Summary
Dit protocol presenteert een economische en efficiënte methode voor kwantitatieve evaluatie van botmicroarchitectuur in een muismodel van osteoporose door Hematoxyline-Eosine (HE) kleuring en micro-computertomografie (Micro-CT) technieken te combineren.
Abstract
Botmicrostructuur verwijst naar de rangschikking en kwaliteit van botweefsel op microscopisch niveau. Inzicht in de botmicrostructuur van het skelet is cruciaal om inzicht te krijgen in de pathofysiologie van osteoporose en de behandeling ervan te verbeteren. Het hanteren van botmonsters kan echter complex zijn vanwege hun harde en dichte eigenschappen. Ten tweede maakt gespecialiseerde software beeldverwerking en -analyse moeilijk. In dit protocol presenteren we een kosteneffectieve en gebruiksvriendelijke oplossing voor trabeculaire botmicrostructuuranalyse. Er worden gedetailleerde stappen en voorzorgsmaatregelen gegeven. Micro-CT is een niet-destructieve driedimensionale (3D) beeldvormingstechniek die beelden met een hoge resolutie van de trabeculaire botstructuur oplevert. Het maakt de objectieve en kwantitatieve evaluatie van de botkwaliteit mogelijk, en daarom wordt het algemeen beschouwd als de gouden standaardmethode voor de beoordeling van de botkwaliteit. Histomorfometrie blijft echter onmisbaar omdat het cruciale parameters op cellulair niveau biedt en de kloof overbrugt tussen tweedimensionale (2D) en 3D-beoordelingen van botmonsters. Wat de histologische technieken betreft, hebben we ervoor gekozen om het botweefsel te ontkalken en vervolgens traditionele paraffine-inbedding uit te voeren. Samenvattend kan het combineren van deze twee methoden uitgebreidere en nauwkeurigere informatie opleveren over de microstructuur van botten.
Introduction
Osteoporose is een veel voorkomende metabole botziekte, vooral bij ouderen, en wordt in verband gebracht met een verhoogd risico op fragiliteitsfracturen. Naarmate osteoporose vaker voorkomt in China1, zal er een groeiende vraag zijn naar het bestuderen van de botstructuren van kleine dieren 2,3. De vorige methoden voor het meten van botverlies zijn gebaseerd op de resultaten van tweedimensionale dual-energy röntgenabsorptiometrie. Dit legt echter niet de veranderingen in de architecturale microstructuur van het trabeculaire bot vast, wat een sleutelfactor is voor skeletsterkte4. De microstructuur van bot beïnvloedt de sterkte, stijfheid en breukbestendigheid. Door botmicroarchitectuur in normale en pathologische toestanden te vergelijken, kunnen veranderingen in de morfologie, structuur en functie van botweefsel veroorzaakt door osteoporose worden geïdentificeerd. Deze informatie draagt bij aan het begrip van de ontwikkeling van osteoporose en de associatie ervan met andere ziekten.
Microcomputertomografie (Micro-CT) beeldvorming is onlangs een populaire techniek geworden voor de beoordeling van botmorfologie, waar het nauwkeurige en uitgebreide gegevens kan opleveren over botstructuur- en dichtheidsparameters zoals botvolumefractie, dikte en scheiding 5,6. Tegelijkertijd kunnen de Micro-CT-resultaten worden beïnvloed door de analysesoftware7. Verschillende methoden voor beeldacquisitie, evaluatie en rapportage worden gebruikt door verschillende commerciële Micro-CT-systemen. Deze inconsistentie maakt het moeilijk om de resultaten van verschillende onderzoeken te vergelijken en te interpreteren5. Ook kan het momenteel geen bothistomorfometrie vervangen door onderzoekers informatie te verschaffen over parameters op cellulair niveau in het skelet8. Ondertussen maken histologische technieken directe observatie en meting van de microscopische morfologie van bot mogelijk. Hematoxyline- en eosinekleuring (HE) is een veelgebruikte kleuringstechniek die in de histologie wordt gebruikt om de algemene structuur van cellen en weefsels te visualiseren. Het wordt gebruikt om de aanwezigheid van botweefsel en de microarchitectuur ervan te identificeren.
Dit artikel maakt gebruik van Micro-CT in combinatie met weefselsnijtechniek (Hematoxyline-Eosine [HE]-kleuring) om botweefselbeelden te verzamelen en kwantitatieve analyse van trabeculair bot uit te voeren om de veranderingen in de botmicrostructuur in een osteoporosemuismodel te evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het dierprotocol is goedgekeurd door de Animal Ethical Committee van de Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (Recordnummer: 2020-34). Vrouwelijke C57BL/6J-muizen (12 weken oud, n = 14) werden willekeurig verdeeld in twee groepen, een schijngroep (Sham-groep, n = 7) en een modelgroep (OVX-groep, n = 7). De dieren werden gekocht bij een commerciële leverancier (zie Materiaaltabel). Alle muizen werden gehouden in individuele kooien bij 22-26 °C met een luchtvochtigheid van 45%-55%, mochten zich gedurende 1 week aanpassen aan hun nieuwe omgeving en kregen gratis toegang tot water en dieet. Alle dierproeven werden uitgevoerd aan de Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, en alles werd in het werk gesteld om dierenleed tot een minimum te beperken.
1. Voorbereiding van diermodellen
- Verdoof de 12 weken oude muis door intraperitoneale injectie met 1,25% Avertin (tribroomethanol in tert-amylalcohol, zie materiaaltabel) in een dosering van 0,02 ml/g. Plaats de muis liggend op een steriele chirurgische operatietafel en immobiliseer zijn ledematen door ze stevig vast te plakken.
- Gebruik een schaar (zie Materiaaltabel) om haar te knippen dat van invloed kan zijn op de chirurgische ingreep.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om huidbeschadiging te voorkomen tijdens het voorbereiden van de operatieplaats. - Was de handen grondig en trek chirurgische handschoenen aan. Desinfecteer de rug van de muis drie keer met povidonjodium (zie Materiaaltabel) en gebruik medisch gaas (zie Materiaaltabel) om het af te drogen.
OPMERKING: Wees voorzichtig; Als het haar te nat wordt tijdens het desinfecteren, kan dit leiden tot postoperatieve onderkoeling bij muizen. - Maak met een scalpel een incisie van ongeveer 0,5-1,0 cm lang, op 1 cm afstand van een derde van de middellijn van de rug van de muis (zie Materiaaltabel). Scheid de fascia voorzichtig en knip de spier door met een weefselschaar (zie Materiaaltabel) totdat de eierstok zichtbaar is. Maak de omliggende bloedvaten los met niet-resorbeerbare hechtingen (zie Materiaaltabel) en verwijder de eierstok.
- Spoel de holte af met een zoutoplossing van 0,9% en hecht vervolgens de huid, spieren en fascia afzonderlijk (zie Materiaaltabel).
- Herhaal dezelfde reeks stappen aan de andere kant.
- Verwijder peri-ovariumvet van dezelfde grootte als de eierstok en voer dezelfde chirurgische procedure uit als hierboven vermeld voor de resterende stappen om het schijnmodel vast te stellen.
- Houd rekening met een herstelperiode van 1 week na de operatie. Na 8 weken zullen osteoporotische muismodellen met succes worden vastgesteld 9,10.
2. Micro-CT-scannen
- Euthanaseer de muis door overmatige CO2 -inademing. Verwijder na euthanasie zoveel mogelijk zacht weefsel van het dijbeen van de muis en verkrijg een nieuw monster om te scannen.
OPMERKING: Hoewel er geen perfecte oplossing is voor het bewaren van monsters, kunnen bepaalde stappen worden genomen om de kwaliteit van de resultaten van de Micro-CT-scan te maximaliseren. Zorg ervoor dat u vóór de fixatie zoveel mogelijk omringend weefsel verwijdert. Formaline of gebufferde formaline is de meest geprefereerde methode van fixatie met opslag in PBS11,12. - Dubbelklik op het pictogram van de micro-CT-beeldvormingssysteemsoftware op het bureaublad om het systeem te starten (zie Materiaaltabel). Selecteer een monsterbed dat compatibel is met het gezichtsveld van de monsters. Plaats het juiste monsterbed in de machine en sluit het luik.
- Klik op de knop Opwarmen in het Configuratiescherm.
OPMERKING: Er was een korte opwarmtijd nodig. Probeer het luik niet te openen wanneer er röntgenstralen worden gegenereerd. Controleer het X-Ray On-lampje op het voorpaneel en de computermonitor om te bevestigen of er röntgenstralen worden gegenereerd. - Klik op de knop Menu om een nieuwe database in te stellen en maak vervolgens een nieuw voorbeeld en onderzoek.
- Selecteer Handmatig in de vervolgkeuzelijst Menu en voer aangepaste spannings- en stroomwaarden in het Configuratiescherm in. Stel de spanning (kV ) in op 90, de stroom (μA ) op 80, de scanmodus op hoge resolutie, 14 minuten en het gezichtsveld (mm) op 18 mm x 18 mm.
NOTITIE: Raadpleeg de handleiding voor verschillende micro-CT-systemen om de juiste parameters in te stellen. - Plaats het bot stevig met plastic folie in het monsterbed. Sluit het luik. Zorg ervoor dat het onderwerp precies gecentreerd is in het X-capture-venster door op de aanpassingsknoppen op het apparaat te drukken.
NOTITIE: Het afstellen van het monster moet langzaam en voorzichtig zijn om te voorkomen dat het per ongeluk in de machine valt. - Klik op de Start knop om de CT-scan te starten.
3. Analyse van CT-gegevens
- Voer de software in (zie Materiaaltabel) en selecteer de gegevens die moeten worden geanalyseerd. Klik op Sub en stel de pixelgrootte in op 10 μm. Verplaats en wijzig de grootte van het interessegebied (ROI) om het distale dijbeen boven de groeischijf op te nemen. Klik op Start (zie figuur 1).
OPMERKING: De pixelgrootte van de subvolumereconstructie werd geselecteerd op 10 μm, aangezien de dikte van de beeldvormende trabeculae werd geschat op ongeveer 20-30 μm op basis van histologische gegevens uit eerdere onderzoeken13. Als de signaal-ruisverhouding onvoldoende is voor gegevensverwerking, moet een scan van 1 uur met hoge resolutie worden uitgevoerd. - Klik op de Analyse 3D knop om de resulterende 3D-reconstructie te krijgen.
- Exporteer de gegevens van het micro-CT-systeem naar de computer voor analyse.
- Importeer de gereconstrueerde CT-gegevens. Klik op 'Verwerk > afbeeldingscalculator' en klik vervolgens op ' Regiopad' > interactief. Pas het gele selectievakje aan op de juiste ROI.
OPMERKING: Het interessegebied (ROI) begint ongeveer 540 μm proximaal van de groeischijf en strekt zich proximaal uit tot 1600 μm om het werkelijke botmetabolisme en de remodellering te beoordelen. - Selecteer de add-on Bone Microarchitecture Analysis (BMA) (zie Tabel met materialen). Klik op Cortex segmenteren en vervolgens op Trabeculae segmenteren.
OPMERKING: Zowel trabeculair als corticaal bot worden automatisch geselecteerd. Normaal gesproken is er geen handmatige aanpassing nodig. - Klik op Definitieve objectkaart opslaan en klik vervolgens op Bot meten om botmorfometrische indices te berekenen.
OPMERKING: Hier werd alleen de relatieve botmineraaldichtheid (BMD) berekend, aangezien er geen controle werd toegevoegd.
4. Ontkalking van botweefsel
- Fixeer de botmonsters gedurende 24 uur in 4% paraformaldehyde (zie materiaaltabel). Was de monsters driemaal met PBS (zie Materiaaltabel) gedurende 20 minuten per keer.
- Spoel het weefsel driemaal af met gedestilleerd water gedurende 20 minuten per keer. Breng het weefsel over in een ontkalkingsoplossing die EDTA bevat (zie Materiaaltabel) en ontkalk gedurende 30 dagen met een wekelijkse verandering van oplossing tot het eindpunt.
NOTITIE: Naaldprikken, knijpen in de hand en klemmen worden gebruikt om ontkalking te beëindigen wanneer het botweefsel zacht wordt of er geen gevoel van weerstand is bij het naalden. De fysieke detectiemethode kan enige schade aan de weefselstructuur veroorzaken, dus probeer overmatige kracht of herhaald testen te vermijden. - Haal het weefsel uit het fixeermiddel en gebruik een scalpel om het weefsel in een zuurkast te knippen. Doe het bijgesneden zakdoekje en het bijbehorende etiket in een uitdrogingsdoos.
- Doe de droogbox in een mand en dehydrateer deze in een tissueprocessor (zie Materiaaltabel) met gradiëntalcohol (75% ethanol gedurende 4 uur, 85% ethanol gedurende 2 uur, 90% ethanol gedurende 2 uur, 95% ethanol gedurende 1 uur, watervrije ethanol gedurende 30 min, watervrije ethanol II gedurende 30 min, xyleen I gedurende 5-10 min, xyleen II gedurende 5-10 min, was I gedurende 1 uur, was II gedurende 1 uur, was III gedurende 1 uur).
- Gebruik een inbeddingsmachine (zie Materiaaltabel) om het met was doordrenkte weefsel in te bedden. Giet de gesmolten was in een inbeddingsdoos en plaats het weefsel uit de droogdoos voordat de was hard wordt.
- Oriënteer het weefsel volgens het inbeddingsoppervlak en breng het bijbehorende label aan. Koel af op een vriestafel van -20 °C (zie Materiaaltabel). Haal het wasblok na het stollen uit de inbeddingsdoos en knip het wasblok indien nodig bij (zie Materiaaltabel).
- Snijd het bijgesneden wasblok in glaasjes van 3 μm dik op een microtoom (zie Materiaaltabel). Laat de glaasjes op 40 °C warm water drijven op een weefselspreidmachine (zie Materiaaltabel) om het weefsel plat te maken en schep ze op met een objectglaasje.
- Bak in een oven van 60 °C (zie Materiaaltabel) tot het water verdampt is en de was smelt. Haal eruit en bewaar bij kamertemperatuur (RT) voor later gebruik.
5. HE-kleuring
- Leg de glaasjes 20 minuten in xyleen I en vervolgens 20 minuten in xyleen II. Leg de objectglaasjes verder 5 minuten in watervrije ethanol I en watervrije ethanol II, 5 minuten in 75% alcohol en was de glaasjes vervolgens met kraanwater (zie Materiaaltabel).
- Incubeer in hematoxyline (zie Materiaaltabel) gedurende 3-5 min. Differentieer de monsters met een zoutzuuroplossing (zie Materiaaltabel). Behandel de objectglaasjes met een ammoniakoplossing (zie Materiaaltabel) voor blauwvorming en was de glaasjes vervolgens met water.
- Leg de glaasjes in 85%, 95% gradiëntalcohol voor uitdroging en kleur ze gedurende 5 minuten met eosine-oplossing (zie Materiaaltabel).
- Leg de glaasjes 5 minuten in watervrije ethanol I, 5 minuten in watervrije ethanol II en 5 minuten in watervrije ethanol III. Behandel de objectglaasjes gedurende 5 minuten met xyleen I, gedurende 5 minuten met xyleen II en monteer met neutraal balsem (zie Materiaaltabel).
- Bestudeer elk objectglaasje onder de microscoop. Kies vervolgens de representatieve segmenten voor panoramisch scannen (zie Tabel met materialen).
OPMERKING: Voor elk monster zijn ten minste drie opeenvolgende plakjes vereist. Vóór het panoramisch scannen moeten de plakjes onder een microscoop worden onderzocht om er zeker van te zijn dat ze volledig en helder zijn. Zorg ervoor dat de beenmergholte, het corticale bot en het poreuze bot volledig worden weergegeven en dat verschillende soorten botcellen te zien zijn.
6. HE-beeldanalyse
- Open HE-afbeeldingen met CaseViewer-software (zie Tabel met materialen). Selecteer het interessegebied (ROI) op de dia en sla het op als een kleurenafbeelding.
OPMERKING: De selectie van ROI is consistent met de bovengenoemde software. - Open de afbeelding in ImageJ (zie Tabel met materialen). Selecteer het gereedschap Toverstaf op de werkbalk. Klik op het trabeculaire bot.
- Pas de tolerantie en aaneengesloten instellingen naar wens aan. Ga naar Afbeelding > Aanpassingen > Zwart-wit en klik op OK. Herhaal de stappen voor andere delen van het bot.
- Keer de selectie om en vul deze met witte kleur. Sla de afbeelding op als een masker voor analyse (zie afbeelding 2).
OPMERKING: Voor de gedetailleerde methodologie, zie het eerder gepubliceerde werk14. - Open het masker in de analysesoftware15,16 (zie Tabel met materialen). Voer Process > Binary > Make Binary uit om de kleurenafbeelding om te zetten in een binaire afbeelding.
- Gebruik plugin 17 (zie Tabel met materialen) in de software om structurele parameters te analyseren: Run Area/Volume Fraction om het botvolume te berekenen naar het totale botvolume (BV/TV [%])18,19.
OPMERKING: Deze methode is van toepassing op bottrabeculae en beenmerg, waarbij de volledige ROI in de HE-afbeeldingen wordt ingevuld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Micro-CT-analyse
We maten de trabeculaire microarchitecturale parameters bij muizen uit beide groepen en rapporteerden hun gemiddelde waarden en SD's in tabel 1. De verdeling van enkele parameters (d.w.z. de verhouding tussen botvolume en totaal weefselvolume, trabeculaire dikte, trabeculaire scheiding) binnen elke groep wordt geïllustreerd in figuur 3.
Deze resultaten duiden op significante verschillen tussen muizen van de OVX- en Sham-groep voor een aantal parameters die werden geschat op basis van Micro-CT. De verhouding tussen botvolume en totaal weefselvolume (BV/TV) in de OVX-groep was namelijk 3% lager dan die in de Sham-groep. De trabeculaire dikte bij muizen van OVX was lager dan bij die van de Sham-groep, met een relatief verschilpercentage van 39,3%. De trabeculaire scheiding bij OVX-muizen was groter dan die bij Sham-muizen. Figuur 4 toont 3D-weergaven van trabeculaire ROI's geëxtraheerd uit gereconstrueerd botvolume voor elke groep. Vergeleken met de Sham-groep (Figuur 4A), was de botdichtheid van muizen na ovariëctomie, de trabeculae schaars en vertoonden ze osteoporose (Figuur 4B).
Analyse van HE-kleuring
Bovendien bevestigde histopathologische analyse de veranderingen die in de Micro-CT-analyse werden gevonden. Na 8 weken toonde HE-kleuring aan dat het trabeculaire bot (rood) onder de groeischijf van het distale dijbeen van muizen na OVX was verminderd in vergelijking met de Sham-groep, en er was bijna geen duidelijke dikke trabeculaire structuur en er verscheen een groot aantal vetachtige korrels (Figuur 5A). Op basis van de kwantitatieve analyse van weefselsecties hadden de OVX-muizen minder trabeculair botoppervlak dan de Sham-muizen (Figuur 5B).
Figuur 1: Screenshot van de interface van subvolumereconstructie. Een subvolumereconstructie in de groene rechthoek om tot 10 μm te komen in een gezichtsveld (FOV) van 5,12 mm x 5,12 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Constructie van het beeldmasker in zwart-wit. (A1-A3): HE Afbeeldingen uit de Sham-groep (schaalbalk = 200 μm). Bottrabeculae worden in het zwart weergegeven in het geselecteerde gebied en andere weefsels in het wit. (B1-B3) Afbeeldingen van de OVX-groep (schaalbalk = 200 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vergelijking van microstructurele parameters van distale femorale trabeculae tussen OVX- en Sham-groepen. (A) De verhouding tussen het botvolume en het totale weefselvolume (BV/TV [%]) in de OVX-groep was lager dan die in de Sham-groep. (B) De trabeculaire dikte (TB.Th [μm]) bij muizen van OVX was lager dan in de Sham-groep. (C) De trabeculaire scheiding (TB.sp [μm]) bij OVX-muizen was groter dan bij Sham-muizen. *P < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve micro-CT-beelden van het trabeculair bot in het distale dijbeen. Vergeleken met de (A) Sham-groep vertoonde de botdichtheid van muizen na ovariëctomie (B) schaarse trabeculae en vertoonde osteoporose. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Histologische analyse van het trabeculaire botgebied in het distale dijbeen van OVX- en Sham-groepen. (A) Representatieve HE-gekleurde beelden van het distale dijbeen in elke groep (schaalbalk = 500 μm). Zwarte pijlen tonen trabeculae. (B) De kwantitatieve analyse van het trabeculaire botgebied van het totale weefselvolume in de geselecteerde ROI. *P < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Parameter | Schijn-geëxploiteerde groep (SHAM) (n = 5). |
Ovariëctomie groep (OVX) (n = 5). |
P-waarde |
| Verhouding tussen botvolume en totaal weefselvolume (%) | 7,3 ± 0,9 | 4,2 ± 0,5 | 0.012* |
| Trabeculaire dikte (μm) | 79,5 ± 5,5 | 53,4 ± 6,0 | 0.013* |
| Trabeculaire scheiding (μm) | 212,5 ± 8,7 | 249,4 ± 8,3 | 0.015* |
| Waarden zijn het gemiddelde ± SD. * Significant verschillend (P<0.05). |
|||
Tabel 1: Trabeculaire botparameters geschat op basis van Micro-CT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Osteoporose kan leiden tot frequente fracturen, die kostbaar zijn, pijn, invaliditeit of zelfs de dood kunnen veroorzaken en de kwaliteit van leven van patiënten ernstig kunnen aantasten20. In de loop der jaren is het ovariëctomiemodel erkend als een van de standaardmethoden voor het bestuderen van osteoporose21. Het meest voorkomende preklinische diermodel voor osteoporose is de ovariëctomie (OVX) rat. Desondanks is het grootste deel van het onderzoek naar de mechanismen van botaandoeningen, waaronder osteoporose, uitgevoerd met muizen22. Om een osteoporosemodel op te stellen bij volwassen vrouwelijke C57/BL6J-muizen, wordt de ovariëctomie uitgevoerd op de leeftijd van 12 weken, wat het optimale moment is voor deze procedure. Muizen zijn volwassen en vruchtbaar vanaf de leeftijd van 8-12 weken, en ovariëctomie heeft op dit moment een significant effect op hun botmassa10. Eerdere studies tonen aan dat de botten van muizen vóór 12 weken snel groeien en dat de indicatoren van botmorfologie, BMD en botbiomechanica snel toenemen. De totale BMD en de BMD van het corticale bot zijn significant gecorreleerd met de leeftijd van de muizen. Na 12 weken komt het botmetabolisme van muizen echter in een stabiele periode en zijn de bovenstaande indicatoren meestal stabiel23,24.
Botmicroarchitectuur is voorgesteld als de belangrijkste factor die de kwetsbaarheid van het bot beïnvloedt, onafhankelijk van BMD. De botfragiliteit van osteoporose wordt niet volledig verklaard door een tekort aan botmassa. BMD kan slechts 60%-70% van de botsterkte verklaren25. In termen van structurele samenstelling omvat corticaal bot 80% van de botmassa, terwijl poreus bot slechts 10% van de metingen vertoont na verlies van 50% van de botmassa, wat suggereert dat botmassametingen alleen niet voldoende zijn om het verlies van botmassa te beoordelen. Naast het botvolume zijn structurele veranderingen in bottrabeculae van cruciaal belang voor de botsterkte. Poreus bot bevat hematopoëtisch beenmergweefsel of vetweefsel. Het oppervlak is vrij groot, ongeveer acht keer groter dan dat van corticaal bot. Dit grote oppervlak dat verbonden is met het beenmerg zorgt ervoor dat het poreuze bot een vrij hoge botconversiesnelheid heeft. Daarom hebben we de microstructuur van bottrabeculae gekozen als de belangrijkste indicator voor het waarnemen van osteoporotische veranderingen. Het trabeculaire botweefsel in het skelet ondergaat tijdens de groei voortdurend een remodellering, waarbij nieuw gevormde bottrabeculae de bestaande vervangen en secundair sponsachtig bot vormen. Daarom is morfometrische analyse van trabeculair bot onder normale omstandigheden voornamelijk gericht op het secundaire sponsachtige botgebied. Primair sponsachtig botweefsel daarentegen is een aangeboren aanwezige en relatief stabiele structuur die niet wordt gemodelleerd en dus moet worden uitgesloten van de analyse. Over het algemeen kan het bot binnen een bepaalde afstand van de groeischijf worden beschouwd als actief remodellerend weefsel. Daarom hebben we voor de analyse een interessegebied (ROI) geselecteerd dat begint bij 540 μm boven de groeischijf en 1600 μm in de proximale richting overspant. Volgens onze bevindingen vertonen muizen zeer verschillende microstructurele kenmerken in trabeculaire regio's na ovariëctomie.
De Micro-CT-technologie die in dit onderzoek wordt gebruikt, is een niet-destructieve 3D-beeldvormingstechniek die de afgelopen decennia is ontwikkeld en geleidelijk wordt toegepast op de farmacologische studie van etnomedicinale kruiden. Het geeft een duidelijk inzicht in de interne microstructuur van het monster zonder het te vernietigen. Wat het histopathologisch onderzoek betreft, beschadigt de harsinbeddingsmethode de enzymactiviteit en de antigeniciteit van eiwitten en kan deze niet op betrouwbare wijze worden gebruikt voor histochemie of immunohistochemie26. De traditionele paraffine-inbedding kan worden gecombineerd met technieken zoals immunohistochemie (IHC), fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en confocale laserscanmicroscoop (CLSM) om stoffen met een lage abundantie in botweefsel op moleculair niveau kwantitatief te detecteren, waardoor een dieper begrip wordt verkregen van de mechanismen en regulatie van het botmetabolisme. De panoramische glaasjesscanner kan dia's snel omzetten in digitale beelden met een hoge resolutie, waardoor het mogelijk wordt om bothistomorfologische gegevens kwantitatief te analyseren met behulp van computersoftware. Samenvattend kan de combinatie van Micro-CT en bothistomorfologie een meer gedetailleerde en nauwkeurige evaluatie van de botmicrostructuur opleveren.
Traditioneel was de beoordeling van de botkwaliteit grotendeels beperkt tot dual-energy röntgenabsorptiometrie (DXA), computertomografie met beperkte resolutie of technisch uitdagende magnetische resonantiebeeldvorming27. Hoewel de combinatie van de twee technieken zijn unieke voordelen heeft, heeft het ook zijn beperkingen. Ten eerste, hoewel micro-CT het mogelijk maakt om hetzelfde dier op lange termijn continu te monitoren, is in vivo beeldvorming van skeletmicrostructuren bij levende kleine dieren, met name muizen, nog steeds technisch uitdagend28. Ten tweede maakt het ontbreken van een gestructureerd en internationaal erkend protocol voor het verkrijgen en analyseren van gegevens van verschillende instrumenten of gebruikers het moeilijk om datasets te vergelijken en onderzoeksresultaten in verschillende onderzoeken te reproduceren. Ten derde is blootstelling aan ioniserende straling vanwege de kenmerken van Micro-CT onvermijdelijk. Ten vierde, hoewel ons eenvoudige en economische protocol een kwantitatieve analyse van HE-gekleurde botafbeeldingen kan bieden, is het voornamelijk gebaseerd op een semi-automatische segmentatiestrategie, die arbeidsintensiever is dan complexe geautomatiseerde methoden.
Kortom, de toepassing van deze technologie zal ongetwijfeld een grote impuls geven aan het osteoporose-onderzoek in de etnogeneeskunde tijdens het exploratieproces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Sichuan Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine (2021YJ0175) en het Graduate Research Innovation Project van de School of Clinical Medicine (LCYJSKT2023-11), Chengdu University of Traditional Chinese Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
| Ammonia Solution | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anatomical Forceps | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J3C030 | |
| Anhydrous Ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Automatic Dyeing Machine | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
| Bone Microarchitecture Analysis Add-on | AnalyzeDirect, Inc | ||
| C57BL/6J mice | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Carrier Slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Coverslips | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Decalcification Solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Delicate Scissors | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | ZJA010 | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fiji: ImageJ | National Institutes of Health, USA | ||
| Film Sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| Freezing Table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| H&E Staining Kit | Leagene | DH0020 | |
| Hydrochloric Acid Solution | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| ImageJ2 Plugin | BoneJ 7.0.16 | ||
| Medical Gauze | Shandong Ang Yang Medical Technology Co. | ||
| Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures | Ethicon, Inc. | SA84G | |
| Needle Holder | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J32010 | |
| Neutral Balsam | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| PANNORAMIC Digital Slide Scanners | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Povidone-iodine solution 5% | Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Quantum GX2 microCT Imaging System | PerkinElmer, Inc. | ||
| Rotary Microtome | Thermo scientific | HM325 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Scan & Browse Software | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
| Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves | Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd | 22B141EO | |
| Sodium Chloride Solution 0.9% | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Sterile Hypodermic Syringes for Single Use | Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd | ||
| Sterile Medical Suture Needles | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | PW8068 | |
| Tissue Processor | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Tissue Spreading and Baking Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Tribromoethanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M2920 | |
| Wax Trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Wang, J., et al. The prevalence of osteoporosis in China, a community based cohort study of osteoporosis. Frontiers in Public Health. 11, 1084005 (2023).
- Stein, M., et al. Why animal experiments are still indispensable in bone research: A statement by the European Calcified Tissue Society. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (8), 1045-1061 (2023).
- Kerschan-Schindl, K., Papageorgiou, M., Föger-Samwald, U., Butylina, M., Weber, M., Pietschmann, P. Assessment of bone microstructure by micro CT in C57BL/6J mice for sex-specific differentiation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 14585 (2022).
- Fonseca, H., Moreira-Gonçalves, D., Coriolano, H. J. A., Duarte, J. A. Bone quality: the determinants of bone strength and fragility. Sports Medicine. 44, 37-53 (2014).
- Bouxsein, M. L., Boyd, S. K., Christiansen, B. A., Guldberg, R. E., Jepsen, K. J., Müller, R. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Akhter, M. P., Recker, R. R. High resolution imaging in bone tissue research-review. Bone. 143, 115620 (2021).
- Mys, K., et al. Quantification of 3D microstructural parameters of trabecular bone is affected by the analysis software. Bone. 142, 115653 (2021).
- Chavassieux, P., Chapurlat, R. Interest of bone histomorphometry in bone pathophysiology investigation: Foundation, present, and future. Frontiers in Endocrinology. 13, 907914 (2022).
- Komori, T.
- Zhu, S., et al. Ovariectomy-induced bone loss in TNFα and IL6 gene knockout mice is regulated by different mechanisms. Journal of Molecular Endocrinology. 60 (3), 185-198 (2018).
- Baum, T., et al. Osteoporosis imaging: effects of bone preservation on MDCT-based trabecular bone microstructure parameters and finite element models. BMC Medical Imaging. 15, 22 (2015).
- Nazarian, A., Hermannsson, B. J., Muller, J., Zurakowski, D., Snyder, B. D. Effects of tissue preservation on murine bone mechanical properties. Journal of Biomechanics. 42 (1), 82-86 (2009).
- Martín-Badosa, E., Amblard, D., Nuzzo, S., Elmoutaouakkil, A., Vico, L., Peyrin, F. Excised bone structures in mice: imaging at three-dimensional synchrotron radiation micro CT. Radiology. 229 (3), 921-928 (2003).
- Egan, K. P., Brennan, T. A., Pignolo, R. J. Bone histomorphometry using free and commonly available software. Histopathology. 61 (6), 1168-1173 (2012).
- Brandi, M. L. Microarchitecture, the key to bone quality. Rheumatology. 48 (suppl_4), iv3-iv8 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Domander, R., Felder, A. A., Doube, M.
- Parfitt, A. M., et al. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units: report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. Journal of Bone and Mineral Research. 2 (6), 595-610 (1987).
- Kazama, J. J., Koda, R., Yamamoto, S., Narita, I., Gejyo, F., Tokumoto, A. Cancellous bone volume is an indicator for trabecular bone connectivity in dialysis patients. Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 5 (2), 292-298 (2010).
- Watts, N. B. Postmenopausal osteoporosis: A clinical review. Journal of Women's Health. 27 (9), 1093-1096 (2018).
- Thompson, D. D., Simmons, H. A., Pirie, C. M., Ke, H. Z. FDA Guidelines and animal models for osteoporosis. Bone. 17 (4), S125-S133 (1995).
- Iwaniec, U. T., Yuan, D., Power, R. A., Wronski, T. J. Strain-dependent variations in the response of cancellous bone to ovariectomy in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (7), 1068-1074 (2006).
- Ferguson, V. L., Ayers, R. A., Bateman, T. A., Simske, S. J. Bone development and age-related bone loss in male C57BL/6J mice. Bone. 33 (3), 387-398 (2003).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (8), 1197-1207 (2007).
- Seeman, E. The structural and biomechanical basis of the gain and loss of bone strength in women and men. Endocrinology and Metabolism Clinics. 32 (1), 25-38 (2003).
- Ticha, P., et al. A novel cryo-embedding method for in-depth analysis of craniofacial mini pig bone specimens. Scientific Reports. 10 (1), 19510 (2020).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology. 47 (suppl_4), iv9-iv16 (2008).
- Zaw Thin, M., Moore, C., Snoeks, T., Kalber, T., Downward, J., Behrens, A. Micro-CT acquisition and image processing to track and characterize pulmonary nodules in mice. Nature Protocols. 18 (3), 990-1015 (2023).
