Summary
Denne protokol præsenterer en økonomisk og effektiv metode til kvantitativ evaluering af knoglemikroarkitektur i en musemodel af osteoporose ved at kombinere Hematoxylin-Eosin (HE) farvning og mikrocomputertomografi (Micro-CT) teknikker.
Abstract
Knoglemikrostruktur refererer til arrangementet og kvaliteten af knoglevæv på mikroskopisk niveau. Forståelse af knoglemikrostrukturen i skelettet er afgørende for at få indsigt i osteoporoseens patofysiologi og forbedre behandlingen. Håndtering af knogleprøver kan dog være kompleks på grund af deres hårde og tætte egenskaber. For det andet gør specialiseret software billedbehandling og analyse vanskelig. I denne protokol præsenterer vi en omkostningseffektiv og brugervenlig løsning til trabekulær knoglemikrostrukturanalyse. Detaljerede trin og forholdsregler er angivet. Micro-CT er en ikke-destruktiv tredimensionel (3D) billeddannelsesteknik, der giver billeder i høj opløsning af trabekulær knoglestruktur. Det giver mulighed for objektiv og kvantitativ evaluering af knoglekvalitet, hvorfor det bredt betragtes som guldstandardmetoden til vurdering af knoglekvalitet. Imidlertid forbliver histomorfometri uundværlig, da den tilbyder afgørende parametre på celleniveau, der bygger bro mellem todimensionelle (2D) og 3D-vurderinger af knogleprøver. Hvad angår de histologiske teknikker, valgte vi at afkalke knoglevævet og derefter udføre traditionel paraffinindlejring. Sammenfattende kan kombinationen af disse to metoder give mere omfattende og præcise oplysninger om knoglemikrostruktur.
Introduction
Osteoporose er en udbredt metabolisk knoglesygdom, især blandt ældre, og er forbundet med en øget risiko for skrøbelighedsfrakturer. Da osteoporose bliver mere almindelig i Kina1, vil der være en stigende efterspørgsel efter at studere knoglestrukturerne hos små dyr 2,3. De tidligere metoder til måling af knogletab er afhængige af resultaterne af todimensionel røntgenabsorptiometri med dobbelt energi. Dette fanger imidlertid ikke ændringerne i den arkitektoniske mikrostruktur af den trabekulære knogle, hvilket er en nøglefaktor for skeletstyrke4. Mikrostrukturen af knogle påvirker dens styrke, stivhed og brudmodstand. Ved at sammenligne knoglemikroarkitektur i normale og patologiske tilstande kan ændringer i knoglevævsmorfologi, struktur og funktion forårsaget af osteoporose identificeres. Disse oplysninger bidrager til forståelsen af udviklingen af osteoporose og dens tilknytning til andre sygdomme.
Mikrocomputertomografi (Micro-CT) billeddannelse er for nylig blevet en populær teknik til knoglemorfologivurdering, hvor den kan give nøjagtige og omfattende data om knoglestruktur og densitetsparametre såsom knoglevolumenfraktion, tykkelse og adskillelse 5,6. Samtidig kan Micro-CT-resultaterne påvirkes af analysesoftwaren7. Forskellige metoder til billedindsamling, evaluering og rapportering anvendes af forskellige kommercielle Micro-CT-systemer. Denne inkonsekvens gør det vanskeligt at sammenligne og fortolke de resultater, der rapporteres af forskellige undersøgelser5. Det kan heller ikke i øjeblikket erstatte knoglehistomorfometri ved at give forskere information om parametre på celleniveau i skeletsystemet8. I mellemtiden tillader histologiske teknikker direkte observation og måling af knoglens mikroskopiske morfologi. Hæmatoxylin og eosin (HE) farvning er en almindelig farvningsteknik, der anvendes i histologi til at visualisere den generelle struktur af celler og væv. Det bruges til at identificere tilstedeværelsen af knoglevæv og dets mikroarkitektur.
Denne artikel bruger Micro-CT kombineret med vævsskæringsteknik (Hematoxylin-Eosin [HE] farvning) til at indsamle knoglevævsbilleder og udføre kvantitativ analyse af trabekulær knogle for at evaluere ændringerne i knoglemikrostruktur i en osteoporose musemodel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreprotokollen er godkendt af Animal Ethical Committee ved Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (rekordnummer: 2020-34). Hunmus C57BL/6J (12 uger gamle, n = 14) blev tilfældigt opdelt i to grupper, en falsk gruppe (Sham-gruppe, n = 7) og en modelgruppe (OVX-gruppe, n = 7). Dyrene blev købt hos en kommerciel leverandør (se Materialetabel). Alle mus blev holdt i individuelle bure ved 22-26 °C med 45%-55% fugtighed, fik lov til at tilpasse sig deres nye miljø i 1 uge og gav fri adgang til vand og kost. Alle dyreeksperimentelle undersøgelser blev udført på Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, og alle bestræbelser blev gjort for at minimere dyrs lidelse.
1. Forberedelse af dyremodeller
- Bedøv den 12 uger gamle mus ved intraperitoneal injektion med 1,25% Avertin (Tribromethanol i tert-amylalkohol, se materialetabel) i en dosis på 0,02 ml / g. Placer musen udsat på et sterilt kirurgisk operationsbord, og immobiliser dens lemmer ved at tape dem sikkert.
- Brug en saks (se Tabel over materialer) til at trimme hår, der kan påvirke den kirurgiske operation.
BEMÆRK: Det anbefales at undgå hudskader under forberedelsen af det kirurgiske sted. - Vask hænderne grundigt og tag kirurgiske handsker på. Desinficer musens ryg tre gange med povidon-jod (se Materialetabel), og brug medicinsk gaze (se Materialetabel) til at tørre den af.
BEMÆRK: Vær forsigtig; At få håret for vådt under desinfektion kan føre til postoperativ hypotermi hos mus. - Lav et snit ca. 0,5-1,0 cm langt, placeret 1 cm væk fra en tredjedel af midterlinjen på musens ryg, ved hjælp af en skalpel (se materialetabel). Adskil forsigtigt fascia og skær gennem musklen med vævssaks (se materialetabel), indtil æggestokken er synlig. Ligate de omgivende blodkar med ikke-absorberbare suturer (se tabel over materialer) og fjern æggestokken.
- Skyl hulrummet med 0,9% saltopløsning, og sutur derefter hud, muskler og fascia separat (se materialetabel).
- Gentag den samme rækkefølge af trin på den anden side.
- Fjern peri-ovariefedt af samme størrelse som æggestokken, og udfør den samme kirurgiske procedure nævnt ovenfor for de resterende trin for at etablere den skamopererede model.
- Tillad en restitutionsperiode på 1 uge efter operationen. Efter 8 uger vil osteoporotiske musemodeller med succes blive etableret 9,10.
2. Mikro-CT-scanning
- Aflive musen ved overskydende CO2 indånding. Fjern så meget blødt væv som muligt fra muselårbenet efter eutanasi og få en frisk prøve til scanning.
BEMÆRK: Selvom der ikke er nogen perfekt løsning til prøvebevarelse, kan der tages visse skridt for at maksimere kvaliteten af Micro-CT-scanningsresultater. Før fiksering skal du sørge for at fjerne så meget omgivende væv som muligt. Formalin eller bufret formalin er den mest foretrukne metode til fiksering med opbevaring i PBS11,12. - Dobbeltklik på softwareikonet for mikro-CT-billedbehandlingssystemet på skrivebordet for at starte systemet (se Materialetabel). Vælg en prøveseng, der er kompatibel med prøvesynsfeltet (FOV) på 18 mm x 18 mm. Læg det relevante prøveleje i maskinen, og luk lugen.
- Klik på knappen Opvarmning i Kontrolpanel.
BEMÆRK: En kort opvarmningstid var påkrævet. Forsøg ikke at åbne lugen, når der genereres røntgenstråler. Kontroller X-Ray On-lyset på frontpanelet og computerskærmen for at bekræfte, om der genereres røntgenstråler. - Klik på knappen Menu for at indstille en ny database, og opret derefter et nyt eksempel og en ny undersøgelse.
- Vælg Manuel på rullelisten Menu , og indtast brugerdefinerede spændings- og strømværdier i Kontrolpanel. Indstil Spænding (kV ) til 90, Strøm (μA ) til 80, Scanningstilstand til Høj opløsning, 14 min, og FOV (mm) til 18 mm x 18 mm.
BEMÆRK: Se manualen for forskellige mikro-CT-systemer for at indstille de relevante parametre. - Placer knoglen sikkert med plastfilm i prøvesengen. Luk lugen. Sørg for, at motivet er centreret præcist i X-capture-vinduet ved at trykke på justeringsknapperne på maskinen.
BEMÆRK: Justering af prøven skal være langsom og skånsom for at undgå, at den falder ned i maskinen ved et uheld. - Klik på knappen Start for at starte CT-scanningen.
3. CT-dataanalyse
- Indtast softwaren (se materialetabellen), og vælg de data, der skal analyseres. Klik på Sub , og indstil Pixelstørrelse til 10 μm. Flyt og tilpas størrelsen på interesseområdet (ROI) for at inkludere det distale lårben over vækstpladen. Klik på Start (se figur 1).
BEMÆRK: Pixelstørrelsen til rekonstruktion af undervolumen blev valgt til 10 μm, da tykkelsen af billeddannelsestrabeculae blev anslået til at være ca. 20-30 μm baseret på histologiske data fra tidligere undersøgelser13. Hvis signal-støj-forholdet er utilstrækkeligt til databehandling, skal der udføres en 1 times scanning med høj opløsning. - Klik på knappen Analyse 3D for at få den resulterende 3D-rekonstruktion .
- Eksporter dataene fra mikro-CT-systemet til computeren til analyse.
- Importer de rekonstruerede CT-data. Klik på Behandl > Billedberegner, og klik derefter på Regionblok > Interaktiv. Juster det gule afkrydsningsfelt til det relevante investeringsafkast.
BEMÆRK: Interesseområdet (ROI) begynder ca. 540 μm proksimalt til vækstpladen og strækker sig 1600 μm proximalt for at vurdere den faktiske knoglemetabolisme og ombygning. - Vælg tilføjelsesprogrammet Bone Microarchitecture Analysis (BMA) (se Materialetabel). Klik på Segment Cortex og derefter Segment Trabeculae.
BEMÆRK: Både trabekulær og kortikal knogle vælges automatisk. Normalt kræves der ingen manuel justering. - Klik på Gem endeligt objektkort , og klik derefter på Mål knogle for at beregne knoglemorfometriske indekser.
BEMÆRK: Kun relativ knoglemineraltæthed (BMD) blev beregnet her, da der ikke blev tilføjet kontrol.
4. Afkalkning af knoglevæv
- Fastgør knogleprøverne i 4% paraformaldehyd (se materialetabel) i 24 timer. Prøverne vaskes tre gange med PBS (se materialetabellen) i 20 minutter hver gang.
- Skyl vævet tre gange med destilleret vand i 20 minutter hver gang. Overfør vævet til en afkalkningsopløsning indeholdende EDTA (se materialetabel) og afkalk i 30 dage med en ugentlig opløsningsændring indtil slutpunktet.
BEMÆRK: Nålestik, håndklemning og fastspænding bruges til at afslutte afkalkning, når knoglevævet bliver blødt, eller der ikke er nogen følelse af modstand ved nål. Den fysiske metode til detektion kan forårsage skade på vævsstrukturen, så prøv at undgå overdreven kraft eller gentagen testning. - Tag vævet ud af fikseringsmidlet og brug en skalpel til at trimme vævet i en røghætte. Sæt det trimmede væv og den tilsvarende etiket i en dehydreringsboks.
- Sæt dehydreringsboksen i en kurv og dehydrer den i en vævsprocessor (se materialetabel) med gradientalkohol (75% ethanol i 4 timer, 85% ethanol i 2 timer, 90% ethanol i 2 timer, 95% ethanol i 1 time, vandfri ethanol i 30 min, vandfri ethanol II i 30 min, xylen I i 5-10 min, xylen II i 5-10 min, voks I i 1 time, voks II i 1 time, voks III i 1 time).
- Brug en indlejringsmaskine (se Materialetabel) til at indlejre det voksgennemblødte væv. Hæld den smeltede voks i en indlejringsboks og læg vævet fra dehydreringsboksen, før voksen hærder.
- Orienter vævet i henhold til indlejringsoverfladen og fastgør den tilsvarende etiket. Afkøles på et frysebord på -20 °C (se Materialetabel). Fjern voksblokken fra indlejringsboksen efter størkning, og trim voksblokken efter behov (se materialetabel).
- Skær den trimmede voksblok i 3 μm tykke dias på et mikrotomt (se materialetabel). Flyd objektglassene på 40 °C varmt vand på en vævsspredningsmaskine (se materialetabellen) for at flade vævet ud og øse dem op med et objektglas.
- Bages i en 60 °C ovn (se tabel over materialer), indtil vandet fordamper og voksen smelter. Tag ud og opbevar ved stuetemperatur (RT) til senere brug.
5. Han farvning
- Kom diasene i xylen I i 20 min, derefter i xylen II i 20 min. Sæt endvidere diasene i vandfri ethanol I og vandfri ethanol II i 5 minutter hver, 75% alkohol i 5 minutter, og vask derefter diasene med ledningsvand (se materialetabel).
- Inkuber i hæmatoxylin (se materialetabel) i 3-5 min. Prøverne differentieres med en saltsyreopløsning (se materialetabel). Behandl diasene med en ammoniakopløsning (se materialetabel) til bluing, og vask derefter diasene med vand.
- Sæt diasene i 85%, 95% gradientalkohol til dehydrering, og pletter med eosinopløsning (se materialetabel) i 5 min.
- Sæt diasene i vandfri ethanol I i 5 min, vandfri ethanol II i 5 minutter og vandfri ethanol III i 5 min. Behandl objektglassene med xylen I i 5 min, xylen II i 5 min, og monter dem med neutral balsam (se materialetabel).
- Undersøg hvert dias under mikroskopet. Vælg derefter de repræsentative skiver til panoramascanning (se materialetabel).
BEMÆRK: Der kræves mindst tre på hinanden følgende skiver til hver prøve. Før panoramascanning skal skiverne undersøges under et mikroskop for at sikre, at de er komplette og klare. Sørg for, at knoglemarvshulen, kortikal knogle og cancelløs knogle vises fuldt ud, og at forskellige typer knogleceller kan ses.
6. HE-billedanalyse
- Åbn HE-billeder med CaseViewer-software (se materialefortegnelse). Vælg interesseområdet (ROI) på sliden, og gem det som et farvebillede.
BEMÆRK: Valget af ROI er i overensstemmelse med ovennævnte software. - Åbn billedet i ImageJ (se Materialetabel). Vælg værktøjet Tryllestav på værktøjslinjen. Klik på den trabekulære knogle.
- Juster tolerancen og de sammenhængende indstillinger efter behov. Gå til Billede > justeringer > Sort-hvid , og klik på OK. Gentag trinene for andre områder af knoglen.
- Inverter markeringen og fyld den med hvid farve. Gem billedet som en maske til analyse (se figur 2).
BEMÆRK: For den detaljerede metode henvises til det tidligere offentliggjorte arbejde14. - Åbn masken i analysesoftwaren15,16 (se materialetabel). Kør proces > binær > Make Binary for at konvertere farvebilledet til et binært billede.
- Brug plugin 17 (se materialetabel) i softwaren til at analysere strukturelle parametre: Kør areal / volumenfraktion for at beregne knoglevolumen til total volumen af knogle (BV / TV [%])18,19.
BEMÆRK: Denne metode kan anvendes til knogletrabeculae og knoglemarv og udfylder hele ROI i HE-billederne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikro-CT-analyse
Vi målte de trabekulære mikroarkitektoniske parametre i mus fra begge grupper og rapporterede deres middelværdier og SD'er i tabel 1. Fordelingen af nogle parametre (dvs. forholdet mellem knoglevolumen og totalt vævsvolumen, trabekulær tykkelse, trabekulær adskillelse) inden for hver gruppe er illustreret i figur 3.
Disse resultater indikerer signifikante forskelle mellem mus af OVX og Sham-gruppen for en række parametre, der blev estimeret ud fra Micro-CT. Forholdet mellem knoglevolumen og totalt vævsvolumen (BV/TV) i OVX-gruppen var nemlig 3% lavere end i Sham-gruppen. Den trabekulære tykkelse hos mus af OVX var lavere end hos dem i Sham-gruppen, med en relativ forskelsprocent på 39,3%. Den trabekulære adskillelse i OVX-mus var større end hos Sham-mus. Figur 4 viser 3D-visninger af trabekulære ROI'er ekstraheret fra rekonstrueret knoglevolumen for hver gruppe. Sammenlignet med Sham-gruppen (figur 4A), knogletætheden hos mus efter ovariektomi, var trabeculae sparsomme og viste osteoporose (figur 4B).
HE-farvningsanalyse
Derudover bekræftede histopatologisk analyse de ændringer, der blev fundet i Micro-CT-analysen. Efter 8 uger viste HE-farvning, at den trabekulære knogle (rød) under vækstpladen af den distale lårben hos mus efter OVX blev reduceret sammenlignet med Sham-gruppen, og der var næsten ingen åbenbar tyk trabekulær struktur, og et stort antal fedtlignende granulater optrådte (figur 5A). Baseret på den kvantitative analyse af vævssektioner havde OVX-musene mindre trabekulært knogleområde end Sham-musene (figur 5B).
Figur 1: Skærmbillede af grænsefladen til rekonstruktion af undervolumen. En subvolume-rekonstruktion i det grønne rektangel for at komme ned til 10 μm i et 5,12 mm x 5,12 mm synsfelt (FOV). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Billedmaskekonstruktion i sort / hvid. (A1-A3): HE-billeder fra Sham-gruppen (skalabjælke = 200 μm). Bone trabeculae er vist i sort inden for det valgte område og andre væv i hvidt. (B1-B3) Billeder af OVX-gruppe (skalabjælke = 200 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Sammenligning af mikrostrukturelle parametre for distale lårbenstrabeculae mellem OVX- og Sham-grupper. (A) Forholdet mellem knoglevolumen og totalt vævsvolumen (BV/TV [%]) i OVX-gruppen var lavere end i Sham-gruppen. (B) Den trabekulære tykkelse (TB.Th [μm]) hos mus af OVX var lavere end i Sham-gruppen. (C) Den trabekulære separation (TB.sp [μm]) hos OVX-mus var større end hos Sham-mus. *P < 0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative mikro-CT-billeder af den trabekulære knogle i det distale lårben. Sammenlignet med (A) Sham-gruppen viste knogletætheden hos mus efter ovariektomi (B) sparsomme trabeculae og viste osteoporose. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Histologisk analyse af det trabekulære knogleområde i det distale lårben i OVX- og Sham-grupperne. (A) Repræsentative HE-farvede billeder af det distale lårben i hver gruppe (skalabjælke = 500 μm). Sorte pile viser trabeculae. (B) Den kvantitative analyse af det trabekulære knogleområde af det samlede vævsvolumen i det valgte ROI. *P < 0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Parameter | Humbug-drevet gruppe (SHAM) (n = 5). |
Ovariektomi gruppe (OVX) (n = 5). |
P-værdi |
| Forholdet mellem knoglevolumen og totalt vævsvolumen (%) | 7.3 ± 0.9 | 4.2 ± 0.5 | 0.012* |
| Trabekulær tykkelse (μm) | 79,5 ± 5,5 | 53,4 ± 6,0 | 0.013* |
| Trabekulær adskillelse (μm) | 212,5 ± 8,7 | 249,4 ± 8,3 | 0.015* |
| Værdier er middelværdien ± SD. * Signifikant anderledes (P<0,05). |
|||
Tabel 1: Trabekulære knogleparametre estimeret ud fra mikro-CT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Osteoporose kan føre til hyppige brud, som er dyre, kan forårsage smerte, handicap eller endda død og alvorligt påvirke patienternes livskvalitet20. I årenes løb er ovariektomimodellen blevet anerkendt som en af standardmetoderne til undersøgelse af osteoporose21. Den mest almindelige prækliniske dyremodel for osteoporose er ovariectomized (OVX) rotte. På trods af dette er størstedelen af forskningen i mekanismerne for knoglelidelser, herunder osteoporose, blevet udført med mus22. For at etablere en osteoporosemodel hos voksne kvindelige C57/BL6J-mus udføres ovariektomi ved 12 ugers alderen, hvilket er det optimale tidspunkt for denne procedure. Mus er modne og frugtbare fra 8-12 uger, og ovariektomi har en signifikant effekt på deres knoglemasse på dette tidspunkt10. Tidligere undersøgelser viser, at musens knogler vokser hurtigt inden 12 uger, og indikatorerne for knoglemorfologi, BMD og knoglebiomekanik øges hurtigt. Den totale BMD og kortikale knogle-BMD er signifikant korreleret med musenes alder. Efter 12 uger går musenes knoglemetabolisme imidlertid ind i en stabil periode, og ovenstående indikatorer har tendens til at være stabile23,24.
Knoglemikroarkitektur er blevet foreslået som den primære faktor, der påvirker knoglesvaghed, uafhængigt af BMD. Osteoporoseens knoglesvaghed forklares ikke fuldt ud af et underskud i knoglemasse. BMD kan kun forklare 60% -70% af knoglestyrken25. Med hensyn til strukturel sammensætning udgør kortikal knogle 80% af knoglemassen, mens cancelløs knogle kun udviser 10% af målingerne efter at have mistet 50% af knoglemassen, hvilket tyder på, at knoglemassemålinger alene ikke er tilstrækkelige til at vurdere knoglemassetab. Ud over knoglevolumen er strukturelle ændringer i knogletrabeculae afgørende for knoglestyrken. Cancellous knogle indeholder hæmatopoietisk knoglemarvsvæv eller fedtvæv. Dens overflade er ret stor, cirka otte gange større end den kortikale knogle. Dette store overfladeareal, der er forbundet med knoglemarven, gør det muligt for den annullerede knogle at have en ret høj knoglekonverteringsfrekvens. Derfor valgte vi mikrostrukturen af knogletrabeculae som hovedindikator for observation af osteoporotiske ændringer. Det trabekulære knoglevæv i skelettet gennemgår konstant ombygning under vækst, hvor nydannede knogletrabeculae erstatter de eksisterende og danner sekundær svampet knogle. Derfor er morfometrisk analyse af trabekulær knogle under normale forhold hovedsageligt fokuseret på det sekundære svampede knogleområde. Primært svampet knoglevæv er derimod en medfødt til stede og relativt stabil struktur, der ikke ombygges og derfor skal udelukkes fra analysen. Generelt kan knoglen inden for en vis afstand fra vækstpladen betragtes som aktivt ombygning af væv. Derfor valgte vi en region af interesse (ROI), der starter fra 540 μm over vækstpladen og spænder over 1600 μm i proksimal retning for analysen. Ifølge vores resultater udviser mus meget forskellige mikrostrukturelle egenskaber i trabekulære regioner efter ovariektomi.
Micro-CT-teknologien, der anvendes i denne undersøgelse, er en ikke-destruktiv 3D-billeddannelsesteknik, der er udviklet i de seneste årtier og anvendes gradvist til farmakologisk undersøgelse af etnomedicinske urter. Det giver en klar forståelse af prøvens interne mikrostruktur uden at ødelægge den. Med hensyn til den histopatologiske undersøgelse beskadiger harpiksindlejringsmetoden enzymaktivitet og proteinantigenicitet og kan ikke pålideligt anvendes til histokemi eller immunhistokemi26. Den traditionelle paraffinindlejring kan kombineres med teknikker som immunhistokemi (IHC), fluorescens in situ hybridisering (FISH) og konfokal laserscanningsmikroskop (CLSM) til kvantitativt at detektere stoffer med lav overflod i knoglevæv på molekylært niveau og derved få en dybere forståelse af mekanismerne og reguleringen af knoglemetabolisme. Den panoramiske diasscanner kan hurtigt konvertere dias til digitale billeder i høj opløsning, hvilket gør det muligt kvantitativt at analysere knoglehistomorfologidata ved hjælp af computersoftware. Sammenfattende kan kombinationen af mikro-CT og knoglehistomorfologi give en mere detaljeret og nøjagtig evaluering af knoglemikrostruktur.
Traditionelt var vurdering af knoglekvalitet stort set begrænset til røntgenabsorptiometri med dobbelt energi (DXA), computertomografi med begrænset opløsning eller teknisk udfordrende magnetisk resonansbilleddannelse27. Selvom kombinationen af de to teknikker har sine unikke fordele, har den også sine begrænsninger. For det første, selv om mikro-CT giver mulighed for langsigtet kontinuerlig overvågning af det samme dyr, er in vivo-billeddannelse af skeletmikrostrukturer i levende små dyr, især mus, stadig teknisk udfordrende28. For det andet gør fraværet af en struktureret og internationalt anerkendt protokol til indsamling og analyse af data fra forskellige instrumenter eller brugere det vanskeligt at sammenligne datasæt og reproducere forskningsresultater på tværs af undersøgelser. For det tredje er eksponering for ioniserende stråling uundgåelig på grund af egenskaberne ved Micro-CT. For det fjerde, selvom vores enkle og økonomiske protokol kan give kvantitativ analyse af HE-farvede knoglebilleder, er den hovedsageligt baseret på en halvautomatisk segmenteringsstrategi, som er mere besværlig end komplekse automatiserede metoder.
Afslutningsvis vil anvendelsen af denne teknologi utvivlsomt bringe en stor impuls til osteoporoseforskning inden for etnomedicin under udforskningsprocessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Sichuan Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine (2021YJ0175) og Graduate Research Innovation Project fra School of Clinical Medicine (LCYJSKT2023-11), Chengdu University of Traditional Chinese Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
| Ammonia Solution | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anatomical Forceps | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J3C030 | |
| Anhydrous Ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Automatic Dyeing Machine | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
| Bone Microarchitecture Analysis Add-on | AnalyzeDirect, Inc | ||
| C57BL/6J mice | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Carrier Slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Coverslips | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Decalcification Solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Delicate Scissors | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | ZJA010 | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fiji: ImageJ | National Institutes of Health, USA | ||
| Film Sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| Freezing Table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| H&E Staining Kit | Leagene | DH0020 | |
| Hydrochloric Acid Solution | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| ImageJ2 Plugin | BoneJ 7.0.16 | ||
| Medical Gauze | Shandong Ang Yang Medical Technology Co. | ||
| Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures | Ethicon, Inc. | SA84G | |
| Needle Holder | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J32010 | |
| Neutral Balsam | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| PANNORAMIC Digital Slide Scanners | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Povidone-iodine solution 5% | Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Quantum GX2 microCT Imaging System | PerkinElmer, Inc. | ||
| Rotary Microtome | Thermo scientific | HM325 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Scan & Browse Software | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
| Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves | Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd | 22B141EO | |
| Sodium Chloride Solution 0.9% | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Sterile Hypodermic Syringes for Single Use | Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd | ||
| Sterile Medical Suture Needles | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | PW8068 | |
| Tissue Processor | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Tissue Spreading and Baking Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Tribromoethanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M2920 | |
| Wax Trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Wang, J., et al. The prevalence of osteoporosis in China, a community based cohort study of osteoporosis. Frontiers in Public Health. 11, 1084005 (2023).
- Stein, M., et al. Why animal experiments are still indispensable in bone research: A statement by the European Calcified Tissue Society. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (8), 1045-1061 (2023).
- Kerschan-Schindl, K., Papageorgiou, M., Föger-Samwald, U., Butylina, M., Weber, M., Pietschmann, P. Assessment of bone microstructure by micro CT in C57BL/6J mice for sex-specific differentiation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 14585 (2022).
- Fonseca, H., Moreira-Gonçalves, D., Coriolano, H. J. A., Duarte, J. A. Bone quality: the determinants of bone strength and fragility. Sports Medicine. 44, 37-53 (2014).
- Bouxsein, M. L., Boyd, S. K., Christiansen, B. A., Guldberg, R. E., Jepsen, K. J., Müller, R. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Akhter, M. P., Recker, R. R. High resolution imaging in bone tissue research-review. Bone. 143, 115620 (2021).
- Mys, K., et al. Quantification of 3D microstructural parameters of trabecular bone is affected by the analysis software. Bone. 142, 115653 (2021).
- Chavassieux, P., Chapurlat, R. Interest of bone histomorphometry in bone pathophysiology investigation: Foundation, present, and future. Frontiers in Endocrinology. 13, 907914 (2022).
- Komori, T.
- Zhu, S., et al. Ovariectomy-induced bone loss in TNFα and IL6 gene knockout mice is regulated by different mechanisms. Journal of Molecular Endocrinology. 60 (3), 185-198 (2018).
- Baum, T., et al. Osteoporosis imaging: effects of bone preservation on MDCT-based trabecular bone microstructure parameters and finite element models. BMC Medical Imaging. 15, 22 (2015).
- Nazarian, A., Hermannsson, B. J., Muller, J., Zurakowski, D., Snyder, B. D. Effects of tissue preservation on murine bone mechanical properties. Journal of Biomechanics. 42 (1), 82-86 (2009).
- Martín-Badosa, E., Amblard, D., Nuzzo, S., Elmoutaouakkil, A., Vico, L., Peyrin, F. Excised bone structures in mice: imaging at three-dimensional synchrotron radiation micro CT. Radiology. 229 (3), 921-928 (2003).
- Egan, K. P., Brennan, T. A., Pignolo, R. J. Bone histomorphometry using free and commonly available software. Histopathology. 61 (6), 1168-1173 (2012).
- Brandi, M. L. Microarchitecture, the key to bone quality. Rheumatology. 48 (suppl_4), iv3-iv8 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Domander, R., Felder, A. A., Doube, M.
- Parfitt, A. M., et al. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units: report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. Journal of Bone and Mineral Research. 2 (6), 595-610 (1987).
- Kazama, J. J., Koda, R., Yamamoto, S., Narita, I., Gejyo, F., Tokumoto, A. Cancellous bone volume is an indicator for trabecular bone connectivity in dialysis patients. Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 5 (2), 292-298 (2010).
- Watts, N. B. Postmenopausal osteoporosis: A clinical review. Journal of Women's Health. 27 (9), 1093-1096 (2018).
- Thompson, D. D., Simmons, H. A., Pirie, C. M., Ke, H. Z. FDA Guidelines and animal models for osteoporosis. Bone. 17 (4), S125-S133 (1995).
- Iwaniec, U. T., Yuan, D., Power, R. A., Wronski, T. J. Strain-dependent variations in the response of cancellous bone to ovariectomy in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (7), 1068-1074 (2006).
- Ferguson, V. L., Ayers, R. A., Bateman, T. A., Simske, S. J. Bone development and age-related bone loss in male C57BL/6J mice. Bone. 33 (3), 387-398 (2003).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (8), 1197-1207 (2007).
- Seeman, E. The structural and biomechanical basis of the gain and loss of bone strength in women and men. Endocrinology and Metabolism Clinics. 32 (1), 25-38 (2003).
- Ticha, P., et al. A novel cryo-embedding method for in-depth analysis of craniofacial mini pig bone specimens. Scientific Reports. 10 (1), 19510 (2020).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology. 47 (suppl_4), iv9-iv16 (2008).
- Zaw Thin, M., Moore, C., Snoeks, T., Kalber, T., Downward, J., Behrens, A. Micro-CT acquisition and image processing to track and characterize pulmonary nodules in mice. Nature Protocols. 18 (3), 990-1015 (2023).
