Summary
I denne protokollen diskuterer vi implementeringen av en modell for vellykket ortotopisk levertransplantasjon (OLT) hos mus. I tillegg diskuteres adjuvanser for å analysere allograftpatency etter vellykket OLT i en mus også, spesielt ved bruk av mikrocomputertomografi (microCT) skanner.
Abstract
Microcomputed tomography (microCT) angiografi er en uvurderlig ressurs for forskere. Nye fremskritt i denne teknologien har gjort det mulig å få bilder av høy kvalitet av mikrovaskulatur og er hi-fidelity-verktøy innen organtransplantasjon. I denne modellen av ortotopisk levertransplantasjon (OLT) hos mus, gir microCT muligheten til å evaluere allograft anastomose i sanntid og har den ekstra fordelen av ikke å måtte ofre studiedyr. Valget av kontrast, samt innstillinger for bildeoppkjøp, skaper et HD-bilde, noe som gir forskere uvurderlig informasjon. Dette muliggjør evaluering av de tekniske aspektene ved prosedyren, samt potensielt evaluering av ulike terapier over lengre tid. I denne protokollen beskriver vi en OLT-modell hos mus på en trinnvis måte og beskriver til slutt en microCT-protokoll som kan gi bilder av høy kvalitet, noe som hjelper forskere i grundig analyse av solid organtransplantasjon. Vi gir en trinnvis veiledning for levertransplantasjon hos mus, samt diskuterer kort en protokoll for evaluering av podens av transplantatet gjennom microCT-angiografi.
Introduction
Transplantasjon er den eneste effektive behandlingen for leversykdom i sluttstadiet. Nytten av levertransplantasjon er unektelig utmerket, med en median overlevelse på 11,6 år versus 3,1 år på venteliste1. Imidlertid er det betydelige begrensninger som begrenser den brede anvendelsen av levertransplantasjon, og inkluderer viktigst av alt, mangel på egnede donororganer av høy kvalitet. Utvidelse av donororganpoolen vil derfor kreve innovative strategier som gjør det mulig å bruke allotransplantater som i dag anses som uegnede, noe som øker sikkerhetsmarginen for transplantasjon. Derfor, for å forbedre tilgangen til levertransplantasjon, er det viktig å gjennomføre prekliniske studier hos små dyr.
Spesielt viktig for transplantasjonsforskningen er in vivo-modeller for transplantasjon. Ortotopisk levertransplantasjon fra mus (OLT) har eksistert i nesten 30 år2 og er avgjørende for å studere mange aspekter ved transplantasjon, inkludert karakterisering av immunresponser, iskemi-reperfusjonsskade, akutt avvisning, terapeutiske effekter av nye midler og langsiktig overlevelse 3,4,5,6,7. Bruken av mus for å studere transplantasjon er viktig, da det muliggjør bruk av transgene muselinjer for å studere virkningen av spesifikke molekylære veier på utfallet av transplantasjon. Etablerte protokoller for levertransplantasjon fra mus har blitt godt beskrevet tidligere 8,9.
Flere metoder for anastomoser finnes for supra og infra hepatisk inferior vena cava (IVC), portalvene (PV) og vanlig gallegang (CBD). De er vanligvis avhengige av enten håndanastomose eller en modifisert vaskulær mansjettteknikk som ligner på murine lungetransplantasjon 10,11,12. Et viktig skritt i den langsiktige studien og overlevelsen til mottakermusene, samt utviklingen av et vedvarende levertransplantasjonsprogram for mus, er evnen til å evaluere disse kritiske anastomosene. Imaging modaliteter for å evaluere leverallograft patency er ofte avhengig av ultralyd og datatomografi (CT) i klinisk setting13,14. CT har en klar fordel i forhold til ultralyd, da det kan gi utsikt over hele magen for å inkludere enhver anastomose, selv om det kan være spesielt vanskelig å oppnå disse synspunktene med ultralyd hos små dyr. Betydelig forskning og ressurser har blitt viet til å utvikle nøyaktig microCT med det formål å forbedre dyreforsøk og informasjonen vi kan samle fra disse modellene av skade og sykdom15,16. Her beskriver vi en protokoll for ortotopisk levertransplantasjon fra mus (figur 1) og beskriver kort en protokoll for microCT for å evaluere allograftpatency og persistabilitet av anastomoser.
Protocol
Mannlige C57BL/6J-mus (30 g kroppsvekt) ble plassert under patogenfrie forhold på Nationwide Children's Hospital Animal Facility. Alle prosedyrer ble humant utført i henhold til NIH og National Research Council's Guide for Humane Care and Use of Laboratory Animals og med godkjenning av Nationwide Children's Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC protokoll AR17-00045). Se materialfortegnelsen for detaljer knyttet til alle materialer, instrumenter og utstyr som brukes i denne protokollen.
1. Første oppsett for transplantasjonskirurgi
- Sett opp kirurgiske enheter.
- Sett opp kirurgiske overvåkingsenheter (dvs. hjertefrekvensovervåkingsenhet, pulsoks, modulært monitorsystem) og anestesimaskiner.
- Hvis tilgjengelig, slå på den kirurgiske oppvarmingstavlen til 42 °C.
- Sørg for at ventilasjons- og anestesimaskiner er slått på for å varme opp isofluran fordamperen. Fyll anestesibeholderen med 30 ml flytende isofluran og sørg for at ventilatormaskinen er koblet til oksygenet.
MERK: I denne protokollen intuberer vi ikke dyret; Bruk bare en nesekegle for oksygenering.
- Registrer kroppsvekten til mottakeren og donormusene.
- Slå på det kraftige kirurgiske mikroskopet og juster høyden og fokuset til kirurgens preferanser. Forsikre deg om at de gjenværende kirurgiske enhetene er slått på (dvs. elektrokauteriseringsenhet).
- Klargjøre og legge ut kirurgiske instrumenter, samt kirurgiske bånd av 10-0 nylon (figur 2).
MERK: Alle kirurgiske instrumenter ble autoklavert ved 121 °C i 30 minutter. I tillegg kan forskjellige konfigurasjoner av kirurgiske instrumenter være like effektive. - Forbered mansjettene for portvenen (PV) og vanlig gallegang (CBD) stenter (figur 3). Plasser angiokateteret, så vel som PE10, på en steril overflate under høyeffektsmikroskopet. Bruk et #11 kirurgisk blad, kutt angiokateteret for å danne en 1,5 mm lang mansjett med en flik ca. 0,75 mm på toppen av mansjettkroppen; kutt polyetylenrøret (PE10) til 2,5 mm lengde. Oppbevar mansjettene og stenten i sterilt saltvann til de er klare til bruk.
MERK: Denne transplantasjonsmodellen benytter et 20 G angiokateter for å lage mansjetter for PV-rekonstruksjon, samt et polyetylenrør 10 (PE10) for rekonstruksjon av CBD. Alle andre anastomoser er håndsydd. - Forbered løsninger. Forbered en heparininjeksjon som vil bli levert ved 100 U i 0,5 ml histidin-tryptofan-ketoglutarat (HTK) løsning. Oppbevar saltvann, heparin-saltvann, PBS og HTK konserveringsløsning på is.
2. Anskaffelse av donormus
- Indusere anestesi i donormusen ved å plassere den i et isofluran inhalasjonskammer. Forsikre deg om at isofluran er ca. 2,5 % med en oksygenstrøm på 2 ml/min. Vent 5 min for et kirurgisk anestesiplan å utvikle seg. For å sikre riktig nivå av anestesi, tå klemme musen for å fremkalle en reaksjon; Mangel på reaksjon indikerer at riktig nivå av anestesi er oppfylt.
- Barber magen på musen ved hjelp av elektroniske klippere og plasser musen i liggende stilling på oppvarmingsbrettet. Rengjør magen med povidon-jod, deretter 70% etanol. Plasser oftalmisk salve under musens øyne for å forhindre tørrhet.
- Plasser musen under det kraftige mikroskopet og hold musen under anestesi ved hjelp av en isofluran inhalasjon på 2% konsentrasjon med en oksygenstrøm på 2 ml / min.
- Utfør en midtlinje laparotomi med en saks (kirurgpreferanse) fra xiphoidprosessen til kjønnssymfysen. Deretter utfører du et ekstra tverrsnitt for å skape et "krysslignende" mønster som er dårligere enn ribbeina. Bruk mygghemostatiske tang, trekk xiphoidprosessen for å oppnå tilstrekkelig eksponering av bukinnholdet.
MERK: Tang kan sikres avhengig av kirurgens preferanse. - Eviscerate tarmene og legg dem på venstre side av bukhulen i en våt gasbind svamp. Mobiliser leveren ved å ta ned alle ligamentøse vedlegg.
- Eksponer riktig leverarterie (pHA). Skjelettiser fartøyet ved hjelp av kurvetang og liger det med 10-0 nylonsutur.
- Dissekere hele lengden av CBD ved hjelp av en kombinasjon av skarp og stump disseksjon. Utfør en duktotomi (stor nok til CBD-stenten) så nær den øvre grensen til bukspyttkjertelen som mulig for å gi tilstrekkelig lengde for fremtidig bruk (~ 1 cm fra leverens nedre grense). Sett gallekanalstenten inn i CBD med fine tang og fest den med en 10-0 nylonsutur. Liger det distale aspektet av CBD ved hjelp av en 10-0 nylonsutur (figur 4).
- Trekk høyre leverlapp mot xiphoid ved hjelp av en våt gasbindsvamp og eksponer IVC. Mobiliser infra-hepatisk IVC (IHIVC) bort fra retroperitoneum og cauterize høyre binyrevene ved hjelp av en håndholdt cautery enhet (se Tabell over materialer).
- Dissekere høyre nyrearterie og vene og ligate med henholdsvis 7-0 og 10-0 nylon. Klipp høyre nyrevene og arterie og gjenværende ligamentøse vedlegg. Til slutt, fjern høyre nyre.
MERK: Dette gjøres for å få bedre eksponering når du endelig kutter IHIVC. - Injiser 0,5 ml kald HTK med 100 U heparinoppløsning gjennom PV med en 30 G nål. Vent 1 min til heparinet fordeler seg systematisk. Klipp portalvenen bare bedre enn miltvenen og overlegen-mesenterisk vene.
- Injiser langsomt kald HTK-konserveringsløsning med heparin i IHIVC med en 30 G nål for å perfusere donorleveren. Slutt å injisere oppløsningen når væsken som kommer fra PV er klar. Etter at injeksjonen er fullført, plasser en mikroklemme på IHIVC bare bedre enn høyre nyrevene og kutt bare dårligere enn klemmen. Når dette trinnet er fullført, slå av ventilatoren og stopp isofluran da dyret nettopp har blitt avlivet.
- Skjær CBD distalt til stenten som tidligere ble plassert i trinn 2.7. I tillegg identifiserer du den cystiske kanalen, og ligerer kanalen med en 10-0 nylonsutur. Deretter griper du kuppelen på galleblæren med et par tang, og dissekerer fri fra galleblæren fossa ved hjelp av en kombinasjon av skarp og stump disseksjon. Når galleblæren er tilstrekkelig mobilisert, ved hjelp av en fjærsaks, fullfør cholecystektomi ved å kutte den cystiske kanalen over den tidligere plasserte suturen.
- Trekk leveren inferiort for å eksponere supra-hepatisk IVC (SHIVC). Kutt SHIVC med spesiell oppmerksomhet for å gi en tilstrekkelig lengde for anastomosen i mottakerdyret.
- Dissekere gratis ytterligere ligamentøse vedlegg til leveren og lever donorleveren ex vivo og legg orgelet i en beholder med kaldt saltvann.
3. Bakbord forberedelse av leverallograft
- Legg is i en isolert beholder, og legg en petriskål på issengen. Fyll petriskålen med kaldt saltvann. Legg leveren allograft i parabolen slik at den viscerale overflaten blir eksponert.
- Plasser PV gjennom den tidligere valgte mansjetten, og sett venen slik at den indre endoteloverflaten blir eksponert. Fest mansjetten med 10-0 nylonsutur. Sørg for at suturen ligger innenfor sporene på mansjetten for best resultat (figur 5).
- Juster leverallograft for å eksponere SHIVC og plasser to 8-0 Nylonoppholdsuturer ved henholdsvis 3' og 9-tiden orientering for eventuell anastomose hos mottakerdyret. Juster leverallograft igjen for å eksponere IHIVC og plasser to 8-0 Nylonoppholdsuturer ved henholdsvis 3' og 9-tiden orientering for eventuell anastomose hos mottakerdyret.
4. Mottaker drift
MERK: Siden dette er en steril operasjon, bruk hansker og riktig personlig verneutstyr og administrer antibiotika. Administrer 0,1 mg/kg buprenorfin subkutant som preoperativ analgesi ved inngrepet.
- Eksponer pHA som ved donoroperasjonen; Bruk bare en midtlinje laparotomi i stedet for det tidligere beskrevne abdominale snittet.
- Mobiliser leveren og kutt alle ligamentøse vedlegg. I tillegg ligerer venstre freniske og paraøsofageale kar med 10-0 nylonsutur.
- Trekk leveren dårligere og disseker, frigjør SHIVC fra retroperitoneum. Deretter trekker du leveren overlegent og dissekerer fri IHIVC fra retroperitoneum. Cauterize små bro vener og lumbale vener etter behov ved hjelp av samme teknikk som tidligere beskrevet.
- Cauterize høyre binyrevenen med håndholdt cautery og utsette leveren hilum. Ligate pHA med 10-0 nylon sutur. Deretter dissekerer du CBD fri for PV og ligerer CBD med 7-0 sutur nær bifurkasjonen av CBD for å gi en tilstrekkelig lengde for CBD-anastomosen.
- Bruk en mikroklemme for å klemme infra-hepatisk IVC og midlertidig ligere PV med en 7-0 sutur. Start den an-hepatiske fasen. Stopp inhalasjonen av isofluran.
MERK: Etter klemming av portalvenen og IVC, er levervenøs retur helt blokkert i leverstadiet. Det inhalerte bedøvelsesmiddelet isofluran metaboliseres av leveren; Dermed stoppes innåndingen øyeblikkelig, da akkumulering kan føre til kardiopulmonal kollaps. - Gjennom den innfødte leverens PV, injiser 0,5 ml heparin-saltoppløsning med en 30 G nål for å skylle orgelet.
- Plasser mikrovaskulære klemmer på SHIVC og IHIVC så proksimalt og distalt som mulig for å la en tilstrekkelig lengde for anastomose. Klipp den opprinnelige SHIVC, IHIVC, PV (nær den tidligere plasserte suturen) og eventuelle gjenværende ligamentøse vedlegg til mottakerens opprinnelige lever og lever den opprinnelige leveren ex vivo.
MERK: IHIVC-klemmen skal være over høyre nyrevene. - Plasser donor lever allograft inne i bukhulen og trekke hilum av donor allograft å avsløre PV. Skyll både donor og innfødt PV med 0,5 ml heparin saltvann ved hjelp av en 30 G nål for å avlufte karene for å unngå luftemboli. Sett deretter den tidligere laget mansjetten av donor PV inn i lumen av mottakerens lever-PV og om nødvendig, plasser oppholdsuturer for å hjelpe med anastomosen (8-0 sutur). Sikre anastomosen med 7-0 sutur (figur 6).
- Roter brettet 180°. Utfør en håndsydd anastomose med 10-0 nylonsutur med giveren og innfødt SHIVC. Etter å ha fullført bakre vegganastomose, skyll med 0,5 ml heparinsaltvann for å lufte ut for å unngå luftemboli. Fullstendig anastomose av øvre vegg (figur 7).
- Fjern ligeringssuturen av PV først; Fjern deretter vaskulære klemmer fra SHIVC for å starte reperfusjon. Avslutt den an-hepatiske fasen og start inhalasjonen med isofluran igjen. Utfør håndsyanastomose med 10-0 nylonsutur, på samme måte som for SHIVC-anastomosen, for å rekonstruere IHIVC. Etter å ha fullført rekonstruksjonen, fjern mikroklemmen fra den opprinnelige IHIVC og donoren for å reperfusere (figur 8).
- Utfør CBD-anastomosen ved å lage en duktotomi på mottakerens CBD nær den tidligere plasserte suturen. Sett stenten i donor CBD inn i mottakerens CBD-lumen og fest anastomosen med 10-0 sutur (figur 9).
- Skyll bukhulen med 1 ml saltvann; Kontroller hemostase og cauterize eventuelle gjenværende blødende fartøy. Lukk magesnittet i to lag med 6-0 sutur.
- Plasser dyret i en varm kuvøse (42 °C) for restitusjon, og ikke forlat dyret uten tilsyn før det har gjenvunnet bevissthet og tilstrekkelig aktivitet. Administrer 0,1 mg/kg buprenorfin subkutant etter kirurgi og fortsett administreringen hver 8. til 12. time i 48 timer etter operasjonen. I tillegg administreres carprofen (0,2 ml oppløst i 400 ml vann) gjennom mottakerdyrets vannflaske i opptil 7 dager etter operasjonen. Observer mottakerdyret i 4-5 timer, og når det er fullstendig gjenopprettet, returner det til boligstedet, da det nå er trygt å være sammen med andre dyr.
MERK: Smertestillende medisiner og antibiotika kan administreres i henhold til lokale anbefalinger fra dyreetiske komiteer.
5. Mus microCT angiografi avbildning
- Etter å ha observert musen i det forhåndsbestemte studieintervallet, klargjør musen til å evaluere allograftens patency ved hjelp av microCT-angiografi.
- Sørg for at ventilasjons- og anestesimaskinene er slått på for å varme opp isofluran fordamperen. Fyll anestesibeholderen med 30 ml flytende isofluran, og sørg for at ventilatormaskinen er koblet til oksygenet. Slå på microCT-skanneren og sørg for at all programvare fungerer som den skal.
- Start anskaffelsesprogramvaren på microCT-skannersystemet.
- På skjermen til microCT-enheten klikker du Initialiser system og velger CT-skannemodus.
- Ta ut sengen; Fest musesengen og lås den.
- Skru på varmebrettet til 42 °C for oppvåkningsburet.
- Fyll en 1 ml sprøyte med 100 μL CT-kontrastmiddel. Fest en 30-gauge kanyle for fremtidig intravenøs administrering av kontrast. Forsikre deg om at det ikke er luftbobler i sprøyten.
- Plasser en mus i halen vene fastholdelse system. Når musen er helt inne i fastholdelsessystemet, lukker du systemets port, lar halen falle vertikalt og tørker den forsiktig med en alkoholløsning (70% etanol).
MERK: Suksess i kanylering av halevenen kan økes ved å varme dyrets hale ved å holde den i en hansket hånd i flere minutter. - Ta tak i halen mot det distale aspektet, og plasser to fingre (indeks og midten) rundt halen proksimalt til det planlagte injeksjonsstedet. Plasser det distale aspektet av halen (under injeksjonsstedet) mellom tommelen og ringfingeren.
- Med begge sett med fingre, trykk litt og sett nålen inn i venen med en grunne dybde, slik at sprøyten og nålen er parallelle med halen. Mens du frigjør trykket fra pekefingeren ved den proksimale halen, administrerer CT-kontrastmiddelet intravenøst. Unngå aspirasjon med sprøyten, da dette kan føre til at venen kollapser.
MERK: Det skal ikke kjennes motstand under injeksjonen hvis nålen er riktig plassert i venen. Hvis det er motstand, fjern nålen og sett den inn igjen over det opprinnelige injeksjonsstedet. Hvis kanylering av venen mislykkes selv etter to forsøk, bytt nålen. - Etter å ha injisert kontrasten og fjernet nålen, påfør forsiktig kompresjon på injeksjonsstedet ved hjelp av sterilt gasbind for å stoppe blødningen.
- Overfør musen til inhalasjonskammeret med isofluran og sett konsentrasjonen til 2,5 % med en oksygenstrøm på 2 ml/min og vent 3-4 minutter. Når et anestesiplan er etablert, overfør musen raskt til microCT-skannersengen og legg den i mageleie på skannerbordet (figur 10).
- Dekk dyrets øyne med riktig mengde oftalmisk salve. Plasser nesekjeglen på riktig måte over dyret og sørg for at luft og isofluran strømmer ordentlig gjennom nesekjeglen. Bruk de samme anestesiparametrene som beskrevet tidligere (trinn 5.12). Smør og sett inn en rektal temperatursonde for kontinuerlig å overvåke dyrets kroppstemperatur under avbildning.
- Plasser åndedrettsvernet i kontakt med musen.
- Bruk tape til å feste en EKG-pute til venstre, høyre for- og venstre baklemmer. Bruk ultralydgel for å forbedre signalet mellom EKG-puten og huden.
- Kontroller EKG og respirasjonssignal på dataprogramvaren for å sikre at riktige QRS-komplekser blir sett på skjermen. Dette gjør du ved å merke av for Logikkledning i kategorien Kildeoppsett og velge leddet som gir den klareste EKG-kurven.
MERK: Logiske ledninger tilsvarer de tre EKG-putene som er koblet til høyre, venstre bryst og underben. Hvert ledning representerer en EKG-kurve. - Sett Gain for riktig signalhøyde, vanligvis 4 eller 8 er bra. Velg dobbel gating. Under fanen Skjermoppsett justerer du skjerminnstillingene for en tydelig signalvisning: Merk av i boksene ved siden av EKG og RESP og sett hver til 500. Under kategorien Utløseroppsett bekrefter du at det er merket av for Kanal A, Kanal B og DualTrig .
- Forsikre deg om at følgende parametere også er angitt: Terskel: når signalet faller under denne verdien; angi verdien til 2 500; Hysterese: sørg for at signalet krysser hysterese for å lage et programvareutløserpunkt der en ny utløsende syklus starter; sett verdien til 300; Forsinkelse: vent før utløseren sendes; sett verdien til 100; Inhibit: ingen signal kan genereres i denne perioden, sett verdien til 200.
- Sørg for at terskelen for EKG er under hystereseverdien og over toppen av sT-segmentet på displayet.
- Flytt dyret inn i skanneren og trykk på Oppdater bilde. Skaff deg et røntgenspeiderbilde av dyret for å velge riktig synsfelt og anatomisk skanningsdekning for det påfølgende microCT-bildet.
- Utfør mikroCT angiografi bildeopptak ved hjelp av følgende parametere: Forstørrelser: Ultrafokus, Skannevinkel: Full (360) skanning, Energi: Enkel, Skannemodus: Innfelt, Innstilling: Standard (full 360° rotasjon, standardinnstillinger for røntgenrør på 0,33 mA og 55 kV, 0,750 ° grader per trinn, 1 projeksjon per trinn, 1 x 1 binning og 40 ms eksponeringstid; dobbel gating betyr hjerte- og respiratorisk gating) (figur 11).
- Etter ferdigstillelse av skanningen, overfør dyret til et forvarmet gjenopprettingsbur. Når dyret er fullstendig gjenopprettet, overfør det tilbake til sitt primære bur.
- Rekonstruer microCT-bilder ved hjelp av systemprogramvare. Etter å ha lastet opp bildet, sett de blå stolpene slik at det strekker seg over det anatomiske interesseområdet; Forhåndsvis et stykke for å gjøre volumet mindre og så begrenset til musen som mulig (dette trinnet bidrar til å redusere størrelsen på det rekonstruerte bildet).
- Slå på volum av interessedisposisjon for å optimalisere bildegrensen. Velg 40 μm voxelstørrelse, Hann-projeksjonsfilter og Gaussisk volumfilter (80 μm). Gå til Avansert | Bildebasert gating og juster utløservinduene og fasen til henholdsvis 0,5 og 0,6, velg 10 faser for hjertegating, og trykk deretter på volumrekonstruksjonsknappen .
Representative Results
For de forskerne som ikke er kirurger, ukjent med anatomi eller ubehagelig å tolke radiologiske resultater, bør riktig bildeanalyse gjøres av personell med riktig opplæring. Suksessen til en OLT i en mus er demonstrert i protokollen ovenfor. Videre, for å forbedre studiemålinger og gi tilbakemelding i sanntid for suksessen til en transplantasjon, samt eliminere behovet for nekropsy, kan en microCT angiografiskanning brukes til å gi nøyaktige og klare bilder. Representative bilder er inkludert i dette manuskriptet (figur 11). Representative bilder av in vivo mislykket anastomose finnes i figur 12.
De som er kjent med leveranatomi og vaskulatur kan se patente venøse anastomoser av IVC. Under noen omstendigheter kan portalvenen også visualiseres, noe som gjøres enkelt i denne modellen på grunn av portalvene mansjetten. Visningen av åpne anastomoser indikerer operasjonens tekniske suksess. I tillegg kan 3D-rekonstruksjon av disse bildene gi ytterligere informasjon til forskere og et mer detaljert bilde av vaskulær anatomi. Ved hjelp av denne modellen ovenfor er dødeligheten i OLT-muskohorten ~ 40-45%.
Figur 1 Oversikt over ortotopisk levertransplantasjon. (A) Grafisk tegning som viser de fire ulike anastomosene: i) suprahepatisk IVC-anastomose, ii) infrahepatisk IVC-anastomose, iii) portalveneanastomose, iv) vanlig gallegangsanastomose. Hver pil indikerer en relativ plassering for hvor fartøyet eller kanalen skal kuttes-supra-hepatisk IVC (protokolltrinn 2.13), infra-hepatisk IVC (protokolltrinn 2.11), portalvene (protokolltrinn 2.10) og felles gallegang (protokolltrinn 2.7). (B) In vivo diagram av anastomoser. Skala bar = 2 mm. Forkortelse: IVC = dårligere vena cava. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Kirurgiske verktøy brukt i kirurgi. (A) 45° fintang, (B-E) fine tang, (F) buet nåleholder/tang, (G) rett tang, (H) vaskulær klemmepåføring, (I) hemostat, (J) nåleholder, (K) elektrokauteriseringsanordning, (L) #11-blad, (M) abdominalretractor, (N,O) mikrosaks, (P) fin saks, (Q) kirurgisk saks, (R,S) Yasargil klemmer, (T) bulldog veneklemme, (U) mikro-vaskulær klemme. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Portalvenemansjett og gallegangsstent. Ex vivo bilde av stenter og mansjetter før bruk. Skala bar = 3,5 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Vanlig gallegangstenting under donoroperasjon. (A) Gallegangstent settes inn i den vanlige gallegangen. (B) Gallegangstent sikret i gallegangen. Skala bar = 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5 Plassering av portvenemansjett under bakbordets klargjøring av leverallograft. (A) Gjenging av portalvenen gjennom venemansjetten. (B) Everted vene over mansjetten. Skala bar = 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6 Portalveneanastomose under resipientoperasjon. (A) Sette inn venemansjett i mottakerens portalvene. (B) Portalveneanastomose sikret med sutur. Skala bar = 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7 Suprahepatisk IVC-anastomose under mottakeroperasjon. (A) Anastomosens bakre vegg er komplett. (B) Fullført SHIVC-anastomose. Skala bar = 2 mm. Forkortelser: IVC = dårligere vena cava; SHIVC = suprahepatisk IVC. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Infrahepatisk IVC-anastomose under mottakeroperasjon. (A) Anastomosens bakre vegg er komplett. (B) Fullført IHIVC-anastomose. Skala bar = 2 mm. Forkortelser: IVC = dårligere vena cava; IHIVC = infrahepatisk IVC. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9 Vanlig gallegangsanastomose under mottakeroperasjon. (A) Plassering av gallegangstent i mottakerens felles gallegang. (B) Sikring av gallegangsanastomose. Skala bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: MikroCT angiografi i mus Preparat av dyr. (A) Mus hale vene injeksjon for å administrere kontrast. (B) Mus som føres gjennom microCT-maskinen. Forkortelse: microCT = microcomputed tomography. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11 Representative bilder som viser mikroCT-angiografi av allograftpatency. (A,B) Kontrast kan ses gjennom hele IVC, noe som viser patency av suprahepatiske og infrahepatiske anastomoser. (C) Kontrast i portalvenen, som igjen demonstrerer patency. (D) 3D-rekonstruksjon av vaskulaturen. Forkortelser: microCT = mikrocomputertomografi; IVC = dårligere vena cava; PV = portal vene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 12: Representative bilder som viser mislykkede in vivo anastomoser. (A) Mislykket portalveneanastomose på grunn av forvrengning av venen som resulterer i mangel på blodstrøm. (B) Mislykket suprahepatisk IVC-anastomose på grunn av overdreven blødning. Skala bar = 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
OLT hos gnagere er godt beskrevet i litteraturen 2,8. For å utføre denne teknisk krevende prosedyren, er det ofte nødvendig med flere år med mikrokirurgi (eller kirurgi generelt), da dette innebærer en robust forståelse av anatomi og teknisk evne. I utviklingen av denne modellen møtte vi flere tekniske problemer som alle dreide seg om anastomosene. Spesielt ved PV-anastomosen er det ofte vanskelig å stabilisere venen for anastomose. Vi har funnet ut at plassering av en eller to suturer (kirurgpreferanse) hjelper med å lette mansjettplasseringer. Det skal bemerkes at plassering av flere oppholdssuturer øker kirurgisk tid.
I tillegg er SHIVC dypt inne i bukhulen og er vanskelig å plassere en klemme på for å gi tilstrekkelig eksponering. Vi har funnet ut at hvis musen er avslappet som mulig i sin tilbakeholdenhet, vil det legge til fleksibiliteten i venen. Til syvende og sist vil det være opp til kirurgen å bestemme riktig plassering med praksis. Videre, med CBD-anastomose, er kanalen igjen veldig delikat. Det kan være vanskelig å plassere oppholdssuturer for å stabilisere kanalen, og muligens vil plassering på et lite stykke gasbind hjelpe til med stabiliseringen. Til slutt, da alle små pattedyr er unikt delikate med hensyn til anestesitid, er det viktig å utføre operasjonen så raskt som mulig. Ideelle kirurgiske tider er som følger: 1) donoroperasjon, 45-60 min; 2) forberedelse av bakbordet, 15 min; 3) Mottakerdrift, 60-80 min. Øvelse vil bidra til å redusere bortkastet bevegelse.
Etter hvert som dyremodeller utvikler seg, har evnen til å evaluere suksessen til studieintervensjoner også avansert. MicroCT ble først brukt til å gjennomføre studier på vaskulatur hos rotter på slutten av 1990-tallet17. Det er mange utfordringer med å utføre nøyaktige og klare mikroCT angiografistudier hos gnagere. Imidlertid stammer de fleste utfordringene fra de korte hjerte- og respiratoriske syklusene til disse pattedyrene. Dette overvinnes ved å bruke korte eksponeringer for å begrense bevegelsesartefakter samt høyere fotonfluenshastigheter18. Generelt fant vi at bruk av hjertegating, samt justering av isofluran for å redusere respirasjonsfrekvensen, ga de klareste bildene. Vi har også funnet at bruk av gnagerspesifikk kontrasttiming for spesifikke faser: leverarteriefase, portalvenøs fase og forsinket fase også har forbedret visualisering19. Bruken av ExiTron nano 12000 kontrast har flere fordeler og kan forbedre den generelle bildekvaliteten. Det gir den sterkeste kontrastforsterkningen i leveren20 og blodet21. En annen fordel er at kontrasten er tilstede i leveren i opptil 120 timer etter den første injeksjonen, noe som kan redusere den tilknyttede levertoksisiteten, da mindre kontrast er nødvendig hvis gjentatte skanningerer nødvendige.
Videre, fordi skanninger utføres med musen bedøvet med isofluran endres ikke kontrastforsterkningen med denne endringen i fysiologi20. Ved å bruke disse avbildningsteknikkene og ExiTron-kontrasten, er en klar evaluering av vellykkede anastomoser i OLT mulig. MicroCT muliggjør ikke-invasiv evaluering av in vivo allotransplantater over en lengre periode. Denne protokollen reduserer antall dyr som må ofres for å evaluere vaskulære anastomoser og gir muligheten til å studere terapeutika over flere uker og deres effekt på vaskulaturen.
Begrensninger
Det skal bemerkes at mens flere revisjoner av OLT-modellen har skjedd for å perfeksjonere teknikken, er visualiseringen av anastomosene ved hjelp av microCT fortsatt en pågående prosess. Videre tilbyr mus OLT et unikt innblikk i transplantasjonsmedisin. Det er imidlertid ikke en omfattende modell, da det er vanskelig å holde disse musene i live etter 1 uke. Ytterligere transplantasjonsmodeller bør også brukes for ytterligere å underbygge prekliniske eksperimenter.
Konklusjoner
Fremskritt innen microCT har raskt utviklet seg det siste tiåret, og gir forskere uvurderlige nye verktøy innen dyremodeller og transplantasjon. I fremtiden vil mer detaljert 3D-avbildning gi ytterligere innsikt i forskning og oppdagelse.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
SMB støttes av National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) tilskudd R01DK1234750. BAW støttes gjennom National Institutes of Health National Heart Lung and Blood Institute grant R01HL143000.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 Blade | Fisher Scientific | 3120030 | |
| 4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| 6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
| 7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
| 8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
| 10-0 nylon suture | AD Surgical | M-N510R19-B | |
| 20 G Angiocath | Boundtree | 602032D | |
| 30 G Needle | Med Needles | BD-305106 | |
| Baytril (enrofloxacin) Antibacterial Tablets | Elanco | NA | |
| Bovie Chang-A-Tip High Temp Cauterizer | USA Medical and Surgical Supplies | BM-DEL1 | |
| Bulldog Vein Clamp 1 1/8 | Ambler Surgical USA | 18-181 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | ||
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Store | RS-5668 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science tools | 11254-20 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11252-50 | |
| Dumont Medical #5/45 Forceps - Angled 45° | Fine Science tools | 11253-25 | |
| ExiTron nano 12000 | Miltenyi Biotec | 130 - 095 - 698 | CT contrast agent |
| Forceps | Fine Science tools | 11027-12 | |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Roboz Surgical | RS-7112 | |
| heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| histidine-trypotophan-ketoglutarate | University Pharmacy | NA | |
| Insulated Container | YETI | ROADIE 24 HARD COOLER | https://www.yeti.com/coolers/hard-coolers/roadie/10022350000.html |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
| Mirco Serrefines | Fine Science tools | 18055-05 | |
| Mouse Rectal Temperature Probe | WPI Inc | NA | |
| NEEDLE HOLDER/FORCEPS straight | Micrins | MI1540 | |
| PE10 Tubing | Fisher Scientific | BD 427400 | |
| perfadex | XVIVO Perfusion AB | REF99450 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | NA | |
| saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
| Scissors | Fine Science tools | 14090-11 | |
| Small Mouse Restraint – 1” inner diameter | Pro Lab Corp | MH-100 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent scientific | SS-MVG-Module | |
| Surgical microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| U-CTHR | MI Labs | NA | CT Scanner software |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
| Yasagil clamp | Aesculap | FT351T | |
| Yasagil clamp | Aesculap | FT261T | |
| Yasagil clamp applicator | Aesculap | FT484T |
References
- Rana, A., et al. Survival benefit of solid-organ transplant in the United States. JAMA Surgery. 150 (3), 252-259 (2015).
- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E.
- Nakano, R., et al. Dendritic cell-mediated regulation of liver ischemia-reperfusion injury and liver transplant rejection. Frontiers in Immunology. 12, 705465 (2021).
- Nakamura, K., et al. Antibiotic pretreatment alleviates liver transplant damage in mice and humans. Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3420-3434 (2019).
- Lee, S. K., et al. Patient-derived Avatar mouse model to predict the liver immune homeostasis of long-term stable liver transplant patients. Frontiers in Immunology. 13, 817006 (2022).
- Li, S. P., et al. Characterization and proteomic analyses of proinflammatory cytokines in a mouse model of liver transplant rejection. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 5188584 (2022).
- Huang, D. R., Wu, Z. J., Zhu, Y. Modified arterialization of orthotopic liver transplantation in a mouse model. Hepatobiliary Pancreatic Disease International. 9 (3), 264-268 (2010).
- Yokota, S., et al. Orthotopic mouse liver transplantation to study liver biology and allograft tolerance. Nature Protocols. 11 (7), 1163-1174 (2016).
- Chen, X. C., et al. Reduced complications after arterial reconnection in a rat model of orthotopic liver transplantation. Journal of Visual Experiments. (165), e60628 (2020).
- Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visual Experiments. (96), e52309 (2015).
- Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
- Lee, Y. G., et al. A rat lung transplantation model of warm ischemia/reperfusion injury: optimizations to improve outcomes. Journal of Visual Experiments. (176), e62445 (2021).
- Di Martino, M., et al. Imaging follow-up after liver transplantation. British Journal of Radiology. 89 (1064), 20151025 (2016).
- Vardar, B. U., Dupuis, C. S., Goldstein, A. J., Vardar, Z., Kim, Y. H. Ultrasonographic evaluation of patients with abnormal liver function tests in the emergency department. Ultrasonography. 41 (2), 243-262 (2022).
- Marx, J. Imaging. Animal models: live and in color. Science. 302 (5652), 1880-1882 (2003).
- Maehara, N. Experimental microcomputed tomography study of the 3D microangioarchitecture of tumors. European Radiology. 13 (7), 1559-1565 (2003).
- Garcia-Sanz, A., Rodriguez-Barbero, A., Bentley, M. D., Ritman, E. L., Romero, J. C. Three-dimensional microcomputed tomography of renal vasculature in rats. Hypertension. 31, 440-444 (1998).
- Badea, C., Hedlund, L. W., Johnson, G. A. Micro-CT with respiratory and cardiac gating. Medical Physics. 31 (12), 3324-3329 (2004).
- Ma, G., et al. Assessment of hemodynamics in a rat model of liver cirrhosis with precancerous lesions using multislice spiral CT perfusion imaging. BioMed Research International. 2013, 813174 (2013).
- Mannheim, J. G., et al. Comparison of small animal CT contrast agents. Contrast Media and Molecular Imaging. 11 (4), 272-284 (2016).
- Rothe, J. H., et al. Time course of contrast enhancement by micro-CT with dedicated contrast agents in normal mice and mice with hepatocellular carcinoma: comparison of one iodinated and two nanoparticle-based agents. Academic Radiology. 22 (2), 169-178 (2015).
