Summary
I denne protokol diskuterer vi implementeringen af en model for vellykket ortopisk levertransplantation (OLT) hos mus. Derudover diskuteres også adjuvanser til yderligere analyse af allograftpatency efter vellykket OLT i en mus, specifikt ved hjælp af mikrocomputertomografi (microCT) scanninger.
Abstract
Mikrocomputertomografi (microCT) angiografi er en uvurderlig ressource for forskere. Nye fremskridt inden for denne teknologi har gjort det muligt at opnå billeder af høj kvalitet af mikrovaskulatur og er high-fidelity-værktøjer inden for organtransplantation. I denne model af ortopisk levertransplantation (OLT) hos mus giver mikroCT mulighed for at evaluere allograftanastomose i realtid og har den ekstra fordel, at man ikke behøver at ofre forsøgsdyr. Valget af kontrast samt billedoptagelsesindstillinger skaber et high-definition billede, som giver forskere uvurderlig information. Dette giver mulighed for evaluering af de tekniske aspekter af proceduren samt potentielt evaluering af forskellige behandlinger over en længere varighed. I denne protokol beskriver vi en OLT-model i mus trinvis og beskriver endelig en mikroCT-protokol, der kan give billeder af høj kvalitet, som hjælper forskere med dybdegående analyse af fast organtransplantation. Vi giver en trinvis vejledning til levertransplantation i en mus, samt kort diskutere en protokol til evaluering af transplantatets patency gennem mikroCT-angiografi.
Introduction
Transplantation er den eneste effektive terapi til leversygdom i slutstadiet. Unægtelig er fordelen ved levertransplantation fremragende med en median overlevelse på 11,6 år mod 3,1 år på venteliste1. Der er imidlertid betydelige begrænsninger, som begrænser den brede anvendelse af levertransplantation og vigtigst af alt omfatter mangel på egnede donororganer af høj kvalitet. En udvidelse af donororganpuljen vil således kræve innovative strategier, der gør det muligt at anvende allotransplantater, der i øjeblikket betragtes som uegnede i dag, hvilket øger sikkerhedsmargenen for transplantation. For at forbedre adgangen til levertransplantation er det derfor bydende nødvendigt at gennemføre prækliniske undersøgelser hos små dyr.
Særligt vigtige for transplantationsforskningen er in vivo-transplantationsmodeller. Ortopisk levertransplantation med mus (OLT) har eksisteret i næsten 30 år2 og er afgørende for at studere mange aspekter af transplantation, herunder karakterisering af immunresponser, iskæmi-reperfusionsskade, akut afstødning, terapeutiske virkninger af nye midler og langsigtet overlevelse 3,4,5,6,7 . Brugen af mus til at studere transplantation er afgørende, da det giver mulighed for at bruge transgene muselinjer til at studere virkningen af specifikke molekylære veje på resultaterne af transplantation. Etablerede protokoller for muselevertransplantation er blevet godt beskrevet tidligere 8,9.
Der findes flere metoder til anastomoser for supra- og infrahepatisk ringere vena cava (IVC), portalvene (PV) og almindelig galdegang (CBD). De er typisk afhængige af enten håndanastomose eller en modificeret vaskulær manchetteknik svarende til murin lungetransplantation 10,11,12. Et vigtigt skridt i langtidsundersøgelsen og overlevelsen af modtagermusene samt udviklingen af et vedvarende muselevertransplantationsprogram er evnen til at evaluere disse kritiske anastomoser. Billeddannelsesmetoder til evaluering af leverallograftpatency er ofte afhængige af ultralyd og computertomografi (CT) i den kliniske indstilling13,14. CT har en klar fordel i forhold til ultralyd, da det kan tilbyde visninger af hele maven til at omfatte enhver anastomose, selvom det kan være særligt vanskeligt at opnå disse synspunkter med ultralyd hos små dyr. Der er afsat betydelig forskning og ressourcer til at udvikle nøjagtig mikroCT med det formål at forbedre dyreforsøg og de oplysninger, vi kan indsamle fra disse modeller for skade og sygdom 15,16. Her beskriver vi en protokol for ortopisk muselevertransplantation (figur 1) og beskriver kort en protokol for mikroCT til evaluering af allograftpatency og holdbarhed af anastomoser.
Protocol
C57BL/6J-hanmus (30 g kropsvægt) blev anbragt under patogenfrie forhold på Nationwide Children's Hospital Animal Facility. Alle procedurer blev humant udført i henhold til NIH og National Research Council's Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animals og med godkendelse af Nationwide Children's Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC Protocol AR17-00045). Se materialefortegnelsen for detaljer vedrørende alle materialer, instrumenter og udstyr, der anvendes i denne protokol.
1. Første opsætning til transplantationskirurgi
- Opsæt kirurgisk udstyr.
- Opsæt kirurgiske overvågningsenheder (dvs. pulsovervågningsenhed, pulsokse, modulært monitorsystem) og anæstesimaskiner.
- Hvis det er muligt, tænd det kirurgiske opvarmningsbræt til 42 ° C.
- Sørg for, at ventilations- og anæstesimaskiner er tændt for at opvarme isofluranfordamperen. Fyld anæstesibeholderen med 30 ml flydende isofluran, og sørg for, at ventilatormaskinen er tilsluttet ilten.
BEMÆRK: I denne protokol intuberer vi ikke dyret; Brug kun en næsekegle til iltning.
- Registrer kropsvægten hos modtageren og donormusene.
- Tænd for det kirurgiske mikroskop med høj effekt, og juster højden og fokus til kirurgens præferencer. Sørg for, at de resterende kirurgiske enheder er tændt (dvs. elektrokauterianordning).
- Forbered og læg kirurgiske instrumenter samt kirurgiske bånd af 10-0 nylon (figur 2).
BEMÆRK: Alle kirurgiske instrumenter blev autoklaveret ved 121 °C i 30 minutter. Derudover kan forskellige konfigurationer af kirurgiske instrumenter være lige så effektive. - Forbered manchetterne til portalvenen (PV) og almindelige galdegangsstents (CBD) (figur 3). Placer angiokateteret såvel som PE10 på en steril overflade under højeffektmikroskopet. Brug et #11 kirurgisk blad til at skære angiokateteret til at danne en 1,5 mm lang manchet med en fane ca. 0,75 mm øverst på manchetlegemet; skær polyethylenslangen (PE10) til 2,5 mm længde. Opbevar manchetterne og stenten i sterilt saltvand, indtil de er klar til brug.
BEMÆRK: Denne transplantationsmodel bruger et 20 G angiokateter til at fremstille manchetter til PV-rekonstruktion samt en polyethylenslange 10 (PE10) til rekonstruktion af CBD. Alle andre anastomoser er håndsyede. - Forbered løsninger. Forbered en heparininjektion, der vil blive leveret ved 100 U i 0,5 ml histidin-tryptophan-ketoglutarat (HTK) opløsning. Opbevar saltvand, heparin-saltvand, PBS og HTK konserveringsopløsning på is.
2. Indkøb af donormus
- Inducer anæstesi i donormusen ved at placere den i et isofluran inhalationskammer. Sørg for, at isoflurankoncentrationen er ca. 2,5% med en iltstrøm på 2 ml/min. Vent 5 minutter på, at et kirurgisk anæstesiplan udvikler sig. For at sikre det rette anæstesiniveau skal du klemme musen for at fremkalde en reaktion; Manglende reaktion indikerer, at det rette niveau af anæstesi er opfyldt.
- Barber musens mave ved hjælp af elektroniske klippere, og placer musen i liggende stilling på varmebrættet. Rens maven med povidon-jod, derefter 70% ethanol. Placer oftalmisk salve under musens øjne for at forhindre tørhed.
- Placer musen under det kraftige mikroskop og hold musen under bedøvelse ved hjælp af en isofluranindånding med 2% koncentration med en iltstrøm på 2 ml / min.
- Udfør en midterlinje laparotomi med et saks (kirurgpræference) fra xiphoidprocessen til pubic symphysis. Udfør derefter et ekstra tværgående snit for at skabe et 'krydslignende' mønster, der er ringere end ribbenene. Brug myg hæmostatiske tang, trække xiphoidprocessen tilbage for at opnå tilstrækkelig eksponering af abdominalindholdet.
BEMÆRK: Tang kan sikres afhængigt af kirurgens præference. - Udtag tarmene og læg dem på venstre side af bukhulen i en våd gasbind svamp. Mobiliser leveren ved at fjerne alle ligamentøse vedhæftede filer.
- Udsæt den korrekte leverarterie (pHA). Skeletoniser fartøjet ved hjælp af kurvetang og ligeret det med 10-0 nylonsutur.
- Disseker hele længden af CBD ved hjælp af en kombination af skarp og stump dissektion. Udfør en duktotomi (stor nok til CBD-stenten) så tæt på bugspytkirtlens overlegne kant som muligt for at give en passende længde til fremtidig brug (~ 1 cm fra leverens nedre grænse). Indsæt galdegangsstenten i CBD med fine pincet og fastgør den med en 10-0 nylonsutur. Ligate det distale aspekt af CBD ved hjælp af en 10-0 nylonsutur (figur 4).
- Træk den højre leverlap mod xiphoiden tilbage ved hjælp af en våd gasbind svamp og udsæt IVC. Mobiliser infrahepatisk IVC (IHIVC) væk fra retroperitoneum og cauterize den højre binyrevene ved hjælp af en håndholdt cautery enhed (se tabel over materialer).
- Disseker højre nyrearterie og vene og ligat med henholdsvis 7-0 og 10-0 nylon. Skær højre nyrevene og arterie og resterende ligamentøse vedhæftede filer. Fjern til sidst den rigtige nyre.
BEMÆRK: Dette gøres for at få bedre eksponering, når du endelig skærer IHIVC. - Injicer 0,5 ml kold HTK med 100 U heparinopløsning gennem PV med en 30 G nål. Vent 1 minut på, at heparinet fordeles systematisk. Skær portalvenen lige bedre end miltvenen og overlegen-mesenterisk vene.
- Injicer langsomt kold HTK-konserveringsopløsning med heparin i IHIVC med en 30 G nål for at perfusere donorleveren. Stop med at injicere opløsningen, når væsken, der kommer fra PV, er klar. Når injektionen er afsluttet, skal du placere en mikroklemme på IHIVC lige bedre end den højre nyrevene og skære lige ringere end klemmen. Når dette trin er afsluttet, skal du slukke for respiratoren og stoppe isofluran, da dyret lige er blevet aflivet.
- Skær CBD distalt til den stent, der tidligere blev placeret i trin 2.7. Derudover skal du identificere den cystiske kanal og ligere kanalen med en 10-0 nylonsutur. Tag derefter fat i galdeblærens kuppel med et par tang og disseker fri for galdeblærefossa ved hjælp af en kombination af skarp og stump dissektion. Når galdeblæren er tilstrækkeligt mobiliseret, skal du ved hjælp af en fjedersaks fuldføre cholecystektomien ved at skære den cystiske kanal over den tidligere placerede sutur.
- Træk leveren ringere tilbage for at udsætte den supra-hepatiske IVC (SHIVC). Skær SHIVC og vær særlig opmærksom på at give en passende længde for anastomosen hos modtagerdyret.
- Disseker gratis yderligere ligamentøse vedhæftede filer til leveren og lever donorleveren ex-vivo og læg organet i en beholder med koldt saltvand.
3. Bagbord forberedelse af leverallograft
- Læg is i en isoleret beholder, og læg en petriskål på isbunden. Fyld petriskålen med koldt saltvand. Placer leverallograften i skålen, så den viscerale overflade udsættes.
- Placer PV gennem den tidligere valgte manchet, og evert venen, så den indre endoteloverflade er udsat. Fastgør manchetten med 10-0 nylonsutur. Sørg for, at suturen ligger inden for manchettens riller for de bedste resultater (figur 5).
- Juster leverallograften for at udsætte SHIVC og placer to 8-0 Nylon stay-suturer ved henholdsvis 3' og 9 orientering for eventuel anastomose hos modtagerdyret. Juster leverallograften igen for at udsætte IHIVC og placer to 8-0 Nylon stay-suturer ved henholdsvis 3' og 9 orientering for eventuel anastomose hos modtagerdyret.
4. Modtagerens transaktion
BEMÆRK: Da dette er en steril operation, skal du bruge handsker og korrekt personligt beskyttelsesudstyr og administrere antibiotika. Administrer 0,1 mg/kg Buprenorphin subkutant som præoperativ analgesi på operationstidspunktet.
- Udsæt pHA som i donoroperationen; Brug kun en midterlinje laparotomi i stedet for det tidligere beskrevne abdominale snit.
- Mobiliser leveren og skær alle ligamentøse vedhæftede filer. Derudover ligeres venstre phrenic og paraoesophageal fartøjer med 10-0 nylon sutur.
- Træk leveren ringere tilbage og disseker fri SHIVC fra retroperitoneum. Derefter trækkes leveren overlegent tilbage og dissekerer IHIVC fra retroperitoneum. Cauterize små broende vener og lændehvirvelvener efter behov ved hjælp af samme teknik som tidligere beskrevet.
- Cauterize den højre binyrevene med håndholdt cautery og udsætte leveren hilum. Ligate pHA med 10-0 nylon sutur. Derefter dissekeres CBD fri for PV og ligere CBD med 7-0 sutur tæt på bifurcation af CBD for at give en passende længde til CBD anastomose.
- Brug en mikroklemme til at klemme infra-hepatisk IVC og midlertidigt ligere PV med en 7-0 sutur. Start den an-hepatiske fase. Stop indånding af isofluran.
BEMÆRK: Efter fastspænding af portalvenen og IVC blokeres levervenøs retur fuldstændigt i det anhepatiske stadium. Det inhalerede bedøvelsesmiddel isofluran metaboliseres af leveren; Således stoppes dets indånding øjeblikkeligt, da akkumulering kan føre til kardiopulmonal sammenbrud. - Gennem den indfødte levers PV injiceres 0,5 ml heparin-saltvand med en 30 G nål for at skylle organet.
- Placer mikrovaskulære klemmer på SHIVC og IHIVC så proximalt og distalt som muligt for at efterlade en tilstrækkelig længde til anastomose. Skær den indfødte SHIVC, IHIVC, PV (tæt på den tidligere placerede sutur) og eventuelle resterende ligamentbånd til modtagerens indfødte lever og lever den indfødte lever ex vivo.
BEMÆRK: IHIVC-klemmen skal være over højre nyrevene. - Placer donorleverallotransplantatet inde i bughulen og træk hilum af donorallograften tilbage for at udsætte PV. Skyl både donoren og native PV med 0,5 ml heparinsaltvand ved hjælp af en 30 G nål for at de-air karrene for at undgå luftemboli. Indsæt derefter den tidligere fremstillede manchet af donor PV i lumen af modtagerleveren PV og om nødvendigt placere ophold suturer for at hjælpe med anastomose (8-0 sutur). Fastgør anastomosen med 7-0 sutur (figur 6).
- Drej brættet 180°. Udfør en håndsyet anastomose med 10-0 nylonsutur med donoren og den indfødte SHIVC. Efter afslutning af anastomose i den bageste væg skylles med 0,5 ml heparinsaltvand for at de-luft for at undgå luftemboli. Komplet anastomose af den overlegne væg (figur 7).
- Fjern ligationssuturen af PV først; Fjern derefter de vaskulære klemmer fra SHIVC for at begynde reperfusion. An-hepatisk fase afsluttes og isofluraninhalation genoptages. Udfør håndsy anastomose med 10-0 nylonsutur på samme måde som for SHIVC-anastomose for at rekonstruere IHIVC. Når rekonstruktionen er afsluttet, skal du fjerne mikroklemmen fra den indfødte og donor IHIVC for at reperfuse (figur 8).
- Udfør CBD-anastomosen ved at oprette en duktotomi på modtageren CBD nær den tidligere placerede sutur. Indsæt stenten i donor-CBD i modtagerens CBD-lumen, og fastgør anastomosen med 10-0 sutur (figur 9).
- Skyl bukhulen med 1 ml saltvand; Kontroller hæmostase og cauterize eventuelle resterende blødende kar. Luk abdominalsnittet i to lag ved hjælp af 6-0 sutur.
- Anbring dyret i en varm rugekasse (42 °C) til restitution, og lad ikke dyret være uden opsyn, før det har genvundet bevidstheden og tilstrækkelig aktivitet. Administrer 0,1 mg/kg buprenorphin subkutant efter operationen og fortsæt administrationen hver 8. til 12. time i 48 timer efter operationen. Derudover administreres carprofen (0,2 ml opløst i 400 ml vand) gennem modtagerdyrets vandflaske i op til 7 dage efter operationen. Overhold modtagerdyret i 4-5 timer, og når det er kommet sig helt, skal du returnere det til opstaldningsstedet, da det nu er sikkert at være sammen med andre dyr.
BEMÆRK: Smertestillende medicin og antibiotika kan administreres i henhold til anbefalinger fra den lokale dyreetiske komité.
5. Mus mikroCT angiografi billeddannelse
- Efter at have observeret musen i det forudbestemte undersøgelsesinterval, skal du forberede musen til at evaluere allograftens patency ved hjælp af mikroCT-angiografi.
- Sørg for, at ventilations- og anæstesimaskinerne er tændt for at opvarme isofluranfordamperen. Fyld anæstesibeholderen med 30 ml flydende isofluran, og sørg for, at ventilatormaskinen er forbundet med ilten. Tænd microCT-scanneren, og sørg for, at al software fungerer korrekt.
- Start anskaffelsessoftwaren på microCT-scannersystemet.
- På skærmen på microCT-enheden skal du klikke på Initialiser system og vælge CT-scanningstilstand.
- Skub sengen ud; Fastgør musesengen og lås den.
- Tænd varmebrættet til 42 °C for restitutionsburet.
- Fyld en 1 ml sprøjte med 100 μL CT-kontrastmiddel. Fastgør en 30-gauge nål til fremtidig intravenøs administration af kontrast. Sørg for, at der ikke er luftbobler i sprøjten.
- Placer en mus i halevenefastholdelsessystemet. Når musen er helt inde i fastholdelsessystemet, skal du lukke systemets port, lade halen falde lodret og forsigtigt tørre den af med en alkoholopløsning (70% ethanol).
BEMÆRK: Succes med kanylering af halevenen kan øges ved opvarmning af dyrets hale ved at holde den i en handskehånd i flere minutter. - Tag fat i halen mod det distale aspekt, og placer to fingre (indeks og midt) omkring halen proksimalt til det planlagte injektionssted. Placer det distale aspekt af halen (under injektionsstedet) mellem tommel- og ringfingeren.
- Med begge sæt fingre skal du trykke let og indsætte nålen i venen med en lav dybde, og sørg for, at sprøjten og nålen er parallelle med halen. Mens du frigiver trykket fra pegefingeren ved den proksimale hale, skal du intravenøst administrere CT-kontrastmidlet. Undgå aspiration med sprøjten, da dette kan få venen til at kollapse.
BEMÆRK: Der må ikke mærkes modstand under injektionen, hvis nålen er korrekt placeret i venen. Hvis der er modstand, skal nålen fjernes og indsættes igen over det oprindelige injektionssted. Hvis kanylering af venen mislykkes selv efter to forsøg, skal nålen udskiftes. - Når kontrasten er injiceret og nålen fjernet, påføres injektionsstedet blidt med sterilt gaze for at stoppe blødningen.
- Overfør musen til isofluraninhalationskammeret og indstil koncentrationen til 2,5% med en iltstrøm på 2 ml/min og vent 3-4 min. Når et anæstesiplan er etableret, skal du hurtigt overføre musen til microCT-scannersengen og lægge den i den udsatte position på scannerbordet (figur 10).
- Dæk dyrets øjne med den rette mængde oftalmisk salve. Placer næsekeglen passende over dyret, og sørg for, at luft og isofluran strømmer korrekt gennem næsekeglen. Brug de samme anæstesiparametre beskrevet tidligere (trin 5.12). Smør og indsæt en rektal temperatursonde for kontinuerligt at overvåge dyrets kropstemperatur under billeddannelsen.
- Placer en åndedrætsværn i kontakt med musen.
- Brug tape til at fastgøre en EKG-pude til venstre, højre og venstre bagben. Brug ultralydgel til at forbedre signalet mellem EKG-puden og huden.
- Kontroller EKG og åndedrætssignal på computersoftwaren for at sikre, at der ses korrekte QRS-komplekser på skærmen. Det gør du ved at markere Logisk kundeemne under fanen Kildeopsætning og vælge det kundeemne, der giver den tydeligste EKG-kurve.
BEMÆRK: Logikledningerne svarer til de tre EKG-puder, der er forbundet til højre, venstre bryst og underben. Hvert bly repræsenterer en EKG-kurve. - Indstil forstærkning for korrekt signalhøjde, normalt er 4 eller 8 godt. Vælg dual gating. Under fanen Skærmopsætning skal du justere skærmindstillingerne for en klar signalvisning: marker afkrydsningsfelterne ud for EKG og RESP , og indstil hver til 500. Under fanen Triggeropsætning skal du bekræfte, at Kanal A, Kanal B og DualTrig er markeret.
- Sørg for, at følgende parametre også er indstillet: Tærskel: når signalet falder under denne værdi; indstil værdien til 2.500; Hysterese: Sørg for, at signalet krydser hysterese for at skabe et softwaretriggerpunkt, hvor en ny udløsningscyklus starter; indstil værdien til 300; Forsinkelse: vent, før udløseren sendes; indstil værdien til 100; Inhiber: Intet signal kan genereres i denne periode, indstil værdien til 200.
- Sørg for, at tærsklen for EKG er under hystereseværdien og over toppen af sT-segmentet på skærmen.
- Før dyret ind i scanneren, og tryk på Opdater billede. Få et røntgenspejderbillede af dyret for at vælge det passende synsfelt og anatomiske scanningsdækning for det efterfølgende mikroCT-billede.
- Udfør mikroCT-angiografibilledoptagelse ved hjælp af følgende parametre: Forstørrelser: Ultra fokus, Scanningsvinkel: Fuld (360) scanning, Energi: Enkelt, Scanningstilstand: Gated, Indstilling: Standard (fuld 360° rotation, standardindstillinger for røntgenrør på 0,33 mA og 55 kV, 0,750° grad pr. trin, 1 projektion pr. trin, 1 x 1 binning og 40 ms eksponeringstid; dobbelt gating betyder hjerte- og åndedrætsgating) (figur 11).
- Efter afslutningen af scanningen overføres dyret til et forvarmet genopretningsbur. Når dyret er kommet sig helt, overføres det tilbage til sit primære bur.
- Rekonstruer microCT-billeder ved hjælp af systemsoftware. Når du har uploadet billedet, skal du indstille de blå bjælker, så det strækker sig over det anatomiske interesseområde; Se et eksempel på et udsnit for at gøre lydstyrken mindre og så begrænset til musen som muligt (dette trin hjælper med at reducere størrelsen på det rekonstruerede billede).
- Slå dispositionen for lydstyrke af interesse til for at optimere billedgrænsen. Vælg 40 μm voxelstørrelse, Hann projektionsfilter og Gaussisk volumenfilter (80 μm). Gå til Avanceret | Billedbaseret gating og juster triggervinduerne og fasen til henholdsvis 0,5 og 0,6, vælg 10 faser til hjertegating, og tryk derefter på lydstyrkerekonstruktionsknappen .
Representative Results
For de forskere, der ikke er kirurger, ikke bekendt med anatomi eller ubehagelig fortolkning af radiologiske resultater, bør korrekt billedanalyse udføres af personale med ordentlig træning. Succesen med en OLT i en mus er demonstreret i ovenstående protokol. For at forbedre undersøgelsesmålinger og give feedback i realtid for succesen med en transplantation samt eliminere behovet for obduktion kan en mikroCT-angiografiscanning desuden bruges til at give nøjagtige og klare billeder. Repræsentative billeder er inkluderet i dette manuskript (figur 11). Repræsentative billeder af in vivo mislykket anastomose kan ses i figur 12.
De, der er bekendt med leveranatomi og vaskulatur, kan se patentvenøse anastomoser af IVC. Under nogle omstændigheder kan portalvenen også visualiseres, hvilket let fremstilles i denne model på grund af portalvenemanchetten. Visningen af åbne anastomoser indikerer operationens tekniske succes. Derudover kan 3D-rekonstruktion af disse billeder give yderligere information til forskere og et mere detaljeret billede af den vaskulære anatomi. Ved hjælp af denne ovenstående model er dødeligheden i OLT-musekohorten ~ 40-45%.
Figur 1: Oversigt over ortopisk levertransplantation. (A) Grafisk tegning, der viser de fire forskellige anastomoser: i) suprahepatisk IVC-anastomose, ii) infrahepatisk IVC-anastomose, iii) portalveneanastomose, iv) almindelig galdeganganastomose. Hver pil angiver en relativ placering for, hvor beholderen eller kanalen skal skæres over lever-IVC (protokoltrin 2.13), infrahepatisk IVC (protokoltrin 2.11), portalvene (protokoltrin 2.10) og almindelig galdegang (protokoltrin 2.7). B) In vivo-diagram over anastomoser. Skalastang = 2 mm. Forkortelse: IVC = ringere vena cava. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kirurgiske værktøjer, der anvendes i kirurgi. (A) 45° fine pincet, (B-E) fine pincet, (F) buede nåleholder/pincet, (G) lige tang, (H) vaskulær klemmeapplier, (I) hæmostat, (J) nåleholder, (K) elektrokauterianordning, (L) #11 blad, (M) abdominal retraktor, (N,O) mikrosaks, (P) fin saks, (Q) kirurgisk saks, (R,S) Yasargil-klemmer, (T) bulldogveneklemme, (U) mikrovaskulær klemme. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Portalvenemanchet og galdegangstent. Ex vivo-billede af stenter og manchetter før brug. Vægtstang = 3,5 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Almindelig galdegangsstent under donoroperation. (A) Galdegangsstent indsættes i den fælles galdegang. (B) Galdegangstenten fastgjort i galdegangen. Vægtstang = 2 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Placering af portalvenemanchet under forberedelse af leverallotransplantatet på bagbordet. (A) Gevind portalvenen gennem venøs manchet. (B) Everted vene over manchetten. Vægtstang = 2 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Anastomose af portalvene under modtageroperation. (A) Indsættelse af venemanchet i modtagerportalvenen. (B) Portalveneanastomose sikret med sutur. Vægtstang = 2 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Suprahepatisk IVC-anastomose under recipientoperation. (A) Anastomosens bagvæg er komplet. (B) Afsluttet SHIVC anastomose. Skalastang = 2 mm. Forkortelser: IVC = ringere vena cava; SHIVC = suprahepatisk IVC. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Infrahepatisk IVC-anastomose under recipientoperation. (A) Anastomosens bagvæg er komplet. (B) Afsluttet IHIVC-anastomose. Skalastang = 2 mm. Forkortelser: IVC = ringere vena cava; IHIVC = infrahepatisk IVC. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Almindelig galdegangsanastomose under recipientdrift. (A) Placering af galdegangstenter i modtagerens fælles galdegang. (B) Sikring af galdegangsanastomose. Vægtstang = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10: MusemikroCT-angiografi dyrepræparation. (A) Injektion af musehalevene for at administrere kontrast. (B) Mus, der føres gennem mikroCT-maskine. Forkortelse: microCT = mikrocomputertomografi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 11: Repræsentative billeder, der viser mikroCT-angiografi af allograftpatency. (A,B) Kontrast kan ses i hele IVC, hvilket viser patency af de suprahepatiske og infrahepatiske anastomoser. (C) Kontrast i portalvenen, der igen demonstrerer patency. (D) 3D-rekonstruktion af vaskulaturen. Forkortelser: microCT = mikrocomputertomografi; IVC = ringere vena cava; PV = portalvene. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 12: Repræsentative billeder, der viser mislykkede in vivo-anastomoser . (A) Mislykket portalveneanastomose på grund af forvrængning af venen, hvilket resulterer i manglende blodgennemstrømning. (B) Mislykket suprahepatisk IVC-anastomose på grund af overdreven blødning. Vægtstang = 2 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
OLT hos gnavere er velbeskrevet i litteraturen 2,8. For at udføre denne teknisk krævende procedure kræves der ofte flere års mikrokirurgi (eller kirurgi generelt), da dette indebærer en robust forståelse af anatomi og teknisk evne. Under udviklingen af denne model stod vi over for flere tekniske problemer, der alle drejede sig om anastomoserne. Især med PV-anastomose er det ofte vanskeligt at stabilisere venen for anastomose. Vi har fundet ud af, at placering af en eller to suturer (kirurgpræference) hjælper med at lette manchetplaceringer. Det skal bemærkes, at placering af flere opholdssuturer øger operationstiden.
Derudover er SHIVC dybt inde i bughulen og er vanskelig at placere en klemme på for at give tilstrækkelig eksponering. Vi har fundet ud af, at hvis musen er afslappet som muligt i sin fastholdelse, vil det øge venens fleksibilitet. I sidste ende vil det være op til kirurgen at bestemme den korrekte placering med praksis. Desuden er kanalen med CBD-anastomose igen meget delikat. Det kan være svært at placere opholdssuturer for at stabilisere kanalen, og muligvis vil placering på et lille stykke gasbind hjælpe med stabilisering. Endelig, da alle små pattedyr er unikt sarte med hensyn til anæstesitid, er det vigtigt at udføre operationen så hurtigt som muligt. Ideelle kirurgiske tider er som følger: 1) donoroperation, 45-60 min; 2) forberedelse af bagbord, 15 min; 3) modtageroperation, 60-80 min. Øvelse vil hjælpe med at mindske spildt bevægelse.
Efterhånden som dyremodeller skrider frem, er evnen til at evaluere succesen med undersøgelsesinterventioner også avanceret. MicroCT blev først brugt til at gennemføre undersøgelser af vaskulatur hos rotter i slutningen af 1990'erne17. Der er mange udfordringer ved at udføre nøjagtige og klare mikroCT-angiografiundersøgelser hos gnavere. Imidlertid stammer de fleste af udfordringerne fra disse pattedyrs korte hjerte- og åndedrætscyklusser. Dette overvindes ved at bruge korte eksponeringer til at begrænse bevægelsesartefakter samt højere fotonfluenshastigheder18. Generelt fandt vi, at brugen af hjertegating samt justering af isoflurankoncentrationer for at reducere respirationsfrekvensen gav de klareste billeder. Vi har også fundet ud af, at brug af gnaverspecifik kontrasttiming til specifikke faser: leverarteriel fase, portalvenøs fase og forsinket fase også har forbedret visualisering19. Brugen af ExiTron nano 12000 kontrast har flere fordele og kan forbedre den samlede billedkvalitet. Det giver den stærkeste kontrastforbedring i leveren20 og blodet21. En anden fordel er, at kontrasten er til stede i leveren i op til 120 timer efter den første injektion, hvilket kan skære ned på associeret levertoksicitet, da mindre kontrast er nødvendig, hvis gentagne scanninger er nødvendige20.
Da scanninger udføres med musen bedøvet med isofluran, ændres kontrastforbedringen ikke med denne ændring i fysiologi20. Ved at anvende disse billeddannelsesteknikker og ExiTron-kontrast er en klar evaluering af vellykkede anastomoser i OLT mulig. MicroCT giver mulighed for ikke-invasiv evaluering af in vivo allotransplantater over en længere periode. Denne protokol reducerer antallet af dyr, der skal ofres for at evaluere vaskulære anastomoser og give mulighed for at studere terapi over flere uger og deres virkning på vaskulaturen.
Begrænsninger
Det skal bemærkes, at mens der er sket flere revisioner af OLT-modellen for at perfektionere dens teknik, er visualiseringen af anastomoserne ved hjælp af mikroCT stadig en løbende proces. Desuden giver mus OLT et unikt indblik i transplantationsmedicin. Det er dog ikke en omfattende model, da det er svært at holde disse mus i live efter 1 uge. Yderligere transplantationsmodeller bør også anvendes til yderligere at underbygge prækliniske forsøg.
Konklusioner
Fremskridt inden for mikroCT har udviklet sig hurtigt i løbet af det sidste årti, hvilket giver forskere uvurderlige nye værktøjer inden for dyremodeller og transplantation. I fremtiden vil mere detaljeret 3D-billeddannelse give yderligere indsigt i forskning og opdagelse.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
SMB støttes af National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) tilskud R01DK1234750. BAW støttes gennem National Institutes of Health National Heart Lung and Blood Institute grant R01HL143000.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 Blade | Fisher Scientific | 3120030 | |
| 4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| 6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
| 7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
| 8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
| 10-0 nylon suture | AD Surgical | M-N510R19-B | |
| 20 G Angiocath | Boundtree | 602032D | |
| 30 G Needle | Med Needles | BD-305106 | |
| Baytril (enrofloxacin) Antibacterial Tablets | Elanco | NA | |
| Bovie Chang-A-Tip High Temp Cauterizer | USA Medical and Surgical Supplies | BM-DEL1 | |
| Bulldog Vein Clamp 1 1/8 | Ambler Surgical USA | 18-181 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | ||
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Store | RS-5668 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science tools | 11254-20 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11252-50 | |
| Dumont Medical #5/45 Forceps - Angled 45° | Fine Science tools | 11253-25 | |
| ExiTron nano 12000 | Miltenyi Biotec | 130 - 095 - 698 | CT contrast agent |
| Forceps | Fine Science tools | 11027-12 | |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Roboz Surgical | RS-7112 | |
| heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| histidine-trypotophan-ketoglutarate | University Pharmacy | NA | |
| Insulated Container | YETI | ROADIE 24 HARD COOLER | https://www.yeti.com/coolers/hard-coolers/roadie/10022350000.html |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
| Mirco Serrefines | Fine Science tools | 18055-05 | |
| Mouse Rectal Temperature Probe | WPI Inc | NA | |
| NEEDLE HOLDER/FORCEPS straight | Micrins | MI1540 | |
| PE10 Tubing | Fisher Scientific | BD 427400 | |
| perfadex | XVIVO Perfusion AB | REF99450 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | NA | |
| saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
| Scissors | Fine Science tools | 14090-11 | |
| Small Mouse Restraint – 1” inner diameter | Pro Lab Corp | MH-100 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent scientific | SS-MVG-Module | |
| Surgical microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| U-CTHR | MI Labs | NA | CT Scanner software |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
| Yasagil clamp | Aesculap | FT351T | |
| Yasagil clamp | Aesculap | FT261T | |
| Yasagil clamp applicator | Aesculap | FT484T |
References
- Rana, A., et al. Survival benefit of solid-organ transplant in the United States. JAMA Surgery. 150 (3), 252-259 (2015).
- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E.
- Nakano, R., et al. Dendritic cell-mediated regulation of liver ischemia-reperfusion injury and liver transplant rejection. Frontiers in Immunology. 12, 705465 (2021).
- Nakamura, K., et al. Antibiotic pretreatment alleviates liver transplant damage in mice and humans. Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3420-3434 (2019).
- Lee, S. K., et al. Patient-derived Avatar mouse model to predict the liver immune homeostasis of long-term stable liver transplant patients. Frontiers in Immunology. 13, 817006 (2022).
- Li, S. P., et al. Characterization and proteomic analyses of proinflammatory cytokines in a mouse model of liver transplant rejection. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 5188584 (2022).
- Huang, D. R., Wu, Z. J., Zhu, Y. Modified arterialization of orthotopic liver transplantation in a mouse model. Hepatobiliary Pancreatic Disease International. 9 (3), 264-268 (2010).
- Yokota, S., et al. Orthotopic mouse liver transplantation to study liver biology and allograft tolerance. Nature Protocols. 11 (7), 1163-1174 (2016).
- Chen, X. C., et al. Reduced complications after arterial reconnection in a rat model of orthotopic liver transplantation. Journal of Visual Experiments. (165), e60628 (2020).
- Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visual Experiments. (96), e52309 (2015).
- Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
- Lee, Y. G., et al. A rat lung transplantation model of warm ischemia/reperfusion injury: optimizations to improve outcomes. Journal of Visual Experiments. (176), e62445 (2021).
- Di Martino, M., et al. Imaging follow-up after liver transplantation. British Journal of Radiology. 89 (1064), 20151025 (2016).
- Vardar, B. U., Dupuis, C. S., Goldstein, A. J., Vardar, Z., Kim, Y. H. Ultrasonographic evaluation of patients with abnormal liver function tests in the emergency department. Ultrasonography. 41 (2), 243-262 (2022).
- Marx, J. Imaging. Animal models: live and in color. Science. 302 (5652), 1880-1882 (2003).
- Maehara, N. Experimental microcomputed tomography study of the 3D microangioarchitecture of tumors. European Radiology. 13 (7), 1559-1565 (2003).
- Garcia-Sanz, A., Rodriguez-Barbero, A., Bentley, M. D., Ritman, E. L., Romero, J. C. Three-dimensional microcomputed tomography of renal vasculature in rats. Hypertension. 31, 440-444 (1998).
- Badea, C., Hedlund, L. W., Johnson, G. A. Micro-CT with respiratory and cardiac gating. Medical Physics. 31 (12), 3324-3329 (2004).
- Ma, G., et al. Assessment of hemodynamics in a rat model of liver cirrhosis with precancerous lesions using multislice spiral CT perfusion imaging. BioMed Research International. 2013, 813174 (2013).
- Mannheim, J. G., et al. Comparison of small animal CT contrast agents. Contrast Media and Molecular Imaging. 11 (4), 272-284 (2016).
- Rothe, J. H., et al. Time course of contrast enhancement by micro-CT with dedicated contrast agents in normal mice and mice with hepatocellular carcinoma: comparison of one iodinated and two nanoparticle-based agents. Academic Radiology. 22 (2), 169-178 (2015).
