Summary
Detta protokoll presenterar en ekonomisk och effektiv metod för kvantitativ utvärdering av benmikroarkitektur i en musmodell av osteoporos genom att kombinera hematoxylin-eosin (HE) färgning och mikrodatortomografi (Micro-CT) tekniker.
Abstract
Benmikrostruktur avser benvävnadens arrangemang och kvalitet på mikroskopisk nivå. Att förstå skelettets benmikrostruktur är avgörande för att få insikt i patofysiologin vid osteoporos och förbättra dess behandling. Att hantera benprover kan dock vara komplicerat på grund av deras hårda och täta egenskaper. För det andra gör specialiserad programvara bildbehandling och analys svår. I detta protokoll presenterar vi en kostnadseffektiv och lättanvänd lösning för analys av trabekulär benmikrostruktur. Detaljerade steg och försiktighetsåtgärder tillhandahålls. Micro-CT är en icke-destruktiv tredimensionell (3D) avbildningsteknik som ger högupplösta bilder av trabekulär benstruktur. Det möjliggör objektiv och kvantitativ utvärdering av benkvalitet, vilket är anledningen till att det allmänt betraktas som guldstandardmetoden för bedömning av benkvalitet. Hitomorfometri är dock fortfarande oumbärlig eftersom den erbjuder viktiga parametrar på cellnivå, vilket överbryggar klyftan mellan tvådimensionella (2D) och 3D-bedömningar av benprover. När det gäller de histologiska teknikerna valde vi att avkalka benvävnaden och sedan utföra traditionell paraffininbäddning. Sammanfattningsvis kan en kombination av dessa två metoder ge mer omfattande och exakt information om benets mikrostruktur.
Introduction
Osteoporos är en utbredd metabolisk bensjukdom, särskilt bland äldre, och är förknippad med en ökad risk för skörhetsfrakturer. I takt med att osteoporos blir vanligare i Kina1 kommer det att finnas en växande efterfrågan på att studera benstrukturerna hos smådjur 2,3. De tidigare metoderna för att mäta benförlust bygger på resultaten av tvådimensionell dubbelenergiröntgenabsorptiometri. Detta fångar dock inte förändringarna i det trabekulära benets arkitektoniska mikrostruktur, som är en nyckelfaktor för skelettets styrka4. Benets mikrostruktur påverkar dess styrka, styvhet och brottmotstånd. Genom att jämföra benets mikroarkitektur i normala och patologiska tillstånd kan förändringar i benvävnadens morfologi, struktur och funktion orsakade av osteoporos identifieras. Denna information bidrar till förståelsen av utvecklingen av osteoporos och dess samband med andra sjukdomar.
Mikrodatortomografi (Micro-CT) har nyligen blivit en populär teknik för bedömning av benmorfologi, där den kan ge exakta och omfattande data om benstruktur och densitetsparametrar såsom benvolymfraktion, tjocklek och separation 5,6. Samtidigt kan Micro-CT-resultaten påverkas av analysprogramvaran7. Olika metoder för bildinsamling, utvärdering och rapportering används av olika kommersiella Micro-CT-system. Denna inkonsekvens gör det svårt att jämföra och tolka de resultat som rapporteras av olika studier5. Dessutom kan den för närvarande inte ersätta benhistomorfhometri när det gäller att förse forskare med information om parametrar på cellnivå i skelettsystemet8. Samtidigt möjliggör histologiska tekniker direkt observation och mätning av benets mikroskopiska morfologi. Hematoxylin och eosin (HE) färgning är en vanlig färgningsteknik som används inom histologi för att visualisera den allmänna strukturen hos celler och vävnader. Det används för att identifiera förekomsten av benvävnad och dess mikroarkitektur.
Denna artikel använder Micro-CT i kombination med vävnadsskivningsteknik (Hematoxylin-Eosin [HE] färgning) för att samla in benvävnadsbilder och utföra kvantitativ analys av trabekulärt ben för att utvärdera förändringarna i benmikrostrukturen i en osteoporosmusmodell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurprotokollet har godkänts av djuretiska kommittén vid Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (diarienummer: 2020-34). C57BL/6J-mösshonor (12 veckor gamla, n = 14) delades in i två grupper slumpmässigt, en skenstyrd grupp (Sham-grupp, n = 7) och en modellgrupp (OVX-grupp, n = 7). Djuren köptes från en kommersiell leverantör (se Materialförteckning). Alla möss hölls i individuella burar vid 22-26 °C med 45%-55% luftfuktighet, fick anpassa sig till sin nya miljö under 1 vecka och gavs fri tillgång till vatten och kost. Alla djurexperimentella studier utfördes vid Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, och alla ansträngningar gjordes för att minimera djurens lidande.
1. Förberedelse av djurmodell
- Bedöva den 12 veckor gamla musen genom intraperitoneal injektion med 1,25 % Avertin (tribrometanol i tert-amylalkohol, se materialförteckning) i en dos av 0,02 ml/g. Placera musen på ett sterilt operationsbord och immobilisera dess lemmar genom att tejpa dem ordentligt.
- Använd en sax (se materialförteckning) för att trimma hår som kan påverka den kirurgiska operationen.
OBS: Det rekommenderas att undvika hudskador när du förbereder operationsstället. - Tvätta händerna noggrant och ta på dig operationshandskar. Desinficera musens rygg tre gånger med povidonjod (se Materialförteckning) och använd medicinsk gasväv (se Materialförteckning) för att torka av den.
OBS: Var försiktig; Att håret blir för blött under desinfektion kan leda till postoperativ hypotermi hos möss. - Gör ett snitt som är cirka 0,5-1,0 cm långt, beläget 1 cm från en tredjedel av mittlinjen på musens rygg, med hjälp av en skalpell (se materialförteckning). Separera försiktigt fascian och skär igenom muskeln med en vävnadssax (se materialtabell) tills äggstocken är synlig. Smörj de omgivande blodkärlen med icke-absorberbara suturer (se materialförteckning) och ta bort äggstocken.
- Skölj hålrummet med 0.9 % saltlösning och sy sedan ihop huden, muskeln och fascian separat (se materialförteckning).
- Upprepa samma sekvens av steg på andra sidan.
- Ta bort fett från peri-ovarialerna av samma storlek som äggstocken och utför samma kirurgiska ingrepp som nämns ovan för de återstående stegen för att etablera den skenopererade modellen.
- Tillåt en återhämtningsperiod på 1 vecka efter operationen. Efter 8 veckor kommer osteoporotiska musmodeller att vara framgångsrikt etablerade 9,10.
2. Mikro-CT-skanning
- Avliva musen genom överskott av CO2 -inandning. Ta bort så mycket mjukvävnad som möjligt från musens lårben efter avlivning och ta ett nytt prov för skanning.
OBS: Även om det inte finns någon perfekt lösning för provkonservering, kan vissa åtgärder vidtas för att maximera kvaliteten på Micro-CT-skanningsresultaten. Före fixering, var noga med att ta bort så mycket omgivande vävnad som möjligt. Formalin eller buffrat formalin är den mest föredragna metoden för fixering med lagring i PBS11,12. - Dubbelklicka på programvaruikonen för mikro-CT-bildsystemet på skrivbordet för att starta systemet (se Materialförteckning). Välj en provbädd som är kompatibel med provets synfält (FOV) på 18 mm x 18 mm. Ladda lämplig provbädd i maskinen och stäng luckan.
- Klicka på knappen Uppvärmning på kontrollpanelen.
OBS: En kort uppvärmningstid krävdes. Försök inte öppna luckan när röntgenstrålar genereras. Kontrollera röntgenlampan på frontpanelen och datorskärmen för att bekräfta om röntgenstrålar genereras. - Klicka på menyknappen för att ställa in en ny databas och skapa sedan ett nytt prov och en ny studie.
- Välj Manuell i listrutan Meny och ange anpassade spännings- och strömvärden på Kontrollpanelen. Ställ in spänning (kV ) på 90, ström (μA ) på 80, skanningsläge på hög upplösning, 14 min och synfält (mm) på 18 mm x 18 mm.
OBS: Se manualen för olika mikro-CT-system för att ställa in lämpliga parametrar. - Placera benet säkert med plastfilm i provbädden. Stäng luckan. Se till att motivet är centrerat exakt i X-capture-fönstret genom att trycka på justeringsknapparna på maskinen.
OBS: Justering av sample måste vara långsam och försiktig för att undvika att den faller in i maskinen av misstag. - Klicka på Start-knappen för att starta CT-skanningen.
3. Analys av CT-data
- Gå in i programvaran (se materialförteckning) och välj de data som ska analyseras. Klicka på Sub och ställ in Pixelstorlek på 10 μm. Flytta och ändra storlek på intresseområdet (ROI) så att det inkluderar det distala lårbenet ovanför tillväxtplattan. Klicka på Start (se figur 1).
OBS: Pixelstorleken för subvolymrekonstruktion valdes vid 10 μm eftersom tjockleken på avbildningstrabeklerna uppskattades till cirka 20-30 μm baserat på histologiska data från tidigare studier13. Om signal-brusförhållandet är otillräckligt för databehandling måste en högupplöst skanning på 1 timme utföras. - Klicka på knappen Analysera 3D för att få den resulterande 3D-rekonstruktionen.
- Exportera data från mikro-CT-systemet till datorn för analys.
- Importera rekonstruerade CT-data. Klicka på Process > Image Calculator och klicka sedan på Region Pad > Interactive. Justera den gula kryssrutan till lämplig ROI.
OBS: Intresseområdet (ROI) börjar cirka 540 μm proximalt om tillväxtplattan och sträcker sig 1600 μm proximalt för att bedöma den faktiska benmetabolismen och ombyggnaden. - Välj tillägget Bone Microarchitecture Analysis (BMA) (se Materialförteckning). Klicka på Segmentera Cortex och sedan på Segmentera trabeculae.
OBS: Både trabekulärt och kortikalt ben väljs automatiskt. Normalt krävs ingen manuell justering. - Klicka på Spara slutlig objektkarta och klicka sedan på Mät ben för att beräkna benmorfometriska index.
OBS: Endast relativ bentäthet (BMD) beräknades här eftersom ingen kontroll tillsattes.
4. Avkalkning av benvävnad
- Fixera benproverna i 4% paraformaldehyd (se materialförteckning) i 24 timmar. Tvätta proverna tre gånger med PBS (se materialförteckning) i 20 minuter varje gång.
- Skölj servetten tre gånger med destillerat vatten i 20 minuter varje gång. Överför vävnaden till en avkalkningslösning som innehåller EDTA (se materialförteckning) och avkalka i 30 dagar med ett veckovis byte av lösning fram till slutpunkten.
OBS: Nålstickning, handnypning och klämning används för att avsluta avkalkning när benvävnaden blir mjuk, eller om det inte finns någon känsla av motstånd vid nålning. Den fysiska detektionsmetoden kan orsaka viss skada på vävnadsstrukturen, så försök att undvika överdriven kraft eller upprepade tester. - Ta ut vävnaden ur fixeringsmedlet och använd en skalpell för att trimma vävnaden i ett dragskåp. Lägg den trimmade servetten och motsvarande etikett i en uttorkningslåda.
- Lägg dehydreringsboxen i en korg och dehydrera den i en vävnadsprocessor (se Materialtabell) med gradientalkohol (75 % etanol i 4 timmar, 85 % etanol i 2 timmar, 90 % etanol i 2 timmar, 95 % etanol i 1 timme, vattenfri etanol i 30 min, vattenfri etanol II i 30 min, xylen I i 5-10 min, xylen II i 5-10 min, vax I i 1 timme, vax II i 1 timme, vax III i 1 timme).
- Använd en inbäddningsmaskin (se Materialförteckning) för att bädda in den vaxindränkta vävnaden. Häll det smälta vaxet i en inbäddningslåda och placera vävnaden från uttorkningslådan innan vaxet härdar.
- Rikta vävnaden efter inbäddningsytan och fäst motsvarande etikett. Låt svalna på ett frysbord på -20 °C (se materialförteckning). Ta bort vaxblocket från inbäddningslådan efter att ha stelnat och trimma vaxblocket efter behov (se materialtabell).
- Skär det trimmade vaxblocket i 3 μm tjocka glas på en mikrotom (se materialförteckning). Flyt objektglasen på 40 °C varmt vatten på en vävnadsspridningsmaskin (se materialförteckning) för att platta till vävnaden och skopa upp dem med ett objektglas.
- Grädda i 60 °C ugn (se materialtabell) tills vattnet avdunstar och vaxet smälter. Ta ut och förvara i rumstemperatur (RT) för senare användning.
5. HE-färgning
- Lägg objektglasen i xylen I i 20 min, sedan i xylen II i 20 min. Lägg sedan objektglasen i vattenfri etanol I och vattenfri etanol II i 5 minuter vardera, 75 % alkohol i 5 minuter och tvätta sedan objektglasen med kranvatten (se materialförteckning).
- Inkubera i hematoxylin (se materialtabell) i 3-5 min. Differentiera proverna med en saltsyralösning (se materialförteckning). Behandla objektglasen med en ammoniaklösning (se Materialförteckning) för blåfärgning och tvätta sedan objektglasen med vatten.
- Lägg objektglasen i 85 %, 95 % gradientalkohol för uttorkning och färga med eosinlösning (se materialtabell) i 5 min.
- Lägg objektglasen i vattenfri etanol I i 5 min, vattenfri etanol II i 5 min och vattenfri etanol III i 5 min. Behandla objektglasen med xylen I i 5 min, xylen II i 5 min och montera med neutral balsam (se materialförteckning).
- Undersök varje objektglas under mikroskopet. Välj sedan de representativa segmenten för panoramaskanning (se Materialförteckning).
OBS: Minst tre på varandra följande skivor krävs för varje sample. Före panoramaskanning måste skivorna undersökas i mikroskop för att säkerställa att de är fullständiga och klara. Se till att benmärgshålan, kortikalbenet och det spongiösa benet visas fullt ut och att olika typer av benceller kan ses.
6. Bildanalys av högre utbildning
- Öppna HE-bilder med programvaran CaseViewer (se Materialförteckning). Välj intresseområde (ROI) på bilden och spara det som en färgbild.
OBS: Valet av ROI överensstämmer med ovan nämnda programvara. - Öppna bilden i ImageJ (se Materialförteckning). Välj verktyget Trollstav i verktygsfältet. Klicka på det trabekulära benet.
- Justera toleransen och de sammanhängande inställningarna efter behov. Gå till Bild > justeringar > svartvitt och klicka på OK. Upprepa stegen för andra delar av benet.
- Invertera markeringen och fyll den med vit färg. Spara bilden som en mask för analys (se figur 2).
OBS: För detaljerad metodik, se det tidigare publicerade arbetet14. - Öppna masken i analysprogrammet15,16 (se Materialförteckning). Kör Process > Binary > Make Binary för att konvertera färgbilden till en binär bild.
- Använd plugin 17 (se materialförteckning) i programvaran för att analysera strukturella parametrar: Run Area/Volume Fraction för att beräkna benvolym till total benvolym (BV/TV [%])18,19.
OBS: Denna metod är tillämplig för bentrabekler och benmärg och fyller hela ROI i HE-bilderna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikro-CT-analys
Vi mätte de trabekulära mikroarkitektoniska parametrarna hos möss från båda grupperna och rapporterade deras medelvärden och SD i tabell 1. Fördelningen av vissa parametrar (dvs. förhållandet mellan benvolym och total vävnadsvolym, trabekulär tjocklek, trabekulär separation) inom varje grupp illustreras i figur 3.
Dessa resultat indikerar signifikanta skillnader mellan möss i OVX- och Sham-gruppen för ett antal parametrar som uppskattades från Micro-CT. Förhållandet mellan benvolym och total vävnadsvolym (BV/TV) i OVX-gruppen var nämligen 3 % lägre än i Sham-gruppen. Trabekulärtjockleken hos möss med OVX var lägre än hos möss i Sham-gruppen, med en relativ skillnadsprocent på 39,3 %. Den trabekulära separationen hos OVX-möss var större än hos Sham-möss. Figur 4 visar 3D-visningar av trabekulära ROI extraherade från rekonstruerad benvolym för varje grupp. Jämfört med Sham-gruppen (Figur 4A) var bentätheten hos möss efter ovariektomi, trabeklerna glesa och visade osteoporos (Figur 4B).
Analys av HE-färgning
Dessutom bekräftade histopatologisk analys de förändringar som hittades i Micro-CT-analysen. Efter 8 veckor visade HE-färgning att det trabekulära benet (rött) under tillväxtplattan på det distala lårbenet hos möss efter OVX var reducerat jämfört med Sham-gruppen, och det fanns nästan ingen uppenbar tjock trabekulär struktur, och ett stort antal fettliknande korn framträdde (Figur 5A). Baserat på kvantitativ analys av vävnadssnitt hade OVX-mössen mindre trabekulär benarea än Sham-mössen (Figur 5B).
Bild 1: Skärmbild av gränssnittet för rekonstruktion av undervolymer. En subvolymrekonstruktion i den gröna rektangeln för att komma ner till 10 μm i ett synfält (FOV) på 5,12 mm x 5,12 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Bildmaskkonstruktion i svartvitt. (A1-A3): HE-bilder från Sham-gruppen (skalstreck = 200 μm). Bentrabekler visas i svart inom det valda området och andra vävnader i vitt. (B1-B3) Bilder av OVX-gruppen (skalstreck = 200 μm). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Jämförelse av mikrostrukturella parametrar för distala lårbenstrabekler mellan OVX- och Sham-grupper. (A) Förhållandet mellan benvolym och total vävnadsvolym (BV/TV [%]) i OVX-gruppen var lägre än i Sham-gruppen. (B) Trabekulärtjockleken (TB.Th [μm]) hos möss med OVX var lägre än i Sham-gruppen. (C) Den trabekulära separationen (TB.sp [μm]) hos OVX-möss var större än hos Sham-möss. *P < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa mikro-CT-bilder av det trabekulära benet i det distala lårbenet. Jämfört med (A) Sham-gruppen uppvisade bentätheten hos möss efter ovariektomi (B) glesa trabekler och osteoporos. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Histologisk analys av det trabekulära benområdet i det distala lårbenet hos OVX- och Sham-grupperna. A) Representativa HE-färgade bilder av det distala lårbenet i varje grupp (skalstreck = 500 μm). Svarta pilar visar trabekler. (B) Kvantitativ analys av den trabekulära benarean av den totala vävnadsvolymen i den valda avkastningen. *P < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Parameter | Skenstyrd grupp (SHAM) (n = 5). |
Ovariektomigrupp (OVX) (n = 5). |
P-värde |
| Förhållandet benvolym i förhållande till total vävnadsvolym (%) | 7,3 ± 0,9 | 4,2 ± 0,5 | 0.012* |
| Trabekulär tjocklek (μm) | 79,5 ± 5,5 | 53,4 ± 6,0 | 0.013* |
| Trabekulär separation (μm) | 212,5 ± 8,7 | 249,4 ± 8,3 | 0.015* |
| Värdena är medelvärdet ± SD. * Signifikant annorlunda (P<0 .05). |
|||
Tabell 1: Parametrar för trabekulärt ben skattade från Micro-CT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Osteoporos kan leda till frekventa frakturer, som är kostsamma, kan orsaka smärta, funktionshinder eller till och med dödsfall och allvarligtpåverka patienternas livskvalitet. Under årens lopp har ovariektomimodellen erkänts som en av standardmetoderna för att studera osteoporos21. Den vanligaste prekliniska djurmodellen för osteoporos är ovariektomerad (OVX) råtta. Trots detta har majoriteten av forskningen om mekanismerna för bensjukdomar, inklusive benskörhet, utförts med hjälp av möss22. För att fastställa en osteoporosmodell hos vuxna C57/BL6J-honmöss utförs ovariektomi vid 12 veckors ålder, vilket är den optimala tiden för denna procedur. Möss är mogna och fertila från 8-12 veckors ålder, och ovariektomi har en betydande effekt på deras benmassa vid denna tidpunkt10. Tidigare studier visar att före 12 veckor växer skelettet hos möss snabbt, och indikatorerna för benmorfologi, BMD och benbiomekanik ökar snabbt. Den totala BMD och kortikala benbens-BMD är signifikant korrelerade med mössens ålder. Men efter 12 veckor går mössens benmetabolism in i en stabil period, och ovanstående indikatorer tenderar att vara stabila23,24.
Benmikroarkitektur har föreslagits som den primära faktorn som påverkar benskörhet, oberoende av BMD. Benskörheten vid osteoporos kan inte helt förklaras av ett underskott i benmassa. BMD kan bara förklara 60%-70% av benstyrkan25. När det gäller strukturell sammansättning utgör kortikalt ben 80 % av benmassan, medan spongiöst ben endast uppvisar 10 % av mätningarna efter att ha förlorat 50 % av benmassan, vilket tyder på att enbart mätningar av benmassa inte är tillräckliga för att bedöma benmasseförlusten. Förutom benvolymen är strukturella förändringar i bentrabekler avgörande för benstyrkan. Cancellous bone innehåller hematopoetisk benmärgsvävnad eller fettvävnad. Dess yta är ganska stor, ungefär åtta gånger större än kortikalt ben. Denna stora yta som är ansluten till benmärgen gör att det spongiösa benet kan ha en ganska hög benomvandlingshastighet. Det är därför vi valde mikrostrukturen hos bentrabekler som huvudindikator för att observera osteoporotiska förändringar. Den trabekulära benvävnaden i skelettet genomgår ständigt ombyggnad under tillväxten, under vilken nybildade bentrabekler ersätter de befintliga och bildar sekundärt svampigt ben. Därför, under normala förhållanden, är morfometrisk analys av trabekulärt ben huvudsakligen inriktad på det sekundära svampiga benområdet. Primär svampig benvävnad, å andra sidan, är en medfött närvarande och relativt stabil struktur som inte är ombyggd och därför måste uteslutas från analysen. I allmänhet kan benet inom ett visst avstånd från tillväxtplattan betraktas som aktivt omformande vävnad. Därför valde vi ett intresseområde (ROI) som börjar från 540 μm ovanför tillväxtplattan och spänner över 1600 μm i proximal riktning för analysen. Enligt våra resultat uppvisar möss mycket olika mikrostrukturella egenskaper i trabekulära regioner efter ovariektomi.
Micro-CT-tekniken som används i denna studie är en icke-destruktiv 3D-avbildningsteknik som utvecklats under de senaste decennierna och som gradvis tillämpas på den farmakologiska studien av etnomedicinska örter. Det ger en tydlig förståelse för provets inre mikrostruktur utan att förstöra den. När det gäller den histopatologiska undersökningen skadar hartsinbäddningsmetoden enzymaktiviteten och proteinets antigenicitet och kan inte användas på ett tillförlitligt sätt för histokemi eller immunhistokemi26. Den traditionella paraffininbäddningen kan kombineras med tekniker som immunhistokemi (IHC), fluorescens in situ hybridisering (FISH) och konfokalt laserskanningsmikroskop (CLSM) för att kvantitativt detektera ämnen i låg förekomst i benvävnad på molekylär nivå och därigenom få en djupare förståelse för mekanismerna och regleringen av benmetabolism. Panoramabildskannern kan snabbt omvandla objektglas till högupplösta digitala bilder, vilket gör det möjligt att kvantitativt analysera benhistomorfologiska data med hjälp av datorprogramvara. Sammanfattningsvis kan kombinationen av Micro-CT och benhistomorfologi ge en mer detaljerad och exakt utvärdering av benmikrostrukturen.
Traditionellt har bedömningen av benkvalitet i stort sett varit begränsad till dubbelenergiröntgenabsorptiometri (DXA), datortomografi med begränsad upplösning eller tekniskt utmanande magnetisk resonanstomografi27. Även om kombinationen av de två teknikerna har sina unika fördelar, har den också sina begränsningar. För det första, även om mikro-CT möjliggör långsiktig kontinuerlig övervakning av samma djur, är in vivo-avbildning av skelettmikrostrukturer hos levande smådjur, särskilt möss, fortfarande tekniskt utmanande28. För det andra gör avsaknaden av ett strukturerat och internationellt erkänt protokoll för att förvärva och analysera data från olika instrument eller användare det svårt att jämföra datauppsättningar och reproducera forskningsresultat mellan studier. För det tredje, på grund av egenskaperna hos Micro-CT, är exponering för joniserande strålning oundviklig. För det fjärde, även om vårt enkla och ekonomiska protokoll kan ge kvantitativ analys av HE-färgade benbilder, är det huvudsakligen baserat på en halvautomatisk segmenteringsstrategi, vilket är mer mödosamt än komplexa automatiserade metoder.
Sammanfattningsvis kommer tillämpningen av denna teknik utan tvekan att ge en stor drivkraft till osteoporosforskning inom etnomedicin under utforskningsprocessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Sichuan Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine (2021YJ0175) och Graduate Research Innovation Project vid School of Clinical Medicine (LCYJSKT2023-11), Chengdu University of Traditional Chinese Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
| Ammonia Solution | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anatomical Forceps | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J3C030 | |
| Anhydrous Ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Automatic Dyeing Machine | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
| Bone Microarchitecture Analysis Add-on | AnalyzeDirect, Inc | ||
| C57BL/6J mice | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Carrier Slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Coverslips | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Decalcification Solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Delicate Scissors | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | ZJA010 | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fiji: ImageJ | National Institutes of Health, USA | ||
| Film Sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| Freezing Table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| H&E Staining Kit | Leagene | DH0020 | |
| Hydrochloric Acid Solution | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| ImageJ2 Plugin | BoneJ 7.0.16 | ||
| Medical Gauze | Shandong Ang Yang Medical Technology Co. | ||
| Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures | Ethicon, Inc. | SA84G | |
| Needle Holder | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J32010 | |
| Neutral Balsam | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| PANNORAMIC Digital Slide Scanners | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Povidone-iodine solution 5% | Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Quantum GX2 microCT Imaging System | PerkinElmer, Inc. | ||
| Rotary Microtome | Thermo scientific | HM325 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Scan & Browse Software | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
| Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves | Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd | 22B141EO | |
| Sodium Chloride Solution 0.9% | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Sterile Hypodermic Syringes for Single Use | Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd | ||
| Sterile Medical Suture Needles | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | PW8068 | |
| Tissue Processor | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Tissue Spreading and Baking Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Tribromoethanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M2920 | |
| Wax Trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Wang, J., et al. The prevalence of osteoporosis in China, a community based cohort study of osteoporosis. Frontiers in Public Health. 11, 1084005 (2023).
- Stein, M., et al. Why animal experiments are still indispensable in bone research: A statement by the European Calcified Tissue Society. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (8), 1045-1061 (2023).
- Kerschan-Schindl, K., Papageorgiou, M., Föger-Samwald, U., Butylina, M., Weber, M., Pietschmann, P. Assessment of bone microstructure by micro CT in C57BL/6J mice for sex-specific differentiation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 14585 (2022).
- Fonseca, H., Moreira-Gonçalves, D., Coriolano, H. J. A., Duarte, J. A. Bone quality: the determinants of bone strength and fragility. Sports Medicine. 44, 37-53 (2014).
- Bouxsein, M. L., Boyd, S. K., Christiansen, B. A., Guldberg, R. E., Jepsen, K. J., Müller, R. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Akhter, M. P., Recker, R. R. High resolution imaging in bone tissue research-review. Bone. 143, 115620 (2021).
- Mys, K., et al. Quantification of 3D microstructural parameters of trabecular bone is affected by the analysis software. Bone. 142, 115653 (2021).
- Chavassieux, P., Chapurlat, R. Interest of bone histomorphometry in bone pathophysiology investigation: Foundation, present, and future. Frontiers in Endocrinology. 13, 907914 (2022).
- Komori, T.
- Zhu, S., et al. Ovariectomy-induced bone loss in TNFα and IL6 gene knockout mice is regulated by different mechanisms. Journal of Molecular Endocrinology. 60 (3), 185-198 (2018).
- Baum, T., et al. Osteoporosis imaging: effects of bone preservation on MDCT-based trabecular bone microstructure parameters and finite element models. BMC Medical Imaging. 15, 22 (2015).
- Nazarian, A., Hermannsson, B. J., Muller, J., Zurakowski, D., Snyder, B. D. Effects of tissue preservation on murine bone mechanical properties. Journal of Biomechanics. 42 (1), 82-86 (2009).
- Martín-Badosa, E., Amblard, D., Nuzzo, S., Elmoutaouakkil, A., Vico, L., Peyrin, F. Excised bone structures in mice: imaging at three-dimensional synchrotron radiation micro CT. Radiology. 229 (3), 921-928 (2003).
- Egan, K. P., Brennan, T. A., Pignolo, R. J. Bone histomorphometry using free and commonly available software. Histopathology. 61 (6), 1168-1173 (2012).
- Brandi, M. L. Microarchitecture, the key to bone quality. Rheumatology. 48 (suppl_4), iv3-iv8 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Domander, R., Felder, A. A., Doube, M.
- Parfitt, A. M., et al. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units: report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. Journal of Bone and Mineral Research. 2 (6), 595-610 (1987).
- Kazama, J. J., Koda, R., Yamamoto, S., Narita, I., Gejyo, F., Tokumoto, A. Cancellous bone volume is an indicator for trabecular bone connectivity in dialysis patients. Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 5 (2), 292-298 (2010).
- Watts, N. B. Postmenopausal osteoporosis: A clinical review. Journal of Women's Health. 27 (9), 1093-1096 (2018).
- Thompson, D. D., Simmons, H. A., Pirie, C. M., Ke, H. Z. FDA Guidelines and animal models for osteoporosis. Bone. 17 (4), S125-S133 (1995).
- Iwaniec, U. T., Yuan, D., Power, R. A., Wronski, T. J. Strain-dependent variations in the response of cancellous bone to ovariectomy in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (7), 1068-1074 (2006).
- Ferguson, V. L., Ayers, R. A., Bateman, T. A., Simske, S. J. Bone development and age-related bone loss in male C57BL/6J mice. Bone. 33 (3), 387-398 (2003).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (8), 1197-1207 (2007).
- Seeman, E. The structural and biomechanical basis of the gain and loss of bone strength in women and men. Endocrinology and Metabolism Clinics. 32 (1), 25-38 (2003).
- Ticha, P., et al. A novel cryo-embedding method for in-depth analysis of craniofacial mini pig bone specimens. Scientific Reports. 10 (1), 19510 (2020).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology. 47 (suppl_4), iv9-iv16 (2008).
- Zaw Thin, M., Moore, C., Snoeks, T., Kalber, T., Downward, J., Behrens, A. Micro-CT acquisition and image processing to track and characterize pulmonary nodules in mice. Nature Protocols. 18 (3), 990-1015 (2023).
