埋法は、免疫組織化学(IHC)、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)、共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)などの技術と組み合わせることで、骨組織中の微量物質を分子レベルで定量的に検出し、骨代謝のメカニズムと制御をより深く理解することができます。パノラマスライドスキャナーは、スライドを高解像度のデジタル画像に迅速に変換できるため、コンピューターソフトウェアを使用して骨の組織形態データを定量的に分析できます。要約すると、マイクロCTと骨組織形態学の組み合わせにより、骨の微細構造をより詳細かつ正確に評価することができます。
従来、骨の質の評価は、主に二重エネルギーX線吸収測定法(DXA)、限られた解像度のコンピュータ断層撮影、または技術的に困難な磁気共鳴画像法に限定されていました27。この 2 つの手法の組み合わせには独自の利点がありますが、限界もあります。第一に、マイクロCTは同一動物の長期連続モニタリングを可能にするが、生きた小動物、特にマウスの骨格微細構造のin vivoイメージングは、依然として技術的に困難である28。第二に、さまざまな機器やユーザーからデータを取得および分析するための構造化された国際的に認められたプロトコルがないため、データセットを比較し、研究間で研究結果を再現することが困難になります。第三に、マイクロCTの特性上、電離放射線への曝露は避けられません。第 4 に、当社のシンプルで経済的なプロトコルは、HE染色された骨画像の定量的分析を提供できますが、主に半自動セグメンテーション戦略に基づいており、複雑な自動化方法よりも手間がかかります。
結論として、この技術の応用は、探索プロセス中の民族医学における骨粗鬆症研究に大きな推進力をもたらすことは間違いありません。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
この研究は、四川省中医薬管理局(2021YJ0175)および成都中医薬大学臨床医学院(LCYJSKT2023-11)の大学院研究革新プロジェクトの支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
| Ammonia Solution | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anatomical Forceps | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J3C030 | |
| Anhydrous Ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Automatic Dyeing Machine | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
| Bone Microarchitecture Analysis Add-on | AnalyzeDirect, Inc | ||
| C57BL/6J mice | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Carrier Slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Coverslips | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Decalcification Solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Delicate Scissors | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | ZJA010 | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fiji: ImageJ | National Institutes of Health, USA | ||
| Film Sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| Freezing Table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| H&E Staining Kit | Leagene | DH0020 | |
| Hydrochloric Acid Solution | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| ImageJ2 Plugin | BoneJ 7.0.16 | ||
| Medical Gauze | Shandong Ang Yang Medical Technology Co. | ||
| Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures | Ethicon, Inc. | SA84G | |
| Needle Holder | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J32010 | |
| Neutral Balsam | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| PANNORAMIC Digital Slide Scanners | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Povidone-iodine solution 5% | Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Quantum GX2 microCT Imaging System | PerkinElmer, Inc. | ||
| Rotary Microtome | Thermo scientific | HM325 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Scan & Browse Software | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
| Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves | Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd | 22B141EO | |
| Sodium Chloride Solution 0.9% | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Sterile Hypodermic Syringes for Single Use | Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd | ||
| Sterile Medical Suture Needles | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | PW8068 | |
| Tissue Processor | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Tissue Spreading and Baking Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Tribromoethanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M2920 | |
| Wax Trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Wang, J., et al. The prevalence of osteoporosis in China, a community based cohort study of osteoporosis. Frontiers in Public Health. 11, 1084005 (2023).
- Stein, M., et al. Why animal experiments are still indispensable in bone research: A statement by the European Calcified Tissue Society. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (8), 1045-1061 (2023).
- Kerschan-Schindl, K., Papageorgiou, M., Föger-Samwald, U., Butylina, M., Weber, M., Pietschmann, P. Assessment of bone microstructure by micro CT in C57BL/6J mice for sex-specific differentiation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 14585 (2022).
- Fonseca, H., Moreira-Gonçalves, D., Coriolano, H. J. A., Duarte, J. A. Bone quality: the determinants of bone strength and fragility. Sports Medicine. 44, 37-53 (2014).
- Bouxsein, M. L., Boyd, S. K., Christiansen, B. A., Guldberg, R. E., Jepsen, K. J., Müller, R. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Akhter, M. P., Recker, R. R. High resolution imaging in bone tissue research-review. Bone. 143, 115620 (2021).
- Mys, K., et al. Quantification of 3D microstructural parameters of trabecular bone is affected by the analysis software. Bone. 142, 115653 (2021).
- Chavassieux, P., Chapurlat, R. Interest of bone histomorphometry in bone pathophysiology investigation: Foundation, present, and future. Frontiers in Endocrinology. 13, 907914 (2022).
- Komori, T.
- Zhu, S., et al. Ovariectomy-induced bone loss in TNFα and IL6 gene knockout mice is regulated by different mechanisms. Journal of Molecular Endocrinology. 60 (3), 185-198 (2018).
- Baum, T., et al. Osteoporosis imaging: effects of bone preservation on MDCT-based trabecular bone microstructure parameters and finite element models. BMC Medical Imaging. 15, 22 (2015).
- Nazarian, A., Hermannsson, B. J., Muller, J., Zurakowski, D., Snyder, B. D. Effects of tissue preservation on murine bone mechanical properties. Journal of Biomechanics. 42 (1), 82-86 (2009).
- Martín-Badosa, E., Amblard, D., Nuzzo, S., Elmoutaouakkil, A., Vico, L., Peyrin, F. Excised bone structures in mice: imaging at three-dimensional synchrotron radiation micro CT. Radiology. 229 (3), 921-928 (2003).
- Egan, K. P., Brennan, T. A., Pignolo, R. J. Bone histomorphometry using free and commonly available software. Histopathology. 61 (6), 1168-1173 (2012).
- Brandi, M. L. Microarchitecture, the key to bone quality. Rheumatology. 48 (suppl_4), iv3-iv8 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Domander, R., Felder, A. A., Doube, M.
- Parfitt, A. M., et al. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units: report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. Journal of Bone and Mineral Research. 2 (6), 595-610 (1987).
- Kazama, J. J., Koda, R., Yamamoto, S., Narita, I., Gejyo, F., Tokumoto, A. Cancellous bone volume is an indicator for trabecular bone connectivity in dialysis patients. Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 5 (2), 292-298 (2010).
- Watts, N. B. Postmenopausal osteoporosis: A clinical review. Journal of Women's Health. 27 (9), 1093-1096 (2018).
- Thompson, D. D., Simmons, H. A., Pirie, C. M., Ke, H. Z. FDA Guidelines and animal models for osteoporosis. Bone. 17 (4), S125-S133 (1995).
- Iwaniec, U. T., Yuan, D., Power, R. A., Wronski, T. J. Strain-dependent variations in the response of cancellous bone to ovariectomy in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (7), 1068-1074 (2006).
- Ferguson, V. L., Ayers, R. A., Bateman, T. A., Simske, S. J. Bone development and age-related bone loss in male C57BL/6J mice. Bone. 33 (3), 387-398 (2003).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (8), 1197-1207 (2007).
- Seeman, E. The structural and biomechanical basis of the gain and loss of bone strength in women and men. Endocrinology and Metabolism Clinics. 32 (1), 25-38 (2003).
- Ticha, P., et al. A novel cryo-embedding method for in-depth analysis of craniofacial mini pig bone specimens. Scientific Reports. 10 (1), 19510 (2020).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology. 47 (suppl_4), iv9-iv16 (2008).
- Zaw Thin, M., Moore, C., Snoeks, T., Kalber, T., Downward, J., Behrens, A. Micro-CT acquisition and image processing to track and characterize pulmonary nodules in mice. Nature Protocols. 18 (3), 990-1015 (2023).
