Summary
该协议提供了一种经济有效的方法，通过结合苏木精-伊红（HE）染色和显微计算机断层扫描（Micro-CT）技术，定量评估骨质疏松症小鼠模型中的骨微结构。
Abstract
骨微观结构是指骨组织在微观水平上的排列和质量。了解骨骼的骨骼微观结构对于深入了解骨质疏松症的病理生理学并改善其治疗至关重要。然而，由于骨样本的坚硬和致密特性，处理骨样本可能很复杂。其次，专用软件使图像处理和分析变得困难。在该协议中，我们提出了一种具有成本效益且易于使用的骨小梁微观结构分析解决方案。提供了详细的步骤和注意事项。Micro-CT 是一种无损三维 （3D） 成像技术，可提供骨小梁结构的高分辨率图像。它可以对骨质量进行客观和定量的评估，这就是为什么它被广泛认为是骨质量评估的金标准方法。然而，组织形态测量仍然是必不可少的，因为它提供了关键的细胞水平参数，弥合了骨标本的二维 （2D） 和 3D 评估之间的差距。至于组织学技术，我们选择对骨组织进行脱钙，然后进行传统的石蜡包埋。综上所述，结合这两种方法可以提供更全面、更准确的骨微观结构信息。
Introduction
骨质疏松症是一种普遍存在的代谢性骨病，尤其是在老年人中，并且与脆性骨折的风险增加有关。随着骨质疏松症在中国变得越来越普遍1，对研究小动物骨骼结构的需求将越来越大2,3。以前的骨质流失测量方法依赖于二维双能X射线吸收测定法的结果。然而，这并不能捕捉到小梁结构微观结构的变化，而小梁骨是骨骼强度的关键因素4.骨骼的微观结构会影响其强度、刚度和抗断裂性。通过比较正常和病理状态下的骨微结构，可以识别骨质疏松症引起的骨组织形态、结构和功能的变化。这些信息有助于了解骨质疏松症的发展及其与其他疾病的关联。
显微计算机断层扫描 （Micro-CT） 成像最近已成为骨形态学评估的流行技术，它可以提供有关骨结构和密度参数（如骨体积分数、厚度和分离度）的准确和全面的数据 5,6。同时，Micro-CT结果会受到分析软件7的影响。各种商用 Micro-CT 系统使用不同的图像采集、评估和报告方法。这种不一致使得很难比较和解释不同研究报告的结果5.此外，它目前不能取代骨组织形态学，为研究人员提供有关骨骼系统中细胞水平参数的信息8。同时，组织学技术可以直接观察和测量骨骼的微观形态。苏木精和伊红 （HE） 染色是组织学中常用的染色技术，用于可视化细胞和组织的一般结构。它用于识别骨组织的存在及其微结构。
本文采用显微CT结合组织切片技术（苏木精-伊红[HE]染色）采集骨组织图像，对骨小梁骨进行定量分析，以评估骨质疏松症小鼠模型中骨微结构的变化。
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Protocol
该动物方案已获得成都中医药大学动物伦理委员会批准（备案号：2020-34）。雌性C57BL/6J小鼠（12周龄，n = 14）随机分为两组，假手术组（假手术组，n = 7）和模型组（OVX组，n = 7）。动物是从商业供应商处购买的（见 材料表）。将所有小鼠保持在22-26°C，湿度为45%-55%的单独笼子中，使其适应新环境1周，并免费获得水和饮食。所有动物实验研究均在成都中医药大学进行，并尽一切努力将动物的痛苦降到最低。
1.动物模型制备
- 通过腹膜内注射1.25%Avertin（叔戊醇中的三溴乙醇，参见 材料表）麻醉12周龄小鼠，剂量为0.02mL / g。将小鼠俯卧在无菌手术台上，并通过牢固地固定其四肢来固定其四肢。
- 使用剪刀（见 材料表）修剪任何可能影响外科手术的头发。
注意：建议在准备手术部位时避免皮肤损伤。 - 彻底洗手并戴上外科手套。用聚维酮碘对小鼠背部进行三次消毒（见材料表），并使用医用纱布（见材料表）将其擦干。
注意：谨慎;在消毒过程中让头发太湿可能会导致小鼠术后体温过低。 - 使用手术刀在距鼠标背部中线三分之一 1 厘米处切开约 0.5-1.0 厘米长的切口（参见 材料表）。轻轻地分离筋膜并用组织剪刀切开肌肉（参见 材料表），直到卵巢可见。用不可吸收的缝合线结扎周围的血管（见 材料表）并切除卵巢。
- 用0.9%生理盐水冲洗腔体，然后分别缝合皮肤、肌肉和筋膜（参见 材料表）。
- 在另一侧重复相同的步骤序列。
- 去除与卵巢大小相同的卵巢周围脂肪，并执行上述相同的手术程序，以建立假手术模型的其余步骤。
- 手术后留出 1 周的恢复期。8周后，骨质疏松小鼠模型将成功建立9,10。
2. 显微CT扫描
- 通过吸入过量的CO2 对小鼠实施安乐死。安乐死后尽可能多地从小鼠股骨中取出软组织，并获得新鲜样本进行扫描。
注意：虽然没有完美的样品保存解决方案，但可以采取某些步骤来最大限度地提高 Micro-CT 扫描结果的质量。固定前，注意尽可能多地去除周围组织。福尔马林或缓冲福尔马林是最优选的固定方法，储存在 PBS11,12 中。 - 双击桌面上的显微CT成像系统软件图标启动系统（见 材料表）。选择与 18 mm x 18 mm 的样品视场 （FOV） 兼容的样品床。将适当的样品床装入机器并关闭舱口。
- 单击“控制面板”中的“预热”按钮。
注意：需要很短的预热时间。请勿在产生 X 射线时尝试打开舱口。检查前面板和计算机显示器上的X 射线开启 指示灯，以确认是否正在生成X射线。 - 单击 “菜单 ”按钮设置新数据库，然后创建新样品和研究。
- 从菜单下拉列表中选择手动，然后在控制面板中输入自定义电压和电流值。将电压 （kV） 设置为 90，将电流 （μA） 设置为 80，将扫描模式设置为高分辨率 14 分钟，将 FOV （mm） 设置为 18 mm x 18 mm。
注意： 请参阅不同微型 CT 系统的手册以设置适当的参数。 - 用塑料薄膜将骨头牢固地放置在样品床中。关闭舱口。按下机器上的调整按钮，确保拍摄对象在 X-capture 窗口中精确居中。
注意： 调整样品必须缓慢而轻柔，以免意外掉入机器中。 - 单击 “开始 ”按钮开始 CT 扫描。
3. CT数据分析
- 进入软件（见 材料表），选择要分析的数据。单击 “子 ”（Sub） 并将 “像素大小”（Pixel Size ） 设置为 10 μm。移动感兴趣区域 （ROI） 并调整其大小，以包括生长板上方的股骨远端。单击 “开始 ”（参见 图 1）。
注：亚体积重建像素大小选择在 10 μm，因为根据先前研究的组织学数据，成像小梁的厚度估计约为 20-30 μm13。如果信噪比不足以进行数据处理，则必须执行高分辨率 1 小时扫描。 - 单击 “分析 3D ”按钮以获取生成的 3D 重建。
- 将数据从显微CT系统导出到计算机进行分析。
- 导入重建的 CT 数据。 单击“处理>图像计算器”，然后单击“ 区域填充”>“交互式”。将黄色复选框调整为适当的 ROI。
注意：感兴趣区域 （ROI） 从生长板近端约 540 μm 开始，向近端延伸 1600 μm，以评估实际的骨代谢和重塑。 - 选择骨微结构分析 （BMA） 模块（参见 材料表）。单击 “分割皮层 ”，然后单击 “分割小梁”。
注意：小梁骨和皮质骨都是自动选择的。通常不需要手动调整。 - 单击“ 保存最终对象映射 ”，然后单击 “ 测量骨骼”以计算骨骼形态测量指数。
注意：由于未添加对照，因此此处仅计算相对骨矿物质密度（BMD）。
4.骨组织脱钙
- 将骨标本固定在4%多聚甲醛（见 材料表）中24小时。每次用PBS（参见 材料表）洗涤试样三次20分钟。
- 每次用蒸馏水冲洗组织三次，每次20分钟。将组织转移到含有EDTA的脱钙溶液中（参见 材料表）并脱钙30天，每周更换溶液直至终点。
注意：当骨组织变软或针刺时没有阻力感时，使用针刺、手捏和夹紧来终止脱钙。物理检测方法会对组织结构造成一定的损伤，因此请尽量避免用力过大或重复检测。 - 将组织从固定剂中取出，然后用手术刀在通风橱中修剪组织。将修剪后的组织和相应的标签放入脱水盒中。
- 将脱水盒放入篮子中，用梯度酒精（75%乙醇4小时，85%乙醇2小时，90%乙醇2小时，95%乙醇1小时，无水乙醇30分钟，无水乙醇II30分钟，二甲苯I5-10分钟， 二甲苯II为5-10分钟，蜡I为1小时，蜡II为1小时，蜡III为1小时）。
- 使用包埋机（见 材料表）嵌入蜡浸泡的组织。将熔化的蜡倒入包埋盒中，并在蜡变硬之前将脱水盒中的组织放入包埋盒中。
- 根据包埋面定向组织并贴上相应的标签。在-20°C冷冻台上冷却（参见 材料表）。凝固后从包埋盒中取出蜡块，根据需要修剪蜡块（见 材料表）。
- 在切片机上将修剪好的蜡块切成3μm厚的载玻片（参见 材料表）。将载玻片漂浮在组织铺展机上的40°C温水上（参见 材料表），使组织变平并用载玻片舀起。
- 在60°C的烤箱中烘烤（见 材料表），直到水分蒸发，蜡融化。取出并存放在室温 （RT） 下以备后用。
5. HE染色
- 将载玻片放入二甲苯I中20分钟，然后在二甲苯II中放置20分钟。此外，将载玻片分别置于无水乙醇I和无水乙醇II中5分钟，75%酒精中5分钟，然后用自来水洗涤载玻片（参见 材料表）。
- 在苏木精（见 材料表）中孵育3-5分钟。用盐酸溶液区分试样（参见 材料表）。用氨溶液（见 材料表）处理载玻片发蓝，然后用水清洗载玻片。
- 将载玻片放入85%，95%梯度酒精中脱水，并用伊红溶液（参见 材料表）染色5分钟。
- 将载玻片放入无水乙醇I中5分钟，无水乙醇II中5分钟，无水乙醇III中5分钟。用二甲苯I处理载玻片5分钟，用二甲苯II处理5分钟，并用中性香脂安装（参见 材料表）。
- 在显微镜下检查每个载玻片。然后，选择具有代表性的切片进行全景扫描（参见 材料表）。
注意：每个样品至少需要三个连续的切片。在全景扫描之前，必须在显微镜下检查切片，以确保它们完整和清晰。确保骨髓腔、皮质骨和松质骨完全显示，并且可以看到不同类型的骨细胞。
6. HE图像分析
- 使用CaseViewer软件打开HE图像（参见 材料表）。在幻灯片上选择感兴趣区域 （ROI），并将其另存为彩色图像。
注意：ROI的选择与上述软件一致。 - 在 ImageJ 中打开图像（参见 材料表）。从工具栏中选择 魔杖 工具。点击小梁骨。
- 根据需要调整公差和连续设置。转到 “图像>调整”>“黑白”， 然后单击 “确定”。对骨骼的其他区域重复这些步骤。
- 反转选区并用白色填充。将图像另存为掩码以供分析（参见图2）。
注：有关详细方法，请参阅先前发表的著作14。 - 在分析软件15、16 中打开掩模（见 材料表）。运行 Process > Binary > Make Binary ，将彩色图像转换为二进制图像。
- 使用软件中的插件17（参见材料表）分析结构参数：运行面积/体积分数以计算骨体积与骨总体积之比 （BV/TV [%]）18,19。
注：此方法适用于骨小梁和骨髓，填充HE图像中的整个ROI。
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Representative Results
显微CT分析
我们测量了两组小鼠的小梁微观结构参数，并在表1中报告了它们的平均值和SD。图3显示了每组内一些参数（即骨体积与总组织体积的比率、小梁厚度、小梁分离）的分布。
这些结果表明，OVX组和假手术组小鼠在Micro-CT估计的许多参数上存在显着差异。即OVX组骨体积与总组织体积（BV/TV）的比值比值比假手术组低3%。OVX组小鼠小梁厚度低于Sham组，相对差异百分比为39.3%。OVX小鼠的小梁分离大于假小鼠。 图 4 显示了从每组重建骨体积中提取的小梁 ROI 的 3D 显示。与Sham组（图4A）相比，卵巢切除术后小鼠的骨密度，小梁稀疏，表现为骨质疏松症（图4B）。
HE染色分析
此外，组织病理学分析证实了Micro-CT分析中发现的变化。8周后，HE染色显示，与Sham组相比，OVX后小鼠股骨远端生长板下的小梁骨（红色）减少，几乎没有明显的厚小梁结构，并出现大量脂肪样颗粒（图5A）。基于组织切片的定量分析，OVX小鼠的小梁骨面积小于假小鼠（图5B）。
图 1：子卷重构界面截图。绿色矩形中的子体积重建，在 5.12 mm x 5.12 mm 视场 （FOV） 中降至 10 μm。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：黑白图像掩模结构。 （A1-A3）：来自假组的HE图像（比例尺= 200μm）。选定区域内的骨小梁显示为黑色，其他组织显示为白色。（B1-B3）OVX组的图像（比例尺= 200μm）。请点击这里查看此图的较大版本.
图3：OVX组和Sham组股骨小梁远端微观结构参数的比较。 （A）OVX组骨体积与总组织体积之比（BV/TV [%]）低于Sham组。（二）OVX小鼠的小梁厚度（TB.Th μm）低于假手术组。（C） OVX小鼠的小梁分离（TB.sp [μm]）大于假小鼠。*P < 0.05。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：股骨远端小梁骨的代表性显微 CT 图像。 与（A）假手术组相比，卵巢切除术后小鼠（B）骨密度表现为小梁稀疏，表现为骨质疏松。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：OVX 和 Sham 组股骨远端骨小梁区域的组织学分析。 （A） 每组股骨远端的代表性 HE 染色图像（比例尺 = 500 μm）。黑色箭头表示小梁。（B） 所选ROI中总组织体积的小梁骨面积的定量分析。*P < 0.05。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 参数 | 假运营集团 （SHAM） （n = 5）。 |
卵巢切除术组 （OVX） （n = 5）。 |
P 值 |
| 骨体积与总组织体积之比 （%） | 7.3 ± 0.9 | 4.2 ± 0.5 | 0.012* |
| 小梁厚度 （μm） | 79.5 ± 5.5 | 53.4 ± 6.0 | 0.013* |
| 小梁分离 （μm） | 212.5 ± 8.7 | 249.4 ± 8.3 | 0.015* |
| 值是 SD ±平均值。 * 显著差异（P<0.05）。 |
|||
表 1：通过 Micro-CT 估计的骨小梁参数。
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Discussion
骨质疏松症可导致频繁骨折，代价高昂，可引起疼痛、残疾，甚至死亡，严重影响患者的生活质量20。多年来，卵巢切除术模型已被公认为研究骨质疏松症的标准方法之一21。骨质疏松症最常见的临床前动物模型是卵巢切除术（OVX）大鼠。尽管如此，对骨骼疾病（包括骨质疏松症）机制的大多数研究都是使用小鼠进行的 22.为了在成年雌性C57 / BL6J小鼠中建立骨质疏松症模型，在12周龄时进行卵巢切除术，这是该手术的最佳时间。小鼠在8-12周龄时成熟且可育，卵巢切除术此时对其骨量有显着影响10。既往研究表明，在12周之前，小鼠骨骼生长迅速，骨形态、骨密度、骨生物力学等指标迅速增加。总BMD和皮质骨BMD与小鼠年龄显著相关。但12周后，小鼠的骨代谢进入稳定期，上述指标趋于稳定23,24。
骨微结构被认为是影响骨脆性的主要因素，与骨密度无关。骨质疏松症的骨脆性不能完全用骨量不足来解释。BMD 只能解释骨强度的 60%-70%25。在结构组成方面，皮质骨占骨量的 80%，而松质骨在失去 50% 的骨量后仅表现出 10% 的测量值，这表明仅测量骨量不足以评估骨量损失。除骨体积外，骨小梁的结构变化对骨强度也至关重要。内层骨含有造血骨髓组织或脂肪组织。它的表面相当大，大约是皮质骨的八倍。这种与骨髓相连的大表面积使松质骨具有相当高的骨转化率。这就是为什么我们选择骨小梁的微观结构作为观察骨质疏松变化的主要指标。骨骼中的骨小梁组织在生长过程中不断发生重塑，在此期间，新形成的骨小梁取代了现有的骨小梁，形成次生海绵骨。因此，在正常情况下，小梁骨的形态学分析主要集中在次生海绵骨区域。另一方面，原发性海绵状骨组织是一种先天性存在且相对稳定的结构，不会被重塑，因此需要从分析中排除。一般来说，距离生长板一定距离内的骨骼可以被认为是积极重塑组织。因此，我们选择了一个感兴趣区域 （ROI），该区域从生长板上方 540 μm 开始，在近端方向跨越 1600 μm 进行分析。根据我们的研究结果，小鼠在卵巢切除术后在小梁区域表现出非常不同的微观结构特征。
本研究采用的Micro-CT技术是近几十年来发展起来的一种无损三维成像技术，正逐步应用于民族药材的药理学研究。它可以清楚地了解样品的内部微观结构，而不会破坏样品。至于组织病理学检查，树脂包埋方法破坏了酶活性和蛋白质抗原性，不能可靠地用于组织化学或免疫组织化学26。传统的石蜡包埋可以与免疫组织化学（IHC）、荧光原位杂交（FISH）和激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）等技术相结合，在分子水平上定量检测骨组织中的低丰度物质，从而更深入地了解骨代谢的机制和调控。全景玻片扫描仪可以快速将玻片转换为高分辨率的数字图像，从而可以使用计算机软件对骨组织形态学数据进行定量分析。综上所述，Micro-CT与骨组织形态学相结合，可以对骨微观结构进行更详细、更准确的评估。
传统上，骨质量的评估主要局限于双能 X 射线吸收测定法 （DXA）、有限分辨率的计算机断层扫描或技术上具有挑战性的磁共振成像27。虽然这两种技术的结合有其独特的优势，但它也有其局限性。首先，尽管Micro-CT允许对同一只动物进行长期连续监测，但活体小动物（尤其是小鼠）骨骼微观结构的体内成像在技术上仍然具有挑战性28。其次，由于缺乏结构化的、国际公认的协议来获取和分析来自不同仪器或用户的数据，因此很难比较数据集并在不同研究中重现研究结果。第三，由于Micro-CT的特性，暴露于电离辐射是不可避免的。第四，虽然我们简单而经济的方案可以提供HE染色骨图像的定量分析，但它主要基于半自动分割策略，这比复杂的自动化方法更费力。
综上所述，该技术的应用无疑将为骨质疏松症研究在民族医学的探索过程中带来巨大的推动力。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了四川省中医药管理局（2021YJ0175）和成都中医药大学临床医学院研究生科研创新项目（LCYJSKT2023-11）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
| Ammonia Solution | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anatomical Forceps | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J3C030 | |
| Anhydrous Ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Automatic Dyeing Machine | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
| Bone Microarchitecture Analysis Add-on | AnalyzeDirect, Inc | ||
| C57BL/6J mice | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Carrier Slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Coverslips | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Decalcification Solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Delicate Scissors | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | ZJA010 | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fiji: ImageJ | National Institutes of Health, USA | ||
| Film Sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| Freezing Table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| H&E Staining Kit | Leagene | DH0020 | |
| Hydrochloric Acid Solution | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| ImageJ2 Plugin | BoneJ 7.0.16 | ||
| Medical Gauze | Shandong Ang Yang Medical Technology Co. | ||
| Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures | Ethicon, Inc. | SA84G | |
| Needle Holder | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J32010 | |
| Neutral Balsam | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| PANNORAMIC Digital Slide Scanners | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Povidone-iodine solution 5% | Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Quantum GX2 microCT Imaging System | PerkinElmer, Inc. | ||
| Rotary Microtome | Thermo scientific | HM325 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Scan & Browse Software | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
| Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves | Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd | 22B141EO | |
| Sodium Chloride Solution 0.9% | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Sterile Hypodermic Syringes for Single Use | Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd | ||
| Sterile Medical Suture Needles | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | PW8068 | |
| Tissue Processor | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Tissue Spreading and Baking Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Tribromoethanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M2920 | |
| Wax Trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
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