Summary
Este protocolo apresenta um método econômico e eficiente para avaliação quantitativa da microarquitetura óssea em um modelo de osteoporose em camundongos, combinando técnicas de coloração pela hematoxilina-eosina (HE) e microtomografia computadorizada (Micro-CT).
Abstract
A microestrutura óssea refere-se à disposição e qualidade do tecido ósseo em nível microscópico. A compreensão da microestrutura óssea do esqueleto é crucial para obter informações sobre a fisiopatologia da osteoporose e melhorar seu tratamento. No entanto, o manuseio de amostras ósseas pode ser complexo devido às suas propriedades duras e densas. Em segundo lugar, softwares especializados dificultam o processamento e a análise de imagens. Neste protocolo, apresentamos uma solução econômica e de fácil utilização para análise da microestrutura óssea trabecular. Etapas detalhadas e precauções são fornecidas. A micro-TC é uma técnica de imagem tridimensional (3D) não destrutiva que fornece imagens de alta resolução da estrutura óssea trabecular. Permite a avaliação objetiva e quantitativa da qualidade óssea, razão pela qual é amplamente considerado como o método padrão-ouro para avaliação da qualidade óssea. No entanto, a histomorfometria permanece indispensável, pois oferece parâmetros cruciais em nível celular, preenchendo a lacuna entre avaliações bidimensionais (2D) e 3D de espécimes ósseos. Quanto às técnicas histológicas, optou-se pela descalcificação do tecido ósseo e, em seguida, realizar a tradicional inclusão em parafina. Em resumo, a combinação desses dois métodos pode fornecer informações mais abrangentes e precisas sobre a microestrutura óssea.
Introduction
A osteoporose é uma doença óssea metabólica prevalente, especialmente entre os idosos, e está associada a um risco aumentado de fraturas por fragilidade. À medida que a osteoporose se torna mais comum na China1, haverá uma demanda crescente para o estudo das estruturas ósseas de pequenos animais 2,3. Os métodos anteriores de mensuração da perda óssea baseiam-se nos resultados da absorciometria bidimensional de raios-X de dupla energia. No entanto, isso não capta as alterações na microestrutura arquitetural do osso trabecular, que é um fator-chave para a resistênciaesquelética4. A microestrutura do osso afeta sua resistência, rigidez e resistência à fratura. Comparando-se a microarquitetura óssea nos estados normal e patológico, é possível identificar alterações na morfologia, estrutura e função do tecido ósseo causadas pela osteoporose. Essas informações contribuem para o entendimento do desenvolvimento da osteoporose e sua associação com outras doenças.
A microtomografia computadorizada (Micro-CT) tornou-se recentemente uma técnica popular para avaliação da morfologia óssea, onde pode fornecer dados precisos e abrangentes sobre parâmetros de estrutura e densidade óssea, como volume, fração, espessura e separaçãoóssea5,6. Ao mesmo tempo, os resultados do Micro-CT podem ser afetados pelo software de análise7. Diferentes métodos de aquisição, avaliação e emissão de laudos de imagens são utilizados por vários sistemas comerciais de Micro-CT. Essa inconsistência dificulta a comparação e interpretação dos resultados relatados por diferentes estudos5. Além disso, atualmente não pode substituir a histomorfometria óssea no fornecimento de informações aos pesquisadores sobre parâmetros em nível celular no sistema esquelético8. Enquanto isso, as técnicas histológicas permitem a observação direta e a mensuração da morfologia microscópica do osso. A coloração pela hematoxilina e eosina (HE) é uma técnica de coloração comum usada em histologia para visualizar a estrutura geral de células e tecidos. É utilizado para identificar a presença de tecido ósseo e sua microarquitetura.
Este artigo utiliza a Micro-CT combinada com a técnica de fatiamento tecidual (coloração Hematoxilina-Eosina [HE]) para coletar imagens do tecido ósseo e realizar análise quantitativa do osso trabecular para avaliar as alterações da microestrutura óssea em um modelo de camundongo com osteoporose.
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Protocol
O protocolo animal foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (Número de registro: 2020-34). Camundongos C57BL/6J fêmeas (12 semanas de idade, n = 14) foram divididos em dois grupos aleatoriamente, um grupo sham-operado (grupo Sham, n = 7) e um grupo modelo (grupo OVX, n = 7). Os animais foram adquiridos de um fornecedor comercial (ver Tabela de Materiais). Todos os camundongos foram mantidos em gaiolas individuais a 22-26 °C com 45%-55% de umidade, permitiram que se adaptassem ao novo ambiente por 1 semana e forneceram livre acesso à água e à dieta. Todos os estudos experimentais em animais foram conduzidos na Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal.
1. Preparação do modelo animal
- Anestesiar o rato com 12 semanas de idade por injeção intraperitoneal com Avertin a 1,25% (Tribromoetanol em álcool terc-amílico, ver Tabela de Materiais) na dose de 0,02 mL/g. Posicione o rato de bruços sobre uma mesa cirúrgica estéril e imobilize os membros fixando-os com segurança.
- Use uma tesoura (ver Tabela de Materiais) para aparar qualquer cabelo que possa afetar a operação cirúrgica.
NOTA: Recomenda-se evitar danos à pele durante o preparo do local cirúrgico. - Lave bem as mãos e coloque luvas cirúrgicas. Desinfete as costas do rato três vezes com iodopovidona (ver Tabela de Materiais) e use gaze médica (ver Tabela de Materiais) para secá-la.
NOTA: Seja cauteloso; Ficar o cabelo muito molhado durante a desinfecção pode levar à hipotermia pós-operatória em camundongos. - Faça uma incisão de aproximadamente 0,5-1,0 cm de comprimento, localizada a 1 cm de distância de um terço da linha média das costas do rato, usando um bisturi (ver Tabela de Materiais). Separe suavemente a fáscia e corte o músculo com uma tesoura de tecido (ver Tabela de Materiais) até que o ovário esteja visível. Lixe os vasos sanguíneos circundantes com suturas inabsorvíveis (ver Tabela de Materiais) e remova o ovário.
- Enxaguar a cavidade com soro fisiológico a 0,9% e, em seguida, suturar a pele, o músculo e a fáscia separadamente (ver Tabela de Materiais).
- Repita a mesma sequência de etapas do outro lado.
- Remover a gordura peri-ovariana do mesmo tamanho do ovário e realizar o mesmo procedimento cirúrgico mencionado acima para as etapas restantes para estabelecer o modelo simulado operado.
- Permitir um período de recuperação de 1 semana após a cirurgia. Após 8 semanas, modelos osteoporóticos em camundongos serão estabelecidos com sucesso9,10.
2. Micro-TC
- Eutanásia do rato por inalação excessiva de CO2 . Remover o máximo possível de tecido mole do fêmur de camundongo após a eutanásia e obter uma nova amostra para digitalização.
NOTA: Embora não haja uma solução perfeita para a preservação da amostra, certas etapas podem ser tomadas para maximizar a qualidade dos resultados do exame de Micro-CT. Antes da fixação, tenha o cuidado de remover o máximo possível de tecido circundante. A formalina ou formalina tamponada é o método preferido de fixação com armazenamento em PBS11,12. - Clique duas vezes no ícone do software do sistema de imagem micro-CT na área de trabalho para iniciar o sistema (consulte a Tabela de Materiais). Selecione uma cama de amostra compatível com o campo de visão da amostra (FOV) de 18 mm x 18 mm. Coloque o leito de amostra apropriado na máquina e feche a escotilha.
- Clique no botão Aquecer no Painel de Controle.
NOTA: Foi necessário um curto tempo de aquecimento. Não tente abrir a escotilha quando os raios-X estiverem sendo gerados. Verifique a luz X-Ray On no painel frontal e no monitor do computador para confirmar se os raios X estão sendo gerados. - Clique no botão Menu para definir um novo banco de dados e, em seguida, crie uma nova amostra e estude.
- Selecione Manual na lista suspensa Menu e insira valores personalizados de tensão e corrente no Painel de Controle. Ajuste Tensão (kV ) para 90, Corrente (μA ) para 80, Modo de varredura para Alta resolução, 14 min, e FOV (mm) para 18 mm x 18 mm.
NOTA: Consulte o manual para diferentes sistemas de micro TC para definir os parâmetros apropriados. - Posicione o osso firmemente com filme plástico no leito da amostra. Feche a escotilha. Certifique-se de que o objeto esteja centralizado precisamente na janela X-capture pressionando os botões de ajuste na máquina.
NOTA: O ajuste da amostra deve ser lento e suave para evitar que caia na máquina por acidente. - Clique no botão Iniciar para iniciar a tomografia computadorizada.
3. Análise dos dados tomográficos
- Insira o software (consulte Tabela de Materiais) e selecione os dados a serem analisados. Clique em Sub e defina Tamanho do pixel como 10 μm. Mover e redimensionar a região de interesse (ROI) para incluir o fêmur distal acima da placa de crescimento. Clique em Iniciar (veja a Figura 1).
NOTA: O tamanho do pixel de reconstrução do subvolume foi selecionado em 10 μm, uma vez que a espessura das trabéculas da imagem foi estimada em cerca de 20-30 μm com base em dados histológicos de estudos anteriores13. Se a relação sinal-ruído for insuficiente para o processamento de dados, uma varredura de 1 h de alta resolução deve ser realizada. - Clique no botão Analysis 3D para obter a reconstrução 3D resultante.
- Exporte os dados do sistema de micro-TC para o computador para análise.
- Importe os dados de TC reconstruídos. Clique em Processar > Calculadora de Imagem e, em seguida, clique em Teclado de Região > Interativo. Ajuste a caixa de seleção amarela para o ROI apropriado.
NOTA: A região de interesse (ROI) inicia-se aproximadamente 540 μm proximal à placa de crescimento e estende-se 1600 μm proximalmente para avaliar o real metabolismo e remodelação óssea. - Selecione o complemento Análise de Microarquitetura Óssea (BMA) (consulte Tabela de Materiais). Clique em Segmentar córtex e, em seguida, em Segmentar trabéculas.
NOTA: Ambos o osso trabecular e cortical são automaticamente selecionados. Normalmente, nenhum ajuste manual é necessário. - Clique em Salvar Mapa de Objeto Final e, em seguida, clique em Medir Osso para calcular os índices morfométricos ósseos.
NOTA: Apenas a densidade mineral óssea (DMO) relativa foi calculada aqui, uma vez que nenhum controle foi adicionado.
4. Descalcificação do tecido ósseo
- Fixar os espécimes ósseos em paraformaldeído a 4% (ver Tabela de Materiais) durante 24 horas. Lave os espécimes três vezes com PBS (ver Tabela de Materiais) por 20 min de cada vez.
- Enxaguar o tecido três vezes com água destilada por 20 min de cada vez. Transfira o tecido para uma solução de descalcificação contendo EDTA (ver Tabela de Materiais) e descalcifique por 30 dias com uma troca semanal da solução até o ponto final.
NOTA: A picada da agulha, o pinçamento da mão e o pinçamento são usados para terminar a descalcificação quando o tecido ósseo se torna macio ou não há sensação de resistência ao agulhar. O método físico de detecção pode causar algum dano à estrutura do tecido, por isso tente evitar força excessiva ou testes repetidos. - Retire o tecido do fixador e use um bisturi para aparar o tecido em um exaustor. Coloque o tecido aparado e a etiqueta correspondente em uma caixa de desidratação.
- Coloque a caixa de desidratação em um cesto e desidrate-a em um processador de tecidos (ver Tabela de Materiais) com álcool gradiente (etanol 75% por 4 h, etanol 85% por 2 h, etanol 90% por 2 h, etanol 95% por 1 h, etanol anidro por 30 min, etanol anidro II por 30 min, xileno I por 5-10 min, xileno II por 5-10 min, cera I por 1 h, cera II por 1 h, cera III por 1 h).
- Use uma máquina de incorporação (consulte Tabela de Materiais) para incorporar o tecido embebido em cera. Despeje a cera derretida em uma caixa de incorporação e coloque o tecido da caixa de desidratação antes que a cera endureca.
- Orientar o tecido de acordo com a superfície de incorporação e fixar a etiqueta correspondente. Arrefecer numa mesa de congelação de -20 °C (ver Tabela de Materiais). Remova o bloco de cera da caixa de incorporação depois de solidificar e corte o bloco de cera conforme necessário (consulte a Tabela de Materiais).
- Corte o bloco de cera aparado em lâminas de 3 μm de espessura em micrótomo (ver Tabela de Materiais). Flutue as lâminas em água morna a 40 °C em uma máquina de espalhar tecidos (consulte a Tabela de Materiais) para achatar o tecido e retirá-las com uma lâmina.
- Asse em forno a 60 °C (ver Tabela de Materiais) até que a água evapore e a cera derreta. Retire e guarde à temperatura ambiente (RT) para utilização posterior.
5. Coloração HE
- Coloque as lâminas em xileno I por 20 min, depois em xileno II por 20 min. Além disso, coloque as lâminas em etanol anidro I e etanol anidro II por 5 min cada, álcool 75% por 5 min e, em seguida, lave as lâminas com água da torneira (ver Tabela de Materiais).
- Incubar em hematoxilina (ver Tabela de Materiais) por 3-5 min. Diferenciar os espécimes com uma solução de ácido clorídrico (ver Tabela de Materiais). Trate as lâminas com uma solução de amoníaco (ver Tabela de Materiais) para rubor e, em seguida, lave as lâminas com água.
- Coloque as lâminas em álcool gradiente 85%, 95% para desidratação e core com solução de eosina (ver Tabela de Materiais) por 5 min.
- Colocar as lâminas em etanol anidro I por 5 min, etanol anidro II por 5 min e etanol anidro III por 5 min. Trate as lâminas com xileno I por 5 min, xileno II por 5 min e monte com bálsamo neutro (ver Tabela de Materiais).
- Examine cada lâmina sob o microscópio. Em seguida, escolha as fatias representativas para digitalização panorâmica (consulte Tabela de materiais).
NOTA: São necessárias pelo menos três fatias consecutivas para cada amostra. Antes da varredura panorâmica, as fatias devem ser examinadas sob um microscópio para garantir que estejam completas e claras. Certifique-se de que a cavidade da medula óssea, o osso cortical e o osso esponjoso sejam totalmente exibidos e que diferentes tipos de células ósseas possam ser vistos.
6. Análise de imagens HE
- Abra imagens HE com o software CaseViewer (consulte a Tabela de Materiais). Selecione a região de interesse (ROI) no slide e salve-a como uma imagem colorida.
NOTA: A seleção do ROI é consistente com o software mencionado acima. - Abra a imagem no ImageJ (consulte Tabela de materiais). Selecione a ferramenta Varinha na barra de ferramentas. Clique no osso trabecular.
- Ajuste as configurações de tolerância e contíguas conforme necessário. Vá para Ajustes de > de Imagem > Preto & Branco e clique em OK. Repita os passos para outras áreas do osso.
- Inverta a seleção e preencha-a com a cor branca. Salve a imagem como uma máscara para análise (consulte a Figura 2).
NOTA: Para a metodologia detalhada, consulte o trabalho publicado anteriormente14. - Abra a máscara no software de análise15,16 (vide Tabela de Materiais). Execute Process > Binary > Make Binary para converter a imagem colorida em uma imagem binária.
- Utilizar o plugin 17 (ver Tabela de Materiais) no software para analisar parâmetros estruturais: Run Area/Volume Fraction para calcular o volume ósseo em relação ao volume total de osso (BV/TV [%])18,19.
NOTA: Este método é aplicável para trabéculas ósseas e medula óssea, preenchendo toda a ROI nas imagens de HE.
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Representative Results
Análise por micro-TC
Medimos os parâmetros microarquiteturais trabeculares em camundongos de ambos os grupos e relatamos seus valores médios e DPs na Tabela 1. A distribuição de alguns parâmetros (isto é, a relação entre o volume ósseo e o volume total de tecido, espessura trabecular, separação trabecular) dentro de cada grupo está ilustrada na Figura 3.
Estes resultados indicam diferenças significativas entre os camundongos dos grupos OVX e Sham para uma série de parâmetros que foram estimados a partir do Micro-CT. Ou seja, a relação entre volume ósseo e volume tecidual total (BV/TV) no grupo OVX foi 3% menor do que no grupo Sham. A espessura trabecular nos camundongos OVX foi menor do que nos do grupo Sham, com uma porcentagem relativa de diferença de 39,3%. A separação trabecular em camundongos OVX foi maior do que em camundongos Sham. A Figura 4 mostra os monitores 3D das ROIs trabeculares extraídas do volume ósseo reconstruído para cada grupo. Em comparação com o grupo Sham (Figura 4A), a densidade óssea dos camundongos após ooforectomia, as trabéculas eram esparsas e apresentavam osteoporose (Figura 4B).
Análise de coloração HE
Além disso, a análise histopatológica confirmou as alterações encontradas na análise da Micro-CT. Após 8 semanas, a coloração HE mostrou que o osso trabecular (vermelho) sob a placa de crescimento do fêmur distal de camundongos após OVX estava reduzido em comparação com o grupo Sham, e quase não havia estrutura trabecular espessa óbvia, e um grande número de grânulos semelhantes a gordura apareceu (Figura 5A). Com base na análise quantitativa dos cortes teciduais, os camundongos OVX apresentaram menor área óssea trabecular que o Sham (Figura 5B).
Figura 1: Captura de tela da interface de reconstrução do subvolume. Uma reconstrução de subvolume no retângulo verde para chegar a 10 μm em um campo de visão (FOV) de 5,12 mm x 5,12 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Construção da máscara de imagem em preto e branco. (A1-A3): HE Imagens do grupo Sham (Barra de escala = 200 μm). As trabéculas ósseas são mostradas em preto dentro da região selecionada e outros tecidos em branco. (B1-B3) Imagens do grupo OVX (Scale bar = 200 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Comparação dos parâmetros microestruturais das trabéculas femorais distais entre os grupos OVX e Sham. (A) A relação entre volume ósseo e volume tecidual total (BV/TV [%]) no grupo OVX foi menor do que no grupo Sham. (B) A espessura trabecular (TB.Th [μm]) em camundongos com OVX foi menor do que no grupo Sham. (C) A separação trabecular (TB.sp [μm]) em camundongos OVX foi maior do que em camundongos Sham. *P < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Micro-TC representativa do osso trabecular no fêmur distal. Em comparação com o grupo (A) Sham, a densidade óssea de camundongos após ooforectomia (B) exibiu trabéculas esparsas e mostrou osteoporose. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Análise histológica da área óssea trabecular no fêmur distal dos grupos OVX e Sham. (A) Imagens representativas coradas com HE do fêmur distal em cada grupo (Scale bar = 500 μm). As setas pretas mostram trabéculas. (B) A análise quantitativa da área óssea trabecular do volume total de tecido na ROI selecionada. *P < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Parâmetro | Grupo simulado operado (SHAM) (n = 5). |
Grupo ooforectomia (OVX) (n = 5). |
Valor de p |
| Relação volume ósseo/volume tecidual total (%) | 7.3 ± 0.9 | 4.2 ± 0.5 | 0.012* |
| Espessura trabecular (μm) | 79,5 ± 5,5 | 53,4 ± 6,0 | 0.013* |
| Separação trabecular (μm) | 212,5 ± 8,7 | 249,4 ± 8,3 | 0.015* |
| Os valores são a média ± DP. * Significativamente diferente (P<0,05). |
|||
Tabela 1: Parâmetros do osso trabecular estimados a partir da Micro-CT.
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Discussion
A osteoporose pode levar a fraturas frequentes, que são dispendiosas, podem causar dor, incapacidade ou até mesmo a morte, e afetar seriamente a qualidade de vida dos pacientes20. Ao longo dos anos, o modelo de ooforectomia tem sido reconhecido como um dos métodos padrão para o estudo da osteoporose21. O modelo animal pré-clínico mais comum para osteoporose é o rato ovariectomizado (OVX). Apesar disso, a maioria das pesquisas sobre os mecanismos das desordens ósseas, incluindo a osteoporose, foi conduzida comcamundongos22. Para estabelecer um modelo de osteoporose em camundongos adultos fêmeas C57/BL6J, a ooforectomia é realizada com 12 semanas de idade, que é o momento ideal para esse procedimento. Camundongos são maduros e férteis a partir de 8-12 semanas de idade, e a ooforectomia tem um efeito significativo sobre sua massa óssea neste momento10. Estudos anteriores mostram que, antes de 12 semanas, os ossos de camundongos crescem rapidamente, e os indicadores de morfologia óssea, DMO e biomecânica óssea aumentam rapidamente. A DMO total e a DMO do osso cortical estão significativamente correlacionadas com a idade dos camundongos. Entretanto, após 12 semanas, o metabolismo ósseo de camundongos entra em um período estável, e os indicadores acima tendem a serestáveis23,24.
A microarquitetura óssea tem sido proposta como o principal fator que influencia a fragilidade óssea, independentemente da DMO. A fragilidade óssea da osteoporose não é totalmente explicada pelo déficit de massa óssea. A DMO só pode explicar 60%-70% da resistência óssea25. Em termos de composição estrutural, o osso cortical compreende 80% da massa óssea, enquanto o osso esponjoso exibe apenas 10% das medidas após a perda de 50% da massa óssea, sugerindo que as medidas isoladas de massa óssea não são suficientes para avaliar a perda de massa óssea. Além do volume ósseo, alterações estruturais nas trabéculas ósseas são fundamentais para a resistência óssea. O osso esponjoso contém tecido hematopoiético da medula óssea ou tecido adiposo. Sua superfície é bastante grande, cerca de oito vezes maior que a do osso cortical. Esta grande área de superfície conectada à medula óssea permite que o osso esponjoso tenha uma taxa de conversão óssea bastante alta. Por isso, escolhemos a microestrutura das trabéculas ósseas como principal indicador para a observação de alterações osteoporóticas. O tecido ósseo trabecular no esqueleto é constantemente submetido a remodelação durante o crescimento, durante o qual as trabéculas ósseas neoformadas substituem as existentes e formam osso esponjoso secundário. Portanto, em condições normais, a análise morfométrica do osso trabecular é focada principalmente na área de osso esponjoso secundário. O tecido ósseo esponjoso primário, por outro lado, é uma estrutura congenitamente presente e relativamente estável que não é remodelada e, portanto, precisa ser excluída da análise. Geralmente, o osso dentro de uma certa distância da placa de crescimento pode ser considerado como tecido de remodelação ativa. Portanto, selecionamos uma região de interesse (ROI) que começa a partir de 540 μm acima da placa de crescimento e se estende por 1600 μm na direção proximal para a análise. De acordo com nossos achados, camundongos exibem características microestruturais muito diferentes nas regiões trabeculares após ooforectomia.
A tecnologia de Micro-CT utilizada neste estudo é uma técnica de imagem 3D não destrutiva desenvolvida nas últimas décadas e vem sendo gradativamente aplicada ao estudo farmacológico de ervas etnomedicinais. Ele fornece uma compreensão clara da microestrutura interna da amostra sem destruí-la. Quanto ao exame histopatológico, o método de inclusão da resina prejudica a atividade enzimática e a antigenicidade proteica e não pode ser usado de forma confiável para histoquímica ou imuno-histoquímica26. A incorporação tradicional de parafina pode ser combinada com técnicas como imunohistoquímica (IHQ), hibridização in situ fluorescente (FISH) e microscópio confocal de varredura a laser (CLSM) para detectar quantitativamente substâncias de baixa abundância no tecido ósseo em nível molecular, obtendo assim uma compreensão mais profunda dos mecanismos e regulação do metabolismo ósseo. O scanner panorâmico de lâminas pode converter rapidamente lâminas em imagens digitais de alta resolução, tornando possível analisar quantitativamente dados de histomorfologia óssea usando software de computador. Em resumo, a combinação de Micro-CT e histomorfologia óssea pode fornecer uma avaliação mais detalhada e precisa da microestrutura óssea.
Tradicionalmente, a avaliação da qualidade óssea era amplamente limitada à absorciometria de raios-X de dupla energia (DXA), tomografia computadorizada de resolução limitada ou ressonância magnética tecnicamente desafiadora27. Embora a combinação das duas técnicas tenha suas vantagens únicas, ela também tem suas limitações. Em primeiro lugar, embora a Micro-CT permita o monitoramento contínuo a longo prazo do mesmo animal, a obtenção de imagens in vivo de microestruturas esqueléticas em pequenos animais vivos, especialmente camundongos, ainda é tecnicamentedesafiadora28. Em segundo lugar, a ausência de um protocolo estruturado e reconhecido internacionalmente para aquisição e análise de dados de diferentes instrumentos ou usuários dificulta a comparação de conjuntos de dados e a reprodução de resultados de pesquisa entre estudos. Terceiro, devido às características da Micro-CT, a exposição à radiação ionizante é inevitável. Quarto, embora nosso protocolo simples e econômico possa fornecer análise quantitativa de imagens ósseas coradas com HE, ele é principalmente baseado em uma estratégia de segmentação semiautomática, que é mais trabalhosa do que métodos automatizados complexos.
Em conclusão, a aplicação desta tecnologia irá, sem dúvida, trazer um grande impulso para a pesquisa em osteoporose em etnomedicina durante o processo de exploração.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Administração Provincial de Sichuan de Medicina Tradicional Chinesa (2021YJ0175) e pelo Projeto de Inovação de Pesquisa de Pós-Graduação da Escola de Medicina Clínica (LCYJSKT2023-11), Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
| Ammonia Solution | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anatomical Forceps | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J3C030 | |
| Anhydrous Ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Automatic Dyeing Machine | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
| Bone Microarchitecture Analysis Add-on | AnalyzeDirect, Inc | ||
| C57BL/6J mice | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Carrier Slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Coverslips | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Decalcification Solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Delicate Scissors | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | ZJA010 | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fiji: ImageJ | National Institutes of Health, USA | ||
| Film Sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| Freezing Table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| H&E Staining Kit | Leagene | DH0020 | |
| Hydrochloric Acid Solution | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| ImageJ2 Plugin | BoneJ 7.0.16 | ||
| Medical Gauze | Shandong Ang Yang Medical Technology Co. | ||
| Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures | Ethicon, Inc. | SA84G | |
| Needle Holder | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J32010 | |
| Neutral Balsam | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| PANNORAMIC Digital Slide Scanners | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Povidone-iodine solution 5% | Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Quantum GX2 microCT Imaging System | PerkinElmer, Inc. | ||
| Rotary Microtome | Thermo scientific | HM325 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Scan & Browse Software | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
| Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves | Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd | 22B141EO | |
| Sodium Chloride Solution 0.9% | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Sterile Hypodermic Syringes for Single Use | Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd | ||
| Sterile Medical Suture Needles | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | PW8068 | |
| Tissue Processor | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Tissue Spreading and Baking Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Tribromoethanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M2920 | |
| Wax Trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
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