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माइक्रोकंप्यूटेड टोमोग्राफी एंजियोग्राफी का उपयोग करके चूहों में सफल ऑर्थोटोपिक लिवर प्रत्यारोपण

Published: September 22, 2023 doi: 10.3791/65537
Automatic Translation
1, 2,3, 4, 2, 2, 5, 4,5,6, 7,8, 2,9, 1,4, 1,10
1Department of Surgery, Nationwide Children’s Hospital, 2COPPER Laboratory, The Ohio State University, 388th Surgical Operation Operations Squadron, WPAFB, 4Center for Regenerative Medicine, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 5Division of Vascular Diseases and Surgery, The Ohio State University College of Medicine, 6Interdisciplinary Biophysics Graduate Program, The Ohio State University, 7Division of Medicinal Chemistry and Pharmacognosy, The Ohio State University College of Pharmacy, 8The Ohio State University Comprehensive Cancer Center, 9Division of Cardiac Surgery, Department of Surgery, The Ohio State Wexner Medical Center, 10Division of Transplantation, Department of Surgery, The Ohio State Wexner Medical Center

Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम चूहों में सफल orthotopic जिगर प्रत्यारोपण (ओएलटी) के एक मॉडल के कार्यान्वयन पर चर्चा. इसके अतिरिक्त, माउस में सफल ओएलटी के बाद एलोग्राफ्ट पेटेंसी का और विश्लेषण करने के लिए सहायक पर भी चर्चा की जाती है, विशेष रूप से माइक्रोकंप्यूटेड टोमोग्राफी (माइक्रोसीटी) स्कैन का उपयोग करते हुए।

Abstract

माइक्रोकंप्यूटेड टोमोग्राफी (माइक्रोसीटी) एंजियोग्राफी शोधकर्ताओं के लिए एक अमूल्य संसाधन है। इस तकनीक में नई प्रगति ने उच्च-गुणवत्ता वाली छवियों को सूक्ष्म-वाहिका प्राप्त करने की अनुमति दी है और अंग प्रत्यारोपण के क्षेत्र में उच्च-निष्ठा उपकरण हैं। चूहों में ऑर्थोटोपिक यकृत प्रत्यारोपण (ओएलटी) के इस मॉडल में, माइक्रोसीटी वास्तविक समय में एलोग्राफ्ट एनास्टोमोसिस का मूल्यांकन करने का अवसर देता है और अध्ययन जानवरों का त्याग नहीं करने का अतिरिक्त लाभ है। कंट्रास्ट की पसंद, साथ ही छवि अधिग्रहण सेटिंग्स, एक उच्च-परिभाषा छवि बनाती है, जो शोधकर्ताओं को अमूल्य जानकारी देती है। यह प्रक्रिया के तकनीकी पहलुओं के मूल्यांकन के साथ-साथ संभावित रूप से समय की विस्तारित अवधि में विभिन्न चिकित्सीय मूल्यांकन करने की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल में, हम एक चरणबद्ध फैशन में चूहों में एक ओएलटी मॉडल का विस्तार करते हैं और अंत में एक माइक्रोसीटी प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो उच्च गुणवत्ता वाली छवियां दे सकता है, जो शोधकर्ताओं को ठोस अंग प्रत्यारोपण के गहन विश्लेषण में सहायता करता है। हम एक माउस में यकृत प्रत्यारोपण के लिए चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रदान करते हैं, साथ ही माइक्रोसीटी एंजियोग्राफी के माध्यम से ग्राफ्ट की धैर्य का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पर संक्षेप में चर्चा करते हैं।

Introduction

अंत-चरण यकृत रोग के लिए प्रत्यारोपण एकमात्र प्रभावी चिकित्सा है। निस्संदेह, यकृत प्रत्यारोपण का लाभ उत्कृष्ट है, प्रतीक्षा सूची1 में 11.6 वर्ष बनाम 3.1 वर्ष की औसत उत्तरजीविता के साथ। हालांकि, महत्वपूर्ण बाधाएं हैं, जो यकृत प्रत्यारोपण के व्यापक अनुप्रयोग को सीमित करती हैं, और सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि उपयुक्त, उच्च गुणवत्ता वाले दाता अंगों की कमी शामिल है। इस प्रकार, दाता अंग पूल का विस्तार करने के लिए नवीन रणनीतियों की आवश्यकता होगी जो वर्तमान में अनुपयुक्त माने जाने वाले एलोग्राफ्ट के उपयोग की अनुमति देते हैं, जिससे प्रत्यारोपण के लिए सुरक्षा का मार्जिन बढ़ जाता है। इसलिए, यकृत प्रत्यारोपण तक पहुंच में सुधार करने के लिए, छोटे जानवरों में प्रीक्लिनिकल अध्ययन करना अनिवार्य है।

प्रत्यारोपण अनुसंधान के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण प्रत्यारोपण के विवो मॉडल में हैं। माउस ऑर्थोटोपिक यकृत प्रत्यारोपण (ओएलटी) लगभग 30 वर्षों2 के लिए रहा है और प्रत्यारोपण के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है, जिसमें प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लक्षण वर्णन, इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट, तीव्र अस्वीकृति, उपन्यास एजेंटों के चिकित्सीय प्रभाव और दीर्घकालिक अस्तित्व 3,4,5,6,7 शामिल हैं. प्रत्यारोपण का अध्ययन करने के लिए चूहों का उपयोग महत्वपूर्ण है क्योंकि यह प्रत्यारोपण के परिणामों पर विशिष्ट आणविक मार्गों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए ट्रांसजेनिक माउस लाइनों के उपयोग की अनुमति देता है। माउस जिगर प्रत्यारोपण की स्थापित प्रोटोकॉल अच्छी तरह से पहले 8,9 वर्णित किया गया है.

सुप्रा और इन्फ्रा हेपेटिक अवर वेना कावा (आईवीसी), पोर्टल शिरा (पीवी), और सामान्य पित्त नली (सीबीडी) के लिए एनास्टोमोसेस के कई तरीके मौजूद हैं। वे आम तौर पर या तो हाथ anastomosis या murine फेफड़े प्रत्यारोपण10,11,12 के समान एक संशोधित संवहनी कफ तकनीक पर भरोसा करते हैं. प्राप्तकर्ता चूहों के दीर्घकालिक अध्ययन और अस्तित्व के साथ-साथ एक निरंतर माउस यकृत प्रत्यारोपण कार्यक्रम के विकास में एक महत्वपूर्ण कदम, इन महत्वपूर्ण एनास्टोमोस का मूल्यांकन करने की क्षमता है। जिगर allograft धैर्य का मूल्यांकन करने के लिए इमेजिंग तौर-तरीकों अक्सर नैदानिक सेटिंग13,14 में अल्ट्रासाउंड और कंप्यूटर टोमोग्राफी (सीटी) पर भरोसा करते हैं. अल्ट्रासाउंड पर सीटी का एक अलग लाभ है क्योंकि यह हर एनास्टोमोसिस को शामिल करने के लिए पूरे पेट के विचारों की पेशकश कर सकता है, हालांकि अल्ट्रासाउंड के साथ इन विचारों को प्राप्त करना छोटे जानवरों में विशेष रूप से कठिन हो सकता है। महत्वपूर्ण अनुसंधान और संसाधनों पशु अध्ययन और जानकारी हम चोट और रोग15,16 के इन मॉडलों से इकट्ठा कर सकते हैं बढ़ाने के उद्देश्य के लिए सटीक microCT विकसित करने के लिए समर्पित किया गया है. यहाँ हम orthotopic माउस जिगर प्रत्यारोपण (चित्रा 1) के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन और संक्षेप में microCT के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन एलोग्राफ्ट धैर्य और anastomoses के स्थायित्व का मूल्यांकन करने के लिए.

Protocol

नर C57BL/6J चूहों (30 ग्राम शरीर के वजन) को राष्ट्रव्यापी बच्चों के अस्पताल पशु सुविधा में रोगजनक मुक्त परिस्थितियों में रखा गया था। सभी प्रक्रियाओं मानवीय रूप से एनआईएच और मानवीय देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद की गाइड के अनुसार और राष्ट्रव्यापी बच्चों के अस्पताल संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC प्रोटोकॉल AR17-00045) की मंजूरी के साथ प्रदर्शन किया गया था। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, उपकरणों और उपकरणों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. प्रत्यारोपण सर्जरी के लिए प्रारंभिक सेटअप

  1. सर्जिकल उपकरण सेट करें।
    1. सर्जिकल मॉनिटरिंग डिवाइस (यानी, हार्ट-रेट मॉनिटरिंग डिवाइस, पल्स-ऑक्स, मॉड्यूलर मॉनिटर सिस्टम) और एनेस्थीसिया मशीन सेट करें।
    2. यदि उपलब्ध हो, तो सर्जिकल वार्मिंग बोर्ड को 42 डिग्री सेल्सियस पर चालू करें।
    3. सुनिश्चित करें कि आइसोफ्लुरेन बाष्पीकरण को गर्म करने के लिए वेंटिलेशन और एनेस्थीसिया मशीनें चालू हैं। संज्ञाहरण जलाशय को 30 एमएल तरल आइसोफ्लुरेन के साथ भरें और सुनिश्चित करें कि वेंटिलेटर मशीन ऑक्सीजन से जुड़ी है।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में, हम जानवर intubate नहीं है; ऑक्सीजन के लिए केवल नाक शंकु का उपयोग करें।
  2. प्राप्तकर्ता और दाता चूहों के शरीर के वजन रिकॉर्ड.
  3. उच्च शक्ति सर्जिकल माइक्रोस्कोप पर मुड़ें और ऊंचाई को समायोजित करें और सर्जन की वरीयताओं पर ध्यान केंद्रित करें। सुनिश्चित करें कि शेष सर्जिकल उपकरण चालू हैं (यानी, इलेक्ट्रोकॉटरी डिवाइस)।
  4. तैयार करें और शल्य चिकित्सा उपकरणों, साथ ही 10-0 नायलॉन(चित्रा 2)के सर्जिकल संबंधों को बाहर रखना.
    नोट: सभी सर्जिकल उपकरणों को 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव किया गया था। इसके अतिरिक्त, सर्जिकल उपकरणों के विभिन्न विन्यास समान रूप से प्रभावी हो सकते हैं।
  5. पोर्टल शिरा (पीवी) और आम पित्त नली (सीबीडी) स्टेंट (चित्रा 3) के लिए कफ तैयार करें। एंजियोकैथेटर, साथ ही PE10, उच्च शक्ति माइक्रोस्कोप के नीचे एक बाँझ सतह पर रखें. # 11 सर्जिकल ब्लेड का उपयोग करके, कफ बॉडी के शीर्ष पर लगभग 0.75 मिमी टैब के साथ 1.5 मिमी लंबा कफ बनाने के लिए एंजियोकैथेटर को काटें; पॉलीथीन टयूबिंग (PE10) को 2.5 मिमी लंबाई में काटें। कफ को स्टोर करें और उपयोग के लिए तैयार होने तक बाँझ खारा में स्टेंट करें।
    नोट: यह प्रत्यारोपण मॉडल पीवी पुनर्निर्माण के लिए कफ बनाने के लिए 20 जी एंजियोकैथेटर का उपयोग करता है, साथ ही सीबीडी के पुनर्निर्माण के लिए पॉलीथीन ट्यूबिंग 10 (पीई 10) का उपयोग करता है। अन्य सभी एनास्टोमोस हाथ से सिल दिए जाते हैं।
  6. समाधान तैयार करें। एक हेपरिन इंजेक्शन तैयार करें जो हिस्टिडाइन-ट्रिप्टोफैन-केटोग्लूटारेट (एचटीके) समाधान के 0.5 एमएल में 100 यू पर वितरित किया जाएगा। बर्फ पर खारा, हेपरिन-खारा, पीबीएस और एचटीके संरक्षण समाधान स्टोर करें।

2. दाता माउस खरीद

  1. दाता माउस में संज्ञाहरण प्रेरित यह एक isoflurane साँस लेना कक्ष में रखकर. सुनिश्चित करें कि आइसोफ्लुरेन एकाग्रता 2 एमएल / मिनट के ऑक्सीजन प्रवाह के साथ लगभग 2.5% है। विकसित करने के लिए संज्ञाहरण के एक शल्य विमान के लिए 5 मिनट रुको. संज्ञाहरण के उचित स्तर को सुनिश्चित करने के लिए, पैर की अंगुली एक प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए माउस चुटकी; प्रतिक्रिया की कमी इंगित करती है कि संज्ञाहरण का उचित स्तर पूरा हो गया है।
  2. इलेक्ट्रॉनिक कतरनी का उपयोग माउस के पेट दाढ़ी और वार्मिंग बोर्ड पर लापरवाह स्थिति में माउस जगह. पोविडोन-आयोडीन के साथ पेट को साफ करें, फिर 70% इथेनॉल। सूखापन को रोकने के लिए चूहों की आंखों के नीचे नेत्र मरहम रखें।
  3. उच्च शक्ति वाले माइक्रोस्कोप के नीचे माउस रखें और 2 एमएल/मिनट के ऑक्सीजन प्रवाह के साथ 2% एकाग्रता के आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन का उपयोग करके माउस को संज्ञाहरण के तहत बनाए रखें।
  4. जघन सिम्फिसिस के लिए xiphoid प्रक्रिया से कैंची (सर्जन वरीयता) की एक जोड़ी के साथ एक midline laparotomy प्रदर्शन. अगला, पसलियों से अवर 'क्रॉस-लाइक' पैटर्न बनाने के लिए एक अतिरिक्त अनुप्रस्थ चीरा करें। मच्छर hemostatic संदंश का प्रयोग, पेट सामग्री के पर्याप्त जोखिम को प्राप्त करने के लिए xiphoid प्रक्रिया वापस लेने.
    नोट: संदंश सर्जन की पसंद के आधार पर सुरक्षित किया जा सकता है.
  5. आंतों को बाहर निकालें और उन्हें गीले धुंध स्पंज में पेट की गुहा के बाईं ओर रखें। सभी लिगामेंटस अटैचमेंट को नीचे ले जाकर लीवर को मोबिलाइज करें।
  6. उचित यकृत धमनी (पीएचए) का पर्दाफाश करें। वक्र संदंश का उपयोग पोत कंकाल और 10-0 नायलॉन सीवन के साथ यह ligate.
  7. तेज और कुंद विच्छेदन के संयोजन का उपयोग करके सीबीडी की पूरी लंबाई को विच्छेदित करें। भविष्य में उपयोग के लिए पर्याप्त लंबाई देने के लिए अग्न्याशय की बेहतर सीमा के करीब एक डक्टोटॉमी (सीबीडी स्टेंट के लिए काफी बड़ा) करें (~ जिगर की अवर सीमा से 1 सेमी)। ठीक संदंश के साथ सीबीडी में पित्त नली स्टेंट डालें और यह एक 10-0 नायलॉन सीवन के साथ सुरक्षित. एक 10-0 नायलॉन सिवनी (चित्रा 4) का उपयोग सीबीडी के बाहर का पहलू ligate.
  8. एक गीला धुंध स्पंज का उपयोग कर xiphoid की ओर सही यकृत पालि वापस लेने और आईवीसी बेनकाब. इन्फ्रा-हेपेटिक IVC (IHIVC) को रेट्रोपरिटोनियम से दूर करें और हैंडहेल्ड कॉटरी डिवाइस का उपयोग करके सही अधिवृक्क नस को दाग़ानी करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  9. सही गुर्दे धमनी और नस बाहर काटना और 7-0 और 10-0 नायलॉन के साथ लिगेट, क्रमशः. सही गुर्दे की नस और धमनी और शेष लिगामेंटस अटैचमेंट को काटें। अंत में, सही गुर्दे को हटा दें।
    नोट: यह अंत में IHIVC को काटने पर बेहतर प्रदर्शन के लिए किया जाता है।
  10. 30 जी सुई के साथ पीवी के माध्यम से 100 यू हेपरिन समाधान के साथ ठंडे एचटीके के 0.5 एमएल को इंजेक्ट करें। हेपरिन को व्यवस्थित रूप से वितरित करने के लिए 1 मिनट प्रतीक्षा करें। पोर्टल नस को सिर्फ प्लीहा नस और बेहतर-मेसेंटेरिक नस से बेहतर काटें।
  11. दाता यकृत को छिड़कने के लिए 30 जी सुई के साथ आईएचआईवीसी में हेपरिन के साथ धीरे-धीरे ठंडे एचटीके संरक्षण समाधान को इंजेक्ट करें। पीवी से आने वाला तरल पदार्थ साफ होने के बाद घोल को इंजेक्ट करना बंद कर दें। इंजेक्शन पूरा होने के बाद, IHIVC पर एक माइक्रो क्लैंप रखें जो सही गुर्दे की नस से बेहतर हो और क्लैंप से अवर रूप से कट जाए। एक बार यह चरण पूरा हो जाने के बाद, वेंटिलेटर बंद कर दें और आइसोफ्लुरेन को रोकें क्योंकि जानवर को अभी-अभी इच्छामृत्यु दी गई है।
  12. सीबीडी को उस स्टेंट से दूर से काटें जो पहले चरण 2.7 में रखा गया था। इसके अतिरिक्त, सिस्टिक वाहिनी की पहचान करें, और 10-0 नायलॉन सिवनी के साथ वाहिनी को लिगेट करें। अगला, संदंश की एक जोड़ी के साथ पित्ताशय की थैली के गुंबद समझ, और तेज और कुंद विच्छेदन का एक संयोजन का उपयोग पित्ताशय की थैली फोसा से मुक्त काटना. एक बार पित्ताशय की थैली पर्याप्त रूप से जुटाया जाता है, वसंत कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके, पहले से रखे सिवनी के ऊपर सिस्टिक वाहिनी को काटकर कोलेसिस्टेक्टोमी को पूरा करें।
  13. सुप्रा-हेपेटिक IVC (SHIVC) को उजागर करने के लिए लीवर को अवर रूप से वापस लें। प्राप्तकर्ता जानवर में एनास्टोमोसिस के लिए पर्याप्त लंबाई देने के लिए विशेष ध्यान देते हुए शिवसी को काटें।
  14. जिगर के लिए मुक्त अतिरिक्त लिगामेंटस अटैचमेंट को विच्छेदन करें और दाता यकृत पूर्व-विवो वितरित करें और अंग को ठंडे खारा के साथ एक कंटेनर में रखें।

3. लीवर एलोग्राफ्ट की बैक टेबल तैयारी

  1. एक अछूता कंटेनर में बर्फ रखें, और बर्फ के बिस्तर पर एक पेट्री डिश रखें। पेट्री डिश को ठंडी खारा से भरें। डिश में जिगर allograft प्लेस इतना है कि आंत की सतह उजागर किया जाता है.
  2. पीवी को पहले से चयनित कफ के माध्यम से रखें, और नस को एवर्ट करें ताकि आंतरिक एंडोथेलियल सतह उजागर हो। 10-0 नायलॉन सीवन के साथ कफ सुरक्षित. सुनिश्चित करें कि सिवनी सबसे अच्छा परिणाम (चित्रा 5) के लिए कफ के खांचे के भीतर निहित है.
  3. SHIVC को बेनकाब करने के लिए लीवर एलोग्राफ्ट को समायोजित करें और दो 8-0 रखें प्राप्तकर्ता जानवर में अंतिम एनास्टोमोसिस के लिए क्रमशः 3 'और 9 बजे अभिविन्यास पर नायलॉन रहने-टांके। IHIVC को बेनकाब करने के लिए लीवर एलोग्राफ्ट को फिर से समायोजित करें और दो 8-0 रखें प्राप्तकर्ता जानवर में अंतिम एनास्टोमोसिस के लिए क्रमशः 3 'और 9 बजे अभिविन्यास पर नायलॉन रहने-टांके।

4. प्राप्तकर्ता ऑपरेशन

नोट: चूंकि यह एक बाँझ ऑपरेशन है, दस्ताने और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग करें और एंटीबायोटिक दवाओं का प्रशासन करें। सर्जरी के समय प्रीऑपरेटिव एनाल्जेसिया के रूप में चमड़े के नीचे 0.1 मिलीग्राम / किग्रा ब्यूप्रेनोर्फिन का प्रशासन करें।

  1. दाता ऑपरेशन के रूप में पीएचए को बेनकाब करें; केवल पहले वर्णित पेट चीरा के बजाय एक midline laparotomy का उपयोग.
  2. जिगर को जुटाएं और सभी स्नायुबंधन संलग्नक काट लें। इसके अतिरिक्त, 10-0 नायलॉन सिवनी के साथ बाएं फ्रेनिक और पैराओसोफेगल जहाजों को लिगेट करें।
  3. जिगर को अवर रूप से वापस लें और रेट्रोपरिटोनियम से शिवक को मुक्त करें। इसके बाद, यकृत को बेहतर तरीके से वापस लें और रेट्रोपरिटोनियम से IHIVC को मुक्त करें। पहले वर्णित उसी तकनीक का उपयोग करके आवश्यकतानुसार छोटी ब्रिजिंग नसों और काठ का नसों को सावधानी से करें।
  4. हाथ से आयोजित दाग़ना के साथ सही अधिवृक्क नस Cauterize और जिगर hilum बेनकाब. पीएचए को 10-0 नायलॉन सिवनी से बांधें। इसके बाद, पीवी से मुक्त सीबीडी को विच्छेदित करें और सीबीडी एनास्टोमोसिस के लिए पर्याप्त लंबाई देने के लिए सीबीडी के द्विभाजन के करीब 7-0 सिवनी के साथ सीबीडी को लिगेट करें।
  5. इन्फ्रा-यकृत आईवीसी को क्लैंप करने के लिए एक माइक्रो क्लैंप का उपयोग करें और अस्थायी रूप से पीवी को 7-0 सिवनी के साथ लिगेट करें। एक-यकृत चरण शुरू करें। आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन बंद करो।
    नोट: पोर्टल शिरा और आईवीसी को जकड़ने के बाद, यकृत शिरापरक वापसी पूरी तरह से एनाहेपेटिक चरण में अवरुद्ध है। साँस संवेदनाहारी isoflurane जिगर द्वारा metabolized है; इस प्रकार इसकी साँस लेना क्षण भर के लिए बंद हो जाता है क्योंकि संचय से कार्डियोपल्मोनरी पतन हो सकता है।
  6. देशी जिगर के पीवी के माध्यम से, अंग फ्लश करने के लिए 30 जी सुई के साथ हेपरिन-खारा के 0.5 एमएल इंजेक्ट करें।
  7. एनास्टोमोसिस के लिए पर्याप्त लंबाई छोड़ने के लिए SHIVC और IHIVC पर सूक्ष्म-संवहनी क्लैंप को यथासंभव समीपस्थ और दूर से रखें। देशी SHIVC, IHIVC, PV (पहले रखे गए सिवनी के करीब), और प्राप्तकर्ता के मूल यकृत के लिए किसी भी शेष लिगामेंटस अटैचमेंट को काटें और देशी लीवर को पूर्व विवो वितरित करें।
    नोट: IHIVC क्लैंप सही गुर्दे की नस से ऊपर होना चाहिए।
  8. पेट गुहा के अंदर दाता जिगर allograft प्लेस और दाता allograft के hilum वापस लेने के लिए PV बेनकाब. एयर एम्बोलिज्म से बचने के लिए जहाजों को डी-एयर करने के लिए 30 जी सुई का उपयोग करके हेपरिन खारा के 0.5 एमएल के साथ दाता और देशी पीवी दोनों को फ्लश करें। फिर, दाता पीवी के पहले से बने कफ को प्राप्तकर्ता यकृत पीवी के लुमेन में डालें और यदि आवश्यक हो, तो एनास्टोमोसिस (8-0 सिवनी) के साथ मदद करने के लिए स्टे टांके लगाएं। 7-0 सिवनी (चित्रा 6) के साथ एनास्टोमोसिस को सुरक्षित करें।
  9. बोर्ड को 180° घुमाएं। दाता और देशी शिवसी के साथ 10-0 नायलॉन सिवनी के साथ हाथ से सिलना एनास्टोमोसिस करें। पीछे की दीवार एनास्टोमोसिस को पूरा करने के बाद, हवा में शल्यता से बचने के लिए हेपरिन खारा के 0.5 एमएल के साथ फ्लश करें। बेहतर दीवार का पूरा एनास्टोमोसिस (चित्र 7)।
  10. पहले पीवी के बंधाव सिवनी निकालें; फिर, reperfusion शुरू करने के लिए SHIVC से संवहनी clamps हटा दें. एक-यकृत चरण को समाप्त करें और आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन को पुनरारंभ करें। 10-0 नायलॉन सिवनी के साथ हाथ से सीना एनास्टोमोसिस करें, उसी तरह जैसे कि SHIVC एनास्टोमोसिस के लिए, IHIVC के पुनर्निर्माण के लिए। पुनर्निर्माण पूरा करने के बाद, मूल निवासी और दाता IHIVC से माइक्रो क्लैंप को हटा दें (चित्र 8)।
  11. पहले रखे सिवनी के पास प्राप्तकर्ता सीबीडी पर डक्टोटॉमी बनाकर सीबीडी एनास्टोमोसिस करें। दाता सीबीडी में स्टेंट को प्राप्तकर्ता सीबीडी लुमेन में डालें और एनास्टोमोसिस को 10-0 सिवनी(चित्र 9)के साथ सुरक्षित करें।
  12. खारा के 1 एमएल के साथ पेट गुहा की सिंचाई करें; हेमोस्टेसिस की जांच करें और किसी भी शेष रक्तस्राव वाहिकाओं को दागना करें। 6-0 सिवनी का उपयोग दो परतों में पेट चीरा बंद.
  13. वसूली के लिए एक गर्म इनक्यूबेटर (42 डिग्री सेल्सियस) में पशु प्लेस और यह चेतना और पर्याप्त गतिविधि हासिल की है जब तक लावारिस पशु मत छोड़ो. सर्जरी के बाद 0.1 मिलीग्राम/किग्रा ब्यूप्रेनोर्फिन को चमड़े के नीचे प्रशासित करें और सर्जरी के बाद 48 घंटे के लिए हर 8 से 12 घंटे में प्रशासन जारी रखें। इसके अतिरिक्त, सर्जरी के बाद 7 दिनों तक प्राप्तकर्ता जानवर की पानी की बोतल के माध्यम से कार्प्रोफेन (400 एमएल पानी में भंग) का प्रशासन करें। 4-5 घंटे के लिए प्राप्तकर्ता जानवर का निरीक्षण करें, और एक बार जब यह पूरी तरह से ठीक हो जाए, तो इसे आवास स्थान पर लौटा दें क्योंकि अब अन्य जानवरों के साथ रहना सुरक्षित है।
    नोट: दर्द दवाओं और एंटीबायोटिक दवाओं स्थानीय पशु नैतिकता समिति की सिफारिशों के अनुसार प्रशासित किया जा सकता है।

5. माउस माइक्रोसीटी एंजियोग्राफी इमेजिंग

  1. पूर्व निर्धारित अध्ययन अंतराल के लिए माउस को देखने के बाद, माइक्रोसीटी एंजियोग्राफी का उपयोग कर allograft की धैर्य का मूल्यांकन करने के लिए माउस तैयार.
  2. सुनिश्चित करें कि आइसोफ्लुरेन बाष्पीकरणकर्ता को गर्म करने के लिए वेंटिलेशन और एनेस्थीसिया मशीनों को चालू किया गया है। संज्ञाहरण जलाशय को 30 एमएल तरल आइसोफ्लुरेन के साथ भरें, और सुनिश्चित करें कि वेंटिलेटर मशीन ऑक्सीजन से जुड़ी है। माइक्रोसीटी स्कैनर चालू करें और सुनिश्चित करें कि सभी सॉफ्टवेयर ठीक से काम कर रहे हैं।
  3. माइक्रोसीटी स्कैनर सिस्टम पर अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू करें।
  4. माइक्रोसीटी यूनिट के मॉनिटर पर, इनिशियलाइज़ सिस्टम पर क्लिक करें और सीटी स्कैन मोड चुनें।
  5. बिस्तर बेदखल करें; माउस बिस्तर संलग्न करें और इसे लॉक करें।
  6. वसूली पिंजरे के लिए वार्मिंग बोर्ड को 42 डिग्री सेल्सियस पर चालू करें।
  7. सीटी कंट्रास्ट एजेंट के 100 माइक्रोन के साथ 1 एमएल सिरिंज भरें। इसके विपरीत के भविष्य के अंतःशिरा प्रशासन के लिए एक 30 गेज सुई संलग्न करें. सुनिश्चित करें कि सिरिंज में कोई हवाई बुलबुले हैं.
  8. पूंछ नस संयम प्रणाली में एक माउस रखें. एक बार माउस पूरी तरह से संयम प्रणाली के अंदर है, सिस्टम के गेट को बंद करें, पूंछ खड़ी ड्रॉप करने के लिए अनुमति देते हैं, और ध्यान से एक शराब समाधान (70% इथेनॉल) के साथ पोंछ.
    नोट: पूंछ नस के cannulation में सफलता यह कई मिनट के लिए एक दस्ताने हाथ में पकड़ द्वारा जानवर की पूंछ वार्मिंग द्वारा बढ़ाया जा सकता है.
  9. बाहर का पहलू की ओर पूंछ समझ, और योजना बनाई इंजेक्शन साइट के लिए समीपस्थ पूंछ के आसपास दो उंगलियों (सूचकांक और मध्य) जगह है. अंगूठे और अनामिका के बीच में पूंछ के बाहर का पहलू (इंजेक्शन साइट के नीचे) रखें.
  10. उंगलियों के दोनों सेटों के साथ, थोड़ा दबाव लागू करें और एक उथले गहराई का उपयोग नस में सुई डालें, सुनिश्चित करें कि सिरिंज और सुई पूंछ के समानांतर हैं. समीपस्थ पूंछ पर तर्जनी के दबाव को जारी करते समय, सीटी कंट्रास्ट एजेंट को अंतःशिरा रूप से प्रशासित करें। सिरिंज के साथ आकांक्षा से बचें क्योंकि इससे नस ढह सकती है।
    नोट: इंजेक्शन के दौरान कोई प्रतिरोध महसूस नहीं किया जाना चाहिए अगर सुई उचित नस में तैनात है। यदि प्रतिरोध है, तो सुई को हटा दें और इसे मूल इंजेक्शन साइट के ऊपर फिर से डालें। यदि नस का कैनुलेशन दो प्रयासों के बाद भी विफल हो जाता है, तो सुई को बदलें।
  11. सफलतापूर्वक विपरीत इंजेक्शन और सुई को हटाने के बाद, रक्तस्राव को रोकने के लिए बाँझ धुंध का उपयोग इंजेक्शन साइट पर कोमल संपीड़न लागू करें।
  12. माउस isoflurane साँस लेना कक्ष में स्थानांतरण और 2 एमएल / मिनट के ऑक्सीजन प्रवाह के साथ 2.5% के लिए एकाग्रता सेट और 3-4 मिनट प्रतीक्षा करें. एक बार संज्ञाहरण का एक विमान स्थापित किया गया है, जल्दी से माइक्रोसीटी स्कैनर बिस्तर के लिए माउस हस्तांतरण और स्कैनर मेज (चित्रा 10) पर प्रवण स्थिति में रखना.
  13. उचित मात्रा में नेत्र मरहम के साथ जानवर की आंखों को कवर करें। जानवर पर उचित रूप से नाक शंकु रखें और सुनिश्चित करें कि हवा और isoflurane नाक शंकु के माध्यम से ठीक से बह रहे हैं. पहले वर्णित एक ही संज्ञाहरण मापदंडों का उपयोग करें (5.12 कदम). चिकनाई और इमेजिंग के दौरान जानवर के शरीर के तापमान की लगातार निगरानी करने के लिए एक गुदा तापमान जांच डालें।
  14. माउस के संपर्क में एक श्वासयंत्र रखें.
  15. बाएं, दाएं आगे और बाएं हिंद अंगों के लिए ईसीजी पैड संलग्न करने के लिए टेप का उपयोग करें। ईसीजी पैड और त्वचा के बीच संकेत में सुधार करने के लिए अल्ट्रासाउंड जेल का उपयोग करें।
  16. मॉनिटर पर उचित क्यूआरएस कॉम्प्लेक्स देखे जाने को सुनिश्चित करने के लिए कंप्यूटर सॉफ्टवेयर पर ईसीजी और श्वसन संकेत की जांच करें। ऐसा करने के लिए, स्रोत सेट अप टैब में तर्क लीड की जाँच करें, और स्पष्ट ईसीजी वक्र प्रदान करता है कि नेतृत्व चुनें.
    नोट: तर्क तीन ईसीजी पैड के अनुरूप है जो दाएं, बाएं छाती और निचले पैर से जुड़े होते हैं। प्रत्येक लीड एक ईसीजी वक्र का प्रतिनिधित्व करता है।
  17. उचित सिग्नल ऊंचाई के लिए लाभ सेट करें , आमतौर पर 4 या 8 अच्छा होता है। दोहरी गेटिंग का चयन करें। डिस्प्ले सेट अप टैब के तहत, स्पष्ट सिग्नल के लिए प्रदर्शन सेटिंग्स समायोजित करें view: ईसीजी और आरईएसपी के बगल में स्थित बॉक्स पर टिक करें और प्रत्येक को 500 पर सेट करें। ट्रिगर सेट अप टैब के तहत, पुष्टि करें कि चैनल A, चैनल B और DualTrig चेक किए गए हैं।
  18. सुनिश्चित करें कि निम्नलिखित पैरामीटर भी सेट हैं: थ्रेसहोल्ड: जब सिग्नल इस मान से नीचे चला जाता है; मान को 2,500 पर सेट करें; हिस्टैरिसीस: सुनिश्चित करें कि सिग्नल एक सॉफ्टवेयर ट्रिगर पॉइंट बनाने के लिए हिस्टैरिसीस को पार करता है जिस पर एक नया ट्रिगरिंग चक्र शुरू होता है; मान को 300 पर सेट करें; देरी: ट्रिगर भेजे जाने से पहले प्रतीक्षा करें; मान को 100 पर सेट करें; अवरोध: इस अवधि के दौरान कोई संकेत उत्पन्न नहीं किया जा सकता है, मान को 200 पर सेट करें।
  19. सुनिश्चित करें कि ईसीजी के लिए थ्रेशोल्ड हिस्टैरिसीस मान से नीचे है और डिस्प्ले स्क्रीन पर एसटी सेगमेंट के शिखर से ऊपर है।
  20. स्कैनर में पशु अग्रिम और अद्यतन छवि दबाएँ. बाद के microCT छवि के लिए उपयुक्त क्षेत्र के दृश्य और शारीरिक स्कैन कवरेज का चयन करने के लिए जानवर की एक एक्स-रे स्काउट छवि प्राप्त करें.
  21. निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करके माइक्रोसीटी एंजियोग्राफी छवि अधिग्रहण करें: आवर्धन: अल्ट्रा फोकस, स्कैन कोण: पूर्ण (360) स्कैन, ऊर्जा: एकल, स्कैन मोड: गटेड, सेटिंग: डिफ़ॉल्ट (पूर्ण 360 डिग्री रोटेशन, एक्स-रे ट्यूब 0.33 एमए और 55 केवी की डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स, 0.750 डिग्री डिग्री प्रति चरण, 1 प्रक्षेपण प्रति चरण, 1 एक्स 1 बिनिंग, और 40 एमएस एक्सपोजर समय; दोहरी गेटिंग का अर्थ है हृदय और श्वसन गेटिंग) (चित्र 11)।
  22. स्कैन के पूरा होने के बाद, एक prewarmed वसूली पिंजरे के लिए पशु हस्तांतरण. एक बार जब जानवर पूरी तरह से ठीक हो जाता है, तो उसे वापस अपने प्राथमिक पिंजरे में स्थानांतरित करें।
  23. सिस्टम सॉफ्टवेयर का उपयोग करके microCT छवियों का पुनर्निर्माण करें। छवि अपलोड करने के बाद, नीली पट्टियाँ सेट करें ताकि यह रुचि के शारीरिक क्षेत्र को फैला दे; वॉल्यूम को छोटा करने के लिए एक स्लाइस का पूर्वावलोकन करें और जितना संभव हो उतना माउस के लिए विवश करें (यह चरण पुनर्निर्मित छवि के आकार को कम करने में मदद करता है)।
  24. छवि सीमा को अनुकूलित करने के लिए ब्याज की रूपरेखा की मात्रा चालू करें। 40 माइक्रोन वोक्सेल आकार, हन प्रोजेक्शन फिल्टर, और गाऊसी वॉल्यूम फिल्टर (80 माइक्रोन) चुनें। उन्नत पर जाएं | छवि-आधारित गेटिंग और ट्रिगर विंडो और चरण को क्रमशः 0.5 और 0.6 पर समायोजित करें, कार्डियक गेटिंग के लिए 10 चरणों का चयन करें, और फिर वॉल्यूम पुनर्निर्माण बटन को धक्का दें।

Representative Results

उन शोधकर्ताओं के लिए जो सर्जन नहीं हैं, शरीर रचना विज्ञान से अपरिचित हैं, या रेडियोलॉजिक परिणामों की व्याख्या करने में असहज हैं, उचित प्रशिक्षण के साथ कर्मियों द्वारा उचित छवि विश्लेषण किया जाना चाहिए। माउस में ओएलटी की सफलता उपरोक्त प्रोटोकॉल में प्रदर्शित की गई है। इसके अलावा, अध्ययन मेट्रिक्स को बढ़ाने और प्रत्यारोपण की सफलता के लिए वास्तविक समय की प्रतिक्रिया प्रदान करने के साथ-साथ नेक्रोप्सी की आवश्यकता को समाप्त करने के लिए, सटीक और स्पष्ट चित्र प्रदान करने के लिए एक माइक्रोसीटी एंजियोग्राफी स्कैन का उपयोग किया जा सकता है। प्रतिनिधि छवियों इस पांडुलिपि (चित्रा 11) में शामिल हैं. इन विवो असफल एनास्टोमोसिस की प्रतिनिधि छवियां चित्र 12 में देखी जा सकती हैं।

यकृत शरीर रचना और वास्कुलचर से परिचित लोग आईवीसी के पेटेंट शिरापरक एनास्टोमोज देख सकते हैं। कुछ परिस्थितियों में, पोर्टल नस की कल्पना भी की जा सकती है, जिसे पोर्टल शिरा कफ के कारण इस मॉडल में आसानी से बनाया जाता है। खुले एनास्टोमोस को देखना ऑपरेशन की तकनीकी सफलता को इंगित करता है। इसके अतिरिक्त, इन छवियों का 3 डी पुनर्निर्माण शोधकर्ताओं को अतिरिक्त जानकारी और संवहनी शरीर रचना विज्ञान की अधिक विस्तृत छवि प्रदान कर सकता है। इस उपरोक्त मॉडल का उपयोग करते हुए, ओएलटी चूहों के समूह में मृत्यु दर ~ 40-45% है।

Figure 1
चित्र 1: ऑर्थोटोपिक यकृत प्रत्यारोपण का अवलोकन। (ए) चार अलग-अलग एनास्टोमोस को दर्शाती ग्राफिकल ड्राइंग: i) सुपरहेपेटिक IVC एनास्टोमोसिस, ii) इन्फ्राहेपेटिक IVC एनास्टोमोसिस, iii) पोर्टल शिरा एनास्टोमोसिस, iv) सामान्य पित्त नली एनास्टोमोसिस। प्रत्येक तीर जहां पोत या वाहिनी कट-सुप्रा-यकृत IVC (प्रोटोकॉल चरण 2.13), इन्फ्रा-यकृत IVC (प्रोटोकॉल चरण 2.11), पोर्टल शिरा (प्रोटोकॉल चरण 2.10), और आम पित्त नली (प्रोटोकॉल चरण 2.7) होना चाहिए, के लिए एक सापेक्ष स्थान इंगित करता है। (बी) एनास्टोमोस के विवो आरेख में । स्केल बार = 2 मिमी। संक्षिप्त: IVC = अवर वेना कावा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सर्जरी में इस्तेमाल सर्जिकल उपकरण। (ए) 45 डिग्री ठीक संदंश, (बीई) ठीक संदंश, (एफ) घुमावदार सुई धारक/संदंश, (जी) सीधे संदंश, (एच) संवहनी दबाना applier, (मैं) hemostat, (जे) सुई धारक, (कश्मीर) इलेक्ट्रो cautery डिवाइस, (एल) # 11 ब्लेड, (एम) उदर रिट्रेक्टर, (एन, ओ) माइक्रो कैंची, (पी) ठीक कैंची, (क्यू) सर्जिकल कैंची, (आर, एस) यासरगिल क्लैंप, (टी) बुलडॉग नस क्लैंप, (यू) माइक्रो-संवहनी क्लैंप। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पोर्टल नस कफ और पित्त नली स्टेंट। उपयोग करने से पहले स्टेंट और कफ की पूर्व विवो छवि। स्केल बार = 3.5 मिमी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: दाता ऑपरेशन के दौरान आम पित्त नली स्टेंटिंग। (ए) पित्त नली स्टेंट आम पित्त नली में डाला जा रहा है। (बी) पित्त नली स्टेंट पित्त नली के भीतर सुरक्षित। स्केल बार = 2 मिमी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: जिगर allograft की वापस मेज की तैयारी के दौरान पोर्टल शिरा कफ रखने. (ए) शिरापरक कफ के माध्यम से थ्रेडिंग पोर्टल नस। (बी) कफ के ऊपर एवर्टेड नस। स्केल बार = 2 मिमी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: प्राप्तकर्ता ऑपरेशन के दौरान पोर्टल शिरा एनास्टोमोसिस। (ए) प्राप्तकर्ता पोर्टल नस में नस कफ डालना। (बी) पोर्टल शिरा एनास्टोमोसिस सिवनी के साथ सुरक्षित। स्केल बार = 2 मिमी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: प्राप्तकर्ता ऑपरेशन के दौरान सुपरहेपेटिक आईवीसी एनास्टोमोसिस। (ए) एनास्टोमोसिस की पीछे की दीवार पूरी हो गई है। (बी) पूर्ण शिवसी एनास्टोमोसिस। स्केल बार = 2 मिमी। संक्षिप्ताक्षर: IVC = अवर वेना कावा; SHIVC = सुप्राहेपेटिक IVC। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: प्राप्तकर्ता ऑपरेशन के दौरान इन्फ्राहेपेटिक आईवीसी एनास्टोमोसिस। (ए) एनास्टोमोसिस की पीछे की दीवार पूरी हो गई है। (बी) पूर्ण IHIVC एनास्टोमोसिस। स्केल बार = 2 मिमी। संक्षिप्ताक्षर: IVC = अवर वेना कावा; IHIVC = इन्फ्राहेपेटिक IVC। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: प्राप्तकर्ता ऑपरेशन के दौरान आम पित्त नली एनास्टोमोसिस। (ए) प्राप्तकर्ता सामान्य पित्त नली के भीतर पित्त नली स्टेंट रखना। (बी) पित्त नली एनास्टोमोसिस को सुरक्षित करना। स्केल बार = 1 मिमी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्रा 10: माउस माइक्रोसीटी एंजियोग्राफी पशु तैयारी। (ए) माउस पूंछ नस इंजेक्शन इसके विपरीत प्रशासन के लिए. (बी) माउस microCT मशीन के माध्यम से पारित किया जा रहा है. संक्षिप्त: microCT = माइक्रोकंप्यूटेड टोमोग्राफी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 11
चित्रा 11: प्रतिनिधि छवियों allograft patency के microCT एंजियोग्राफी दिखा रहा है. (ए, बी) कंट्रास्ट को पूरे आईवीसी में देखा जा सकता है, जो सुपरहेपेटिक और इन्फ्राहेपेटिक एनास्टोमोस की धैर्य का प्रदर्शन करता है। (सी) पोर्टल-नस में विपरीत, फिर से धैर्य का प्रदर्शन। (डी) वाहिका का 3 डी पुनर्निर्माण। संक्षिप्ताक्षर: माइक्रोसीटी = माइक्रोकंप्यूटेड टोमोग्राफी; IVC = अवर वेना कावा; पीवी = पोर्टल शिरा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 12
चित्रा 12: प्रतिनिधि छवियों दिखा विवो anastomoses में विफल. (ए) नस के विरूपण के कारण असफल पोर्टल शिरा एनास्टोमोसिस जिसके परिणामस्वरूप रक्त प्रवाह की कमी होती है। (बी) अत्यधिक रक्तस्राव के कारण असफल सुप्राहेपेटिक आईवीसी एनास्टोमोसिस। स्केल बार = 2 मिमी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

कृन्तकों में ओएलटी को साहित्य 2,8 में अच्छी तरह से वर्णित किया गया है। इस तकनीकी रूप से मांग की प्रक्रिया को करने के लिए, अक्सर कई वर्षों की सूक्ष्म सर्जरी (या सामान्य रूप से सर्जरी) की आवश्यकता होती है क्योंकि इसमें शरीर रचना विज्ञान और तकनीकी क्षमता की एक मजबूत समझ शामिल होती है। इस मॉडल को विकसित करने में, हमें कई तकनीकी मुद्दों का सामना करना पड़ा जो सभी एनास्टोमोस के इर्द-गिर्द घूमते थे। विशेष रूप से पीवी एनास्टोमोसिस के साथ, एनास्टोमोसिस के लिए नस को स्थिर करना अक्सर मुश्किल होता है। हमने पाया है कि एक या दो टांके (सर्जन वरीयता) रखने से कफ प्लेसमेंट को सुविधाजनक बनाने में मदद मिलती है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अधिक रहने टांके रखने से सर्जिकल समय बढ़ जाता है।

इसके अतिरिक्त, शिवसी पेट की गुहा के भीतर गहरा है और पर्याप्त जोखिम देने के लिए एक क्लैंप लगाना मुश्किल है। हमने पाया है कि यदि माउस अपने संयम में संभव के रूप में आराम कर रहा है, कि नस के लचीलेपन के लिए जोड़ देगा. अंततः, अभ्यास के साथ उचित स्थान निर्धारित करने के लिए सर्जन पर निर्भर होगा। इसके अलावा, सीबीडी एनास्टोमोसिस के साथ, वाहिनी फिर से बहुत नाजुक है। वाहिनी को स्थिर करने के लिए स्टे टांके लगाना मुश्किल हो सकता है, और संभवतः, इसे धुंध के एक छोटे से टुकड़े पर रखने से इसके स्थिरीकरण में सहायता मिलेगी। अंत में, चूंकि सभी छोटे स्तनधारी संज्ञाहरण के समय के संबंध में विशिष्ट रूप से नाजुक होते हैं, इसलिए जितनी जल्दी हो सके सर्जरी करना महत्वपूर्ण है। आदर्श सर्जिकल समय इस प्रकार हैं: 1) दाता ऑपरेशन, 45-60 मिनट; 2) बैक टेबल तैयारी, 15 मिनट; 3) प्राप्तकर्ता ऑपरेशन, 60-80 मिनट। अभ्यास व्यर्थ आंदोलन को कम करने में मदद करेगा।

जैसे-जैसे पशु मॉडल आगे बढ़ते हैं, अध्ययन हस्तक्षेप की सफलता का मूल्यांकन करने की क्षमता भी उन्नत हुई है। MicroCT का उपयोग पहली बार 1990 के दशक के अंत मेंचूहों में वास्कुलचर पर अध्ययन करने के लिए किया गया था। कृन्तकों में सटीक और स्पष्ट माइक्रोसीटी एंजियोग्राफी अध्ययन करने के लिए कई चुनौतियां हैं। हालांकि, अधिकांश चुनौतियां इन स्तनधारियों के छोटे हृदय और श्वसन चक्रों से उत्पन्न होती हैं। यह गति कलाकृतियों के रूप में अच्छी तरह से उच्च फोटॉन fluence दर18 को सीमित करने के लिए कम जोखिम का उपयोग करके दूर किया जाता है. सामान्य तौर पर, हमने पाया कि कार्डियक गेटिंग का उपयोग, साथ ही श्वसन दर को कम करने के लिए आइसोफ्लुरेन सांद्रता के समायोजन ने सबसे स्पष्ट छवियों का उत्पादन किया। हमने यह भी पाया है कि विशिष्ट चरणों के लिए कृंतक-विशिष्ट विपरीत समय का उपयोग: यकृत धमनी चरण, पोर्टल शिरापरक चरण, और विलंबित चरण ने भी दृश्य19 में सुधार किया है। ExiTron नैनो 12000 कंट्रास्ट के उपयोग के कई फायदे हैं और यह समग्र छवि गुणवत्ता में सुधार कर सकता है। यह यकृत20 और रक्त21 में सबसे मजबूत विपरीत वृद्धि प्रदान करता है। एक और लाभ यह है कि इसके विपरीत अप करने के लिए जिगर में मौजूद है 120 प्रारंभिक इंजेक्शन के बाद घंटे, जो कम विपरीत दोहराया स्कैन की आवश्यकता होती है20 के बाद के रूप में संबद्ध जिगर विषाक्तता पर कटौती कर सकता है.

इसके अलावा, क्योंकि स्कैन isoflurane के साथ बेहोश माउस के साथ किया जाता है, विपरीत वृद्धि शरीर विज्ञान20 में इस परिवर्तन के साथ बदल नहीं है. इन इमेजिंग तकनीकों और एक्सिट्रॉन कंट्रास्ट को नियोजित करके, ओएलटी में सफल एनास्टोमोसेस का स्पष्ट मूल्यांकन संभव है। MicroCT एक विस्तारित अवधि में इन-विवो एलोग्राफ्ट के noninvasive मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल जानवरों की संख्या को कम करता है जिन्हें संवहनी एनास्टोमोस का मूल्यांकन करने के लिए बलिदान किया जाना चाहिए और कई हफ्तों में चिकित्सीय अध्ययन करने और वाहिका पर उनके प्रभाव का अवसर प्रदान करना चाहिए।

सीमाओं
यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जबकि ओएलटी मॉडल के कई संशोधन इसकी तकनीक को सही करने के लिए हुए हैं, माइक्रोसीटी का उपयोग करने वाले एनास्टोमोस का दृश्य अभी भी एक सतत प्रक्रिया है। इसके अलावा, माउस ओएलटी प्रत्यारोपण दवा में एक अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। हालांकि, यह एक व्यापक मॉडल नहीं है क्योंकि इन चूहों को पिछले 1 सप्ताह तक जीवित रखना मुश्किल है। अतिरिक्त प्रत्यारोपण मॉडल के रूप में अच्छी तरह से आगे preclinical प्रयोगों पुष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

निष्कर्ष
माइक्रोसीटी में प्रगति पिछले एक दशक में तेजी से हुई है, जो शोधकर्ताओं को पशु मॉडल और प्रत्यारोपण के क्षेत्र में अमूल्य नए उपकरण प्रदान करती है। भविष्य में, अधिक विस्तृत 3 डी इमेजिंग अनुसंधान और खोज में और अंतर्दृष्टि प्रदान करेगी।

Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

एसएमबी को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डायबिटीज एंड डाइजेस्टिव एंड किडनी डिजीज (एनआईडीडीके) अनुदान R01DK1234750 द्वारा समर्थित है। BAW को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान अनुदान R01HL143000 के माध्यम से समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#11 Blade Fisher Scientific 3120030
4-0 silk suture Surgical Specialties Corp. SP116
6-0 nylon suture AD Surgical S-N618R13
7-0 nylon suture AD Surgical S-N718SP13
8-0 nylon suture AD Surgical XXS-N807T6
10-0 nylon suture AD Surgical M-N510R19-B
20 G Angiocath Boundtree 602032D
30 G Needle Med Needles BD-305106
Baytril (enrofloxacin) Antibacterial Tablets Elanco NA
Bovie Chang-A-Tip High Temp Cauterizer USA Medical and Surgical Supplies BM-DEL1
Bulldog Vein Clamp 1 1/8 Ambler Surgical USA 18-181
C57BL/6J mice  Jackson Labs
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Store RS-5668
Dumont #5 - Fine Forceps Fine Science tools 11254-20
Dumont #5 Forceps Fine Science tools 11252-50
Dumont Medical #5/45 Forceps - Angled 45° Fine Science tools 11253-25
ExiTron nano 12000 Miltenyi Biotec 130 - 095 - 698 CT contrast agent 
Forceps Fine Science tools 11027-12
Halsted-Mosquito Hemostat Roboz Surgical RS-7112
heparin Fresnius Lab, Lake Zurich, IL C504701
histidine-trypotophan-ketoglutarate  University Pharmacy NA
Insulated Container YETI ROADIE 24 HARD COOLER https://www.yeti.com/coolers/hard-coolers/roadie/10022350000.html
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 66794-017-25
ketamine Hikma Pharmaceuticals PLC NDC 0413-9505-10
Mirco Serrefines Fine Science tools 18055-05
Mouse Rectal Temperature Probe WPI Inc NA
NEEDLE HOLDER/FORCEPS straight Micrins MI1540
PE10 Tubing  Fisher Scientific BD 427400
perfadex XVIVO Perfusion AB REF99450
PhysioSuite Kent Scientific PS-MSTAT-RT
Puralube Ophthalmic Ointment Dechra NA
saline PP Pharmaceuticals LLC NDC 63323-186-10
Scissors Fine Science tools 14090-11
Small Mouse Restraint – 1” inner diameter Pro Lab Corp MH-100
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System Kent scientific SS-MVG-Module
Surgical microscope Leica M500-N w/ OHS
U-CTHR MI Labs NA CT Scanner software
Vannas-Tubingen Spring Scissors Fine Science Tools 15008-08
xylazine Korn Pharmaceuticals Corp NDC 59399-110-20
Yasagil clamp Aesculap FT351T
Yasagil clamp Aesculap FT261T
Yasagil clamp applicator Aesculap FT484T

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References

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Zeng, Q., Gouchoe, D. A., Nabavinia, M., Lee, Y. G., Wang, X., Shaffer, T. A., Stacy, M. R., Peterson, B. R., Whitson, B. A., Breuer, C., Black, S. M. Successful Orthotopic Liver Transplantation in Mice Utilizing Microcomputed Tomography Angiography. J. Vis. Exp. (199), e65537, doi:10.3791/65537 (2023).

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