Summary
בפרוטוקול זה נדון ביישום מודל של השתלת כבד אורתוטופית מוצלחת (OLT) בעכברים. בנוסף, נדונים גם אדג'ובנטים לניתוח נוסף של פטנטיות אלוגרפט לאחר OLT מוצלח בעכבר, במיוחד באמצעות סריקות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (microCT).
Abstract
טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (microCT) אנגיוגרפיה היא משאב רב ערך לחוקרים. התקדמות חדשה בטכנולוגיה זו אפשרה לקבל תמונות באיכות גבוהה של מיקרו-כלי דם והם כלים באיכות גבוהה בתחום השתלות האיברים. במודל זה של השתלת כבד אורתוטופית (OLT) בעכברים, microCT מספק את ההזדמנות להעריך אנסטומוזה allograft בזמן אמת ויש לו את היתרון הנוסף של לא צריך להקריב חיות מחקר. הבחירה בניגודיות, כמו גם הגדרות רכישת תמונה, ליצור תמונה בחדות גבוהה, אשר נותן לחוקרים מידע רב ערך. זה מאפשר הערכה של ההיבטים הטכניים של ההליך, כמו גם הערכה פוטנציאלית של טיפולים שונים על פני משך זמן ממושך. בפרוטוקול זה, אנו מפרטים מודל OLT בעכברים בצורה מדורגת ולבסוף מתארים פרוטוקול microCT שיכול לתת תמונות באיכות גבוהה, המסייעות לחוקרים בניתוח מעמיק של השתלת איברים מוצקים. אנו מספקים מדריך שלב אחר שלב להשתלת כבד בעכבר, וכן דנים בקצרה בפרוטוקול להערכת הפטנט של השתל באמצעות אנגיוגרפיה microCT.
Introduction
השתלה היא הטיפול היעיל היחיד למחלת כבד סופנית. אין ספק שהיתרון של השתלת כבד הוא מצוין, עם הישרדות חציונית של 11.6 שנים לעומת 3.1 שנים ברשימת ההמתנה1. עם זאת, ישנם אילוצים משמעותיים, המגבילים את היישום הרחב של השתלת כבד, וכוללים והכי חשוב, מחסור באיברים מתאימים ואיכותיים לתורם. הרחבת מאגר האיברים התורמים תחייב, אם כן, אסטרטגיות חדשניות המאפשרות שימוש באלושתלים הנחשבים כיום לא מתאימים לשתלים, ובכך יגדילו את מרווח הבטיחות להשתלה. לכן, כדי לשפר את הגישה להשתלת כבד, חובה לבצע מחקרים פרה-קליניים בבעלי חיים קטנים.
חשובים במיוחד למחקר ההשתלות הם מודלים in vivo של השתלות. השתלת כבד אורתוטופית בעכבר (OLT) קיימת כבר כמעט 30 שנה2 והיא חיונית לחקר היבטים רבים של השתלה, כולל אפיון תגובות חיסוניות, פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה, דחייה חריפה, השפעות טיפוליות של חומרים חדשים והישרדות לטווח ארוך 3,4,5,6,7 . השימוש בעכברים לחקר השתלות הוא חיוני מכיוון שהוא מאפשר שימוש בקווי עכברים טרנסגניים כדי לחקור את ההשפעה של מסלולים מולקולריים ספציפיים על תוצאות ההשתלה. פרוטוקולים מבוססים של השתלת כבד עכבר תוארו היטב בעבר 8,9.
קיימות שיטות מרובות של אנסטומוזות עבור הווריד הנבוב התחתון בכבד (IVC), הווריד הפורטלי (PV) וצינור המרה המשותף (CBD). הם בדרך כלל מסתמכים על אנסטומוזה של היד או על טכניקת שרוול כלי דם שונה הדומה להשתלת ריאות מורין 10,11,12. צעד חשוב במחקר ארוך טווח ובהישרדות של העכברים המושתלים, כמו גם בפיתוח תוכנית מתמשכת להשתלת כבד עכבר, הוא היכולת להעריך את האנסטומוזות הקריטיות הללו. שיטות הדמיה להערכת פטנט אלוגרפט בכבד מסתמכות לעתים קרובות על אולטרסאונד וטומוגרפיה ממוחשבת (CT) במסגרת הקלינית13,14. CT יש יתרון מובהק על אולטרסאונד כפי שהוא יכול להציע תצוגות של הבטן כולה לכלול כל אנסטומוזיס, אם כי השגת תצוגות אלה עם אולטרסאונד יכול להיות קשה במיוחד בבעלי חיים קטנים. מחקר ומשאבים משמעותיים הוקדשו לפיתוח microCT מדויק לצורך שיפור מחקרים בבעלי חיים והמידע שאנו יכולים לאסוף ממודלים אלה של פציעה ומחלות15,16. כאן אנו מתארים פרוטוקול להשתלת כבד אורתוטופית של עכבר (איור 1) ומתארים בקצרה פרוטוקול עבור microCT כדי להעריך את הפטנט של allograft ואת העמידות של אנסטומוזות.
Protocol
עכברי C57BL/6J זכרים (30 גרם משקל גוף) שוכנו בתנאים נטולי פתוגנים במתקן בעלי החיים הארצי של בית החולים לילדים. כל ההליכים בוצעו באופן הומני על פי מדריך ה-NIH והמועצה הלאומית למחקר לטיפול הומני ושימוש בחיות מעבדה ובאישור הוועדה הארצית לטיפול ושימוש מוסדי בבעלי חיים בבית החולים לילדים (פרוטוקול IACUC AR17-00045). עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, המכשירים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הכנה ראשונית לניתוח השתלה
- הגדר מכשירים כירורגיים.
- הגדר מכשירי ניטור כירורגיים (כלומר, מכשיר ניטור דופק, דופק-אוקס, מערכת מודולרית) ומכשירי הרדמה.
- אם זמין, הפעל את לוח החימום הכירורגי ל 42 ° C.
- ודא שמכונות האוורור וההרדמה מופעלות כדי לחמם את מאייד האיזופלורן. מלאו את מאגר ההרדמה ב-30 מ"ל איזופלורן נוזלי וודאו שמכונת ההנשמה מחוברת לחמצן.
הערה: בפרוטוקול זה, איננו מבצעים אינטובציה לחיה; השתמש רק חרוט האף עבור חמצון.
- רשום את משקל הגוף של המקבל והעכברים התורמים.
- הפעל את המיקרוסקופ הכירורגי בעוצמה גבוהה והתאם את הגובה והמיקוד להעדפות המנתח. ודא כי שאר מכשירי הניתוח מופעלים (כלומר, מכשיר electrocautery).
- הכינו ופרשו כלי ניתוח, כמו גם קשרים כירורגיים של ניילון 10-0 (איור 2).
הערה: כל כלי הניתוח היו autoclaved ב 121 ° C במשך 30 דקות. בנוסף, תצורות שונות של כלי ניתוח יכולות להיות יעילות באותה מידה. - הכינו את האזיקים עבור הווריד הפורטלי (PV) והסטנטים של צינור המרה המשותף (CBD) (איור 3). הניחו את האנגיוקטטר, כמו גם את PE10, על משטח סטרילי מתחת למיקרוסקופ בעל עוצמה גבוהה. באמצעות להב כירורגי #11, חתך את האנגיוקטטר ליצירת שרוול באורך 1.5 מ"מ עם לשונית בערך 0.75 מ"מ בחלק העליון של גוף השרוול; חתכו את צינור הפוליאתילן (PE10) לאורך של 2.5 מ"מ. אחסנו את האזיקים והסטנט במי מלח סטריליים עד שיהיו מוכנים לשימוש.
הערה: מודל השתלה זה משתמש באנגיוקטטר 20 G לייצור אזיקים לשחזור PV, כמו גם צינור פוליאתילן 10 (PE10) לשחזור CBD. כל שאר האנסטומוזות נתפרות ביד. - הכינו פתרונות. הכינו זריקת הפרין שתינתן ב 100 U ב 0.5 מ"ל של תמיסת היסטידין-טריפטופן-קטוגלוטרט (HTK). אחסנו תמיסת שימור מלוחים, הפרין-מלוחים, PBS ו-HTK על קרח.
2. רכש עכבר תורם
- יש לגרום להרדמה בעכבר התורם על ידי הכנסתו לתא אינהלציה איזופלוראני. יש לוודא כי ריכוז האיזופלורן הוא כ-2.5% עם זרימת חמצן של 2 מ"ל/דקה. יש להמתין 5 דקות עד להתפתחות מישור כירורגי של הרדמה. כדי להבטיח את רמת ההרדמה הנכונה, צבוט את העכבר כדי לעורר תגובה; חוסר תגובה מצביע על כך שרמת ההרדמה התקינה התקיימה.
- לגלח את הבטן של העכבר באמצעות קוצץ אלקטרוני ולהניח את העכבר במצב שכיבה על לוח החימום. נקה את הבטן עם povidone-יוד, ולאחר מכן 70% אתנול. יש להניח משחת עיניים מתחת לעיני העכברים כדי למנוע יובש.
- הניחו את העכבר מתחת למיקרוסקופ רב עוצמה ותחזקו את העכבר תחת הרדמה באמצעות שאיפת איזופלורן בריכוז של 2% עם זרימת חמצן של 2 מ"ל/דקה.
- בצע laparotomy קו האמצע עם זוג מספריים (העדפת מנתח) מתהליך xiphoid לסימפיזת הערווה. לאחר מכן, בצע חתך רוחבי נוסף כדי ליצור תבנית 'דמוית צלב' נחותה מהצלעות. באמצעות מלקחיים המוסטטיים יתושים, לסגת את תהליך xiphoid כדי להשיג חשיפה נאותה של תוכן הבטן.
הערה: ניתן לאבטח מלקחיים בהתאם להעדפת המנתח. - הוציאו את המעיים והניחו אותם בצד שמאל של חלל הבטן בספוג גזה רטוב. גייסו את הכבד על ידי הורדת כל החיבורים הרצועתיים.
- חשוף את עורק הכבד הנכון (pHA). שלד את הכלי באמצעות מלקחיים עקומה ולקשור אותו עם תפר ניילון 10-0.
- נתחו את כל אורכו של ה-CBD באמצעות שילוב של דיסקציה חדה ובוטה. בצע ductotomy (גדול מספיק עבור סטנט CBD) קרוב ככל האפשר לגבול העליון של הלבלב כדי לתת אורך מספיק לשימוש עתידי (~ 1 ס"מ מהגבול התחתון של הכבד). הכנס את סטנט צינור המרה לתוך CBD עם מלקחיים עדינים ולאבטח אותו עם תפר ניילון 10-0. קשרו את ההיבט הדיסטלי של CBD באמצעות תפר ניילון 10-0 (איור 4).
- משכו את אונת הכבד הימנית לכיוון הקסיפואיד באמצעות ספוג גזה רטוב וחשפו את ה- IVC. יש להרחיק את ה-IVC האינפרא-כבד (IHIVC) מהרטרופריטונאום ולצרוב את וריד יותרת הכליה הימני באמצעות מכשיר צריבה ידני (ראה טבלת חומרים).
- לנתח את עורק הכליה הימני ואת הווריד וליגט עם 7-0 ו 10-0 ניילון, בהתאמה. חותכים את וריד הכליה והעורק הימני ואת החיבורים הרצועות הנותרים. לבסוף, להסיר את הכליה הימנית.
הערה: זה נעשה כדי לקבל חשיפה טובה יותר כאשר סוף סוף לחתוך את IHIVC. - הזריקו את 0.5 מ"ל של HTK קר עם תמיסת הפרין 100 U דרך PV עם מחט 30 גרם. המתן דקה אחת עד שההפרין יתפזר באופן שיטתי. חתכו את וריד הפורטל בדיוק עדיף על וריד הטחול ווריד מזנטרי מעולה.
- הזריקו באיטיות תמיסת שימור HTK קרה עם הפרין ב-IHIVC עם מחט של 30 גרם כדי לחורר את הכבד התורם. הפסיקו להזריק את התמיסה ברגע שהנוזל שמגיע מה-PV צלול. לאחר השלמת ההזרקה, הניחו מהדק מיקרו על IHIVC בדיוק עדיף על וריד הכליה הימני וחתכו רק בנחיתות מהמהדק. לאחר השלמת שלב זה, כבה את מכונת ההנשמה והפסיק את האיזופלורן מכיוון שהחיה זה עתה הומתה זה עתה.
- חתכו את ה-CBD באופן דיסטלי לסטנט שהונח בעבר בשלב 2.7. בנוסף, יש לזהות את הצינור הציסטי ולקשור את הצינור בתפר ניילון 10-0. לאחר מכן, אחזו בכיפת כיס המרה בעזרת זוג מלקחיים, ונתחו ללא כיס המרה באמצעות שילוב של דיסקציה חדה ובוטה. לאחר כיס המרה הוא מגויס כראוי, באמצעות זוג מספריים קפיץ, להשלים את cholecystectomy על ידי חיתוך צינור ציסטי מעל התפר שהונח בעבר.
- יש לסגת מהכבד בצורה נחותה כדי לחשוף את ה-IVC העל-כבד (SHIVC). חתכו את SHIVC תוך מתן תשומת לב מיוחדת כדי לתת אורך מספיק עבור אנסטומוזה בחיה המקבלת.
- מנתחים חיבורים רצועתיים נוספים לכבד ומעבירים את הכבד התורם ex-vivo ומניחים את האיבר במיכל עם מי מלח קרים.
3. הכנת שולחן אחורי של allograft הכבד
- מניחים קרח במיכל מבודד, ומניחים צלחת פטרי על מצע הקרח. ממלאים את צלחת הפטרי במי מלח קרים. מניחים את allograft הכבד בצלחת כך פני השטח הקרביים חשוף.
- הניחו את ה-PV דרך השרוול שנבחר קודם לכן, וסובבו את הווריד כך שמשטח האנדותל הפנימי ייחשף. הדקו את השרוול בתפר ניילון 10-0. ודא שהתפר נמצא בתוך החריצים של השרוול לקבלת התוצאות הטובות ביותר (איור 5).
- התאימו את אלוגרפט הכבד כך שיחשוף את ה-SHIVC והניחו שניים 8-0 ניילון-שהייה - תפרים בכיוון 3' ו 9', בהתאמה, עבור אנסטומוזה בסופו של דבר בחיה המקבלת. כוונן שוב את שתל הכבד כדי לחשוף את IHIVC ומקם שניים 8-0 ניילון-שהייה - תפרים בכיוון 3' ו 9', בהתאמה, עבור אנסטומוזה בסופו של דבר בחיה המקבלת.
4. פעולת הנמען
הערה: מכיוון שמדובר בניתוח סטרילי, יש להשתמש בכפפות ובציוד מגן אישי מתאים ולתת אנטיביוטיקה. לנהל 0.1 מ"ג / ק"ג Buprenorphine תת עורית כמו שיכוך כאבים לפני הניתוח בזמן הניתוח.
- לחשוף את ה- pHA כמו בניתוח התורם; יש להשתמש רק בלפרוטומיה בקו האמצע במקום בחתך הבטן שתואר קודם לכן.
- גייסו את הכבד וחתכו את כל החיבורים הרצועתיים. בנוסף, לקשור את כלי הדם הפרניים והפאראו-וושטיים השמאליים בתפר ניילון 10-0.
- משכו את הכבד בצורה נחותה ונתחו את ה-SHIVC מהרטרופריטונאום. לאחר מכן, למשוך את הכבד מעולה לנתח לשחרר את IHIVC מן retroperitoneum. צרוב ורידים מגשרים קטנים וורידים מותניים לפי הצורך באותה טכניקה שתוארה קודם לכן.
- לצרוב את וריד יותרת הכליה הימני עם צריבה ידנית ולחשוף את הילום הכבד. קשרו את ה- pHA בתפר ניילון 10-0. לאחר מכן, לנתח את CBD ללא PV ו ligate CBD עם תפר 7-0 קרוב bifurcation של CBD לתת אורך מספיק עבור אנסטומוזה CBD.
- השתמש במהדק מיקרו כדי להדק IVC אינפרא כבד ולקשור זמנית את ה- PV בתפר 7-0. התחל את השלב הכבד. יש להפסיק את שאיפת האיזופלורן.
הערה: לאחר הידוק וריד הפורטל ו- IVC, החזרה הוורידית בכבד חסומה לחלוטין בשלב ההכבד. איזופלורן ההרדמה בשאיפה הוא metabolized על ידי הכבד; לכן השאיפה שלה נעצרת לרגע כמו הצטברות יכול להוביל לקריסת לב ריאה. - דרך PV של הכבד המקומי, להזריק 0.5 מ"ל של הפרין-מלוחים עם מחט 30 גרם כדי לשטוף את האיבר.
- הניחו מהדקים מיקרו-וסקולריים על SHIVC ו-IHIVC בצורה קרובה ורחוקה ככל האפשר כדי להשאיר אורך מתאים לאנסטומוזה. חתכו את SHIVC, IHIVC, PV המקורי (קרוב לתפר שהונח קודם לכן), ואת כל החיבורים הרצועתיים הנותרים לכבד הטבעי של המקבל והעבירו את הכבד המקורי ex vivo.
הערה: מהדק IHIVC צריך להיות מעל וריד הכליה הימני. - הניחו את אלוגרפט הכבד התורם בתוך חלל הבטן ומשכו את ההילום של אלוגרפט התורם כדי לחשוף את PV. שטפו הן את התורם והן את PV המקומי עם 0.5 מ"ל של מי מלח הפרין באמצעות מחט 30 G כדי להסיר את האוויר של כלי הדם כדי למנוע תסחיף אוויר. לאחר מכן, הכנס את השרוול שנעשה בעבר של PV תורם לתוך לומן של PV הכבד המקבל ואם יש צורך, מקום להישאר תפרים כדי לעזור עם אנסטומוזה (תפר 8-0). אבטחו את האנסטומוזה באמצעות תפר 7-0 (איור 6).
- סובב את הלוח ב-180°. בצע אנסטומוזה תפורה ביד עם תפר ניילון 10-0 עם התורם ו- SHIVC המקומי. לאחר השלמת אנסטומוזה של הקיר האחורי, יש לשטוף עם 0.5 מ"ל של מי מלח הפרין כדי להוריד את האוויר כדי למנוע תסחיף אוויר. אנסטומוזה מלאה של הקיר העליון (איור 7).
- הסר תחילה את תפר הקשירה של PV; לאחר מכן, להסיר את מלחציים כלי הדם מ SHIVC כדי להתחיל reperfusion. סיים את השלב הכבד והפעל מחדש את שאיפת איזופלורן. בצע אנסטומוזה בתפירה ידנית עם תפר ניילון 10-0, באותו אופן כמו באנסטומוזה SHIVC, כדי לשחזר IHIVC. לאחר השלמת השחזור, הסירו את מהדק המיקרו מ-IHIVC היליד והתורם כדי לבצע רפרפוזיה (איור 8).
- בצע את אנסטומוזה CBD על ידי יצירת ductotomy על CBD המקבל ליד התפר שהונח בעבר. הכנס את הסטנט ל- CBD התורם לתוך לומן CBD המקבל ואבטח את האנסטומוזה עם תפר 10-0 (איור 9).
- להשקות את חלל הבטן עם 1 מ"ל של מלוחים; בדוק hemostasis לצרוב את כל כלי הדימום שנותרו. סגור את החתך הבטני בשתי שכבות באמצעות תפר 6-0.
- הניחו את בעל החיים באינקובטור חם (42 מעלות צלזיוס) להתאוששות ואל תשאירו את בעל החיים ללא השגחה עד שיחזור להכרה ולפעילות מספקת. יש לתת 0.1 מ"ג/ק"ג בופרנורפין תת עורית לאחר הניתוח ולהמשיך את מתן התרופה כל 8 עד 12 שעות במשך 48 שעות לאחר הניתוח. בנוסף, יש לתת קרפרופן (0.2 מ"ל מומס ב-400 מ"ל מים) דרך בקבוק המים של בעל החיים המקבל עד 7 ימים לאחר הניתוח. התבוננו בבעל החיים המקבל במשך 4-5 שעות, ולאחר שהוא התאושש לחלוטין, החזירו אותו למקום המגורים מכיוון שכעת בטוח להיות עם בעלי חיים אחרים.
הערה: ניתן לתת תרופות נגד כאבים ואנטיביוטיקה בהתאם להמלצות ועדת האתיקה המקומית של בעלי חיים.
5. הדמיית אנגיוגרפיה microCT עכבר
- לאחר התבוננות בעכבר עבור מרווח המחקר שנקבע מראש, להכין את העכבר כדי להעריך את הפטנט של allograft באמצעות אנגיוגרפיה microCT.
- ודא שמכונות האוורור וההרדמה מופעלות כדי לחמם את מאייד האיזופלורן. מלאו את מיכל ההרדמה ב-30 מ"ל איזופלורן נוזלי, וודאו שמכונת ההנשמה מחוברת לחמצן. הפעל את סורק ה- microCT וודא שכל התוכנות פועלות כראוי.
- הפעל את תוכנת הרכישה במערכת סורק microCT.
- בצג של יחידת microCT, לחץ על אתחול מערכת ובחר מצב סריקת CT.
- להוציא את המיטה; חבר את מיטת העכבר ונעל אותה.
- הפעל את לוח החימום ל 42 מעלות צלזיוס עבור כלוב ההתאוששות.
- מלא מזרק 1 מ"ל עם 100 μL של סוכן ניגוד CT. חבר מחט של 30 מד למתן עתידי של ניגוד תוך ורידי. ודא שאין בועות אוויר במזרק.
- הניחו עכבר במערכת ריסון ורידי הזנב. ברגע שהעכבר נמצא לחלוטין בתוך מערכת הריסון, סגרו את שער המערכת, אפשרו לזנב לצנוח אנכית ונגבו אותו בזהירות בתמיסת אלכוהול (70% אתנול).
הערה: ניתן להגביר את ההצלחה בקנולציה של וריד הזנב על ידי חימום זנב החיה על ידי החזקתו ביד כפפה למשך מספר דקות. - אחזו בזנב לכיוון האספקט הדיסטלי, והניחו שתי אצבעות (מורה ואמצע) סביב הזנב פרוקסימלי למקום ההזרקה המתוכנן. הניחו את האספקט הדיסטלי של הזנב (מתחת לאתר ההזרקה) בין האגודל לאצבע הטבעת.
- עם שתי קבוצות האצבעות, להפעיל לחץ מעט ולהכניס את המחט לתוך הווריד באמצעות עומק רדוד, להבטיח כי מזרק ומחט מקבילים לזנב. תוך שחרור הלחץ של האצבע המורה על הזנב הפרוקסימלי, תוך ורידי לנהל את סוכן ניגוד CT. הימנע שאיפה עם מזרק כמו זה יכול לגרום הווריד להתמוטט.
הערה: אין להרגיש התנגדות במהלך ההזרקה אם המחט ממוקמת כראוי בווריד. אם יש התנגדות, הסר את המחט והכנס אותה מחדש מעל אתר ההזרקה המקורי. אם קנולציה של הווריד נכשלת גם לאחר שני ניסיונות, להחליף את המחט. - לאחר הזרקה מוצלחת של הניגוד והסרת המחט, החל דחיסה עדינה על אתר ההזרקה באמצעות גזה סטרילית כדי לעצור דימום.
- מעבירים את העכבר לתא האינהלציה איזופלורן ומגדירים את הריכוז ל-2.5% עם זרימת חמצן של 2 מ"ל/דקה וממתינים 3-4 דקות. לאחר שנוצר מישור של הרדמה, העבירו במהירות את העכבר למיטת סורק ה-microCT והניחו אותו במצב נוטה על שולחן הסורק (איור 10).
- לכסות את העיניים של החיה עם כמות נכונה של משחה אופתלמית. הניחו את חרוט האף כראוי מעל בעל החיים וודאו שהאוויר והאיזופלורן זורמים כראוי דרך חרוט האף. השתמש באותם פרמטרים של הרדמה שתוארו קודם לכן (שלב 5.12). שימון והכנסת בדיקת טמפרטורה רקטלית כדי לפקח ברציפות על טמפרטורת הגוף של בעל החיים במהלך ההדמיה.
- הניחו מכונת הנשמה במגע עם העכבר.
- השתמש בסרט כדי לחבר כרית אק"ג לגפיים השמאליות, הימניות קדימה והשמאליות האחוריות. השתמש בג'ל אולטרסאונד כדי לשפר את האות בין כרית האק"ג לבין העור.
- בדוק את הא.ק.ג. ואת אות הנשימה בתוכנת המחשב כדי להבטיח מתחמי QRS נאותים נראים על הצג. לשם כך, סמן את הפניה לוגית בכרטיסיה הגדרת מקור ובחר את ההפניה המציעה את עקומת האק"ג הברורה ביותר.
הערה: מוליכי ההיגיון תואמים לשלושת רפידות האק"ג המחוברות לחזה הימני, השמאלי והרגל התחתונה. כל מוליך מייצג עקומת אק"ג. - הגדר רווח לגובה אות תקין, בדרך כלל 4 או 8 זה טוב. בחר גידור כפול. תחת הכרטיסיה הגדרת תצוגה , התאם את הגדרות התצוגה לקבלת תצוגת אות ברורה: סמן את התיבות לצד אק"ג ו - RESP והגדר כל אחת מהן ל- 500. תחת לשונית הגדרת טריגר , ודאו שערוצים A, ערוץ B ו-DualTrig מסומנים.
- ודא שהוגדרו גם הפרמטרים הבאים: סף: כאשר האות יורד מתחת לערך זה; הגדר את הערך ל- 2,500; היסטרזיס: ודא שהאות חוצה את ההיסטרזה כדי ליצור נקודת טריגר תוכנה שבה מתחיל מחזור הפעלה חדש; הגדר את הערך ל - 300; עיכוב: המתן לפני שההדק נשלח; הגדר את הערך ל - 100; עיכוב: לא ניתן ליצור אות במהלך תקופה זו, הגדר את הערך ל - 200.
- ודא שהסף עבור אק"ג הוא מתחת לערך ההיסטרזה ומעל השיא של קטע sT במסך התצוגה.
- קדם את בעל החיים לתוך הסורק ולחץ על עדכן תמונה. רכוש תמונת רנטגן של החיה כדי לבחור את שדה הראייה המתאים ואת כיסוי הסריקה האנטומית עבור תמונת microCT הבאה.
- בצע רכישת תמונה של אנגיוגרפיה microCT באמצעות הפרמטרים הבאים: הגדלות: מיקוד אולטרה, זווית סריקה: סריקה מלאה (360), אנרגיה: יחיד, מצב סריקה: גייטד, הגדרה: ברירת מחדל (סיבוב מלא של 360°, הגדרות ברירת מחדל של צינור רנטגן של 0.33 mA ו- 55 kV, 0.750° מעלות לכל צעד, הקרנה אחת לכל צעד, 1 x 1 binning וזמן חשיפה של 40 אלפיות השנייה; gating כפול פירושו גידור לב ונשימה) (איור 11).
- לאחר השלמת הסריקה, העבירו את בעל החיים לכלוב התאוששות שחומם מראש. לאחר שבעל החיים התאושש לחלוטין, העבירו אותו בחזרה לכלוב הראשי שלו.
- שחזור תמונות microCT באמצעות תוכנת מערכת. לאחר העלאת התמונה, הגדר את הפסים הכחולים כך שהיא תתאים לאזור העניין האנטומי; תצוגה מקדימה של פרוסה כדי להקטין את עוצמת הקול ולהגביל את העכבר ככל האפשר (שלב זה מסייע להקטין את גודל התמונה המשוחזרת).
- הפעילו את קו המתאר של עוצמת הקול כדי למטב את גבול התמונה. בחר גודל ווקסל של 40 מיקרומטר, מסנן הקרנה Hann ומסנן נפח גאוסיאנית (80 מיקרומטר). עבור אל מתקדם | Gating מבוסס תמונה וכוונן את חלונות ההדק והפאזה ל- 0.5 ו- 0.6, בהתאמה, בחר 10 שלבים לכריתת לב ולאחר מכן לחץ על לחצן שחזור עוצמת הקול.
Representative Results
עבור אותם חוקרים שאינם מנתחים, שאינם בקיאים באנטומיה, או לא מרגישים בנוח לפענח תוצאות רדיולוגיות, ניתוח תמונה נכון צריך להיעשות על ידי אנשים בעלי הכשרה מתאימה. ההצלחה של OLT בעכבר מודגמת בפרוטוקול לעיל. יתר על כן, כדי לשפר את מדדי המחקר ולספק משוב בזמן אמת להצלחת ההשתלה, כמו גם לבטל את הצורך בנקרופסיה, ניתן להשתמש בסריקת אנגיוגרפיה microCT כדי לספק תמונות מדויקות וברורות. תמונות מייצגות כלולות בכתב יד זה (איור 11). תמונות מייצגות של אנסטומוזיס כושל in vivo ניתן לראות באיור 12.
מי שמכיר את האנטומיה של הכבד ואת כלי הדם יכול לראות אנסטומוזות ורידי פטנט של IVC. בנסיבות מסוימות, ניתן לדמיין גם את וריד הפורטל, אשר נעשה בקלות במודל זה בשל שרוול הווריד הפורטלי. הצפייה באנסטומוזות פתוחות מצביעה על ההצלחה הטכנית של המבצע. בנוסף, שחזור תלת-ממדי של תמונות אלה יכול לספק מידע נוסף לחוקרים ותמונה מפורטת יותר של האנטומיה של כלי הדם. באמצעות מודל זה לעיל, התמותה בקבוצת עכברי OLT היא ~ 40-45%.
איור 1: סקירה כללית של השתלת כבד אורתוטופית. (A) ציור גרפי המתאר את ארבע האנסטומוזות השונות: i) אנסטומוזיס IVC על-הפטי, ii) אנסטומוזה IVC אינפרא-הכבדית, iii) אנסטומוזה של וריד פורטלי, iv) אנסטומוזה משותפת של צינור המרה. כל חץ מציין מיקום יחסי למקום שבו יש לחתוך את כלי הדם או הצינור IVC על-כבד (שלב פרוטוקול 2.13), IVC אינפרא-כבד (שלב פרוטוקול 2.11), וריד פורטלי (שלב פרוטוקול 2.10) וצינור מרה משותף (שלב פרוטוקול 2.7). (B) דיאגרמת In vivo של אנסטומוזות. סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. קיצור: IVC = נבוב ורידי נחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: כלים כירורגיים המשמשים בניתוח. (A) 45° מלקחיים עדינים, (B-E) מלקחיים עדינים, (F) מחזיק מחט מעוקל/מלקחיים, (G) מלקחיים ישרים, (H) מהדק כלי דם, (I) המוסטט, (J) מחזיק מחט, (K) מכשיר אלקטרו-צריבה, (L) #11 להב, (M) משחזר בטן, (N,O) מיקרו-מספריים, (P) מספריים עדינים, (Q) מספריים כירורגיים, (R,S) מלחציים Yasargil, (T) מהדק ורידים בולדוג, (U) מהדק מיקרו-וסקולרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: שרוול וריד פורטלי וסטנט צינור מרה. תמונת Ex vivo של סטנטים וחפתים לפני השימוש. סרגל קנה מידה = 3.5 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: סטנט נפוץ בצינור המרה במהלך ניתוח תורם. (A) סטנט צינור המרה המוחדר לצינור המרה המשותף. (B) סטנט צינור המרה המאובטח בתוך צינור המרה. סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הנחת שרוול הווריד הפורטלי במהלך הכנת השולחן האחורי של אלוגרפט הכבד. (A) החדרת וריד פורטלי דרך השרוול הוורידי. (B) וריד מעוות מעל השרוול. סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: אנסטומוזה של ורידים פורטליים במהלך ניתוח מושתל. (A) החדרת שרוול ורידים לווריד פורטל הנמען. (B) אנסטומוזה של ורידים פורטליים מאובטחת בתפר. סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: אנסטומוזה IVC על-כבדית במהלך ניתוח מושתל. (A) הקיר האחורי של האנסטומוזה הושלם. (B) אנסטומוזה SHIVC הושלמה. סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. קיצורים: IVC = ורידי נבוב נחות; SHIVC = IVC suprahepatic. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: אנסטומוזה IVC אינפרא-כבדית במהלך ניתוח מושתל. (A) הקיר האחורי של האנסטומוזה הושלם. (B) אנסטומוזה IHIVC הושלמה. סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. קיצורים: IVC = ורידי נבוב נחות; IHIVC = IVC אינפרא-הפטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: אנסטומוזה נפוצה של צינור המרה במהלך ניתוח מושתל. (A) הצבת סטנט של צינור המרה בתוך צינור המרה המשותף של הנמען. (B) אבטחת אנסטומוזה של צינור המרה. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10: אנגיוגרפיה של עכבר microCT הכנת בעלי חיים. (A) הזרקת וריד זנב עכבר למתן חומר ניגוד. (B) עכבר המועבר דרך מכשיר microCT. קיצור: microCT = טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 11: תמונות מייצגות המציגות אנגיוגרפיה של microCT של פטנטיות אלוגרפט. (A,B) ניתן לראות ניגודיות בכל ה- IVC, המדגימה פטנט של האנסטומוזות העל-כבדיות והאינפרא-הפטיות. (C) ניגודיות בווריד השער, שוב הדגמת פטנט. (D) שחזור תלת-ממדי של כלי הדם. קיצורים: microCT = טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת; IVC = נבוב ורידי נחות; PV = וריד פורטל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 12: תמונות מייצגות המציגות אנסטומוזות in vivo כושלות. (A) אנסטומוזה של וריד פורטלי נכשלה עקב עיוות של הווריד וכתוצאה מכך חוסר זרימת דם. (B) אנסטומוזה IVC על-כבדית נכשלה עקב דימום יתר. סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
OLT במכרסמים תואר היטב בספרות 2,8. כדי לבצע הליך תובעני מבחינה טכנית, נדרשות לעתים קרובות מספר שנים של מיקרו-כירורגיה (או ניתוח בכלל) מכיוון שהדבר כרוך בהבנה חזקה של אנטומיה ויכולת טכנית. בפיתוח מודל זה, התמודדנו עם מספר בעיות טכניות שסובבות כולן סביב האנסטומוזות. במיוחד עם אנסטומוזה PV, זה לעתים קרובות קשה לייצב את הווריד עבור anastomosis. מצאנו כי הצבת תפר אחד או שניים (העדפת מנתח) מסייעת להקל על מיקום השרוולים. יש לציין כי הצבת יותר תפרי שהייה מגדילה את זמן הניתוח.
בנוסף, ה-SHIVC נמצא עמוק בתוך חלל הבטן וקשה לשים עליו מהדק כדי לתת חשיפה נאותה. מצאנו שאם העכבר רגוע ככל האפשר באיפוק שלו, זה יוסיף לגמישות של הווריד. בסופו של דבר, זה יהיה תלוי במנתח לקבוע את המיקום הנכון עם תרגול. יתר על כן, עם אנסטומוזה CBD, הצינור הוא שוב עדין מאוד. זה יכול להיות קשה למקם להישאר תפרים כדי לייצב את הצינור, ואולי, הנחתו על פיסת גזה קטנה תסייע בייצובו. לבסוף, מכיוון שכל היונקים הקטנים עדינים במיוחד ביחס לזמן ההרדמה, חשוב לבצע את הניתוח במהירות האפשרית. זמני ניתוח אידיאליים הם כדלקמן: 1) ניתוח תורם, 45-60 דקות; 2) הכנת שולחן אחורי, 15 דקות; 3) פעולת הנמען, 60-80 דקות. תרגול יעזור בהפחתת תנועה מבוזבזת.
ככל שהמודלים של בעלי חיים מתקדמים, היכולת להעריך את ההצלחה של התערבויות מחקר התקדמה גם היא. MicroCT שימש לראשונה לביצוע מחקרים על כלי דם בחולדות בסוף שנות התשעים17. ישנם אתגרים רבים לביצוע מחקרי אנגיוגרפיה מדויקים וברורים של microCT במכרסמים. עם זאת, רוב האתגרים נובעים ממחזורי הלב והנשימה הקצרים של יונקים אלה. ניתן להתגבר על כך על ידי שימוש בחשיפות קצרות כדי להגביל את תנועת התוצרים, כמו גם קצבי שטף פוטונים גבוהים יותר18. באופן כללי, מצאנו כי השימוש בגרידת לב, כמו גם התאמת ריכוזי איזופלורן להפחתת קצב הנשימה, הפיקו את התמונות הברורות ביותר. מצאנו גם כי ניצול תזמון ניגודיות ספציפי למכרסמים עבור שלבים ספציפיים: שלב עורקי הכבד, שלב ורידי פורטלי ושלב מושהה שיפרו גם הם את ההדמיה19. לשימוש בניגודיות ExiTron nano 12000 יש מספר יתרונות והוא יכול לשפר את איכות התמונה הכוללת. הוא מציע את שיפור הניגודיות החזק ביותר בכבד20 ובדם21. יתרון נוסף הוא שהניגוד קיים בכבד עד 120 שעות לאחר הזריקה הראשונית, מה שיכול להפחית את רעילות הכבד הקשורה מכיוון שיש צורך בפחות ניגודיות אם נדרשותסריקות חוזרות 20.
יתר על כן, מכיוון שהסריקות מבוצעות עם עכבר מורדם עם איזופלורן, שיפור הניגודיות אינו משתנה עם שינוי זה בפיזיולוגיה20. על ידי שימוש בטכניקות הדמיה אלה וניגודיות ExiTron, הערכה ברורה של אנסטומוזות מוצלחות ב- OLT אפשרית. MicroCT מאפשר הערכה לא פולשנית של allografts in-vivo על פני תקופה ממושכת. פרוטוקול זה מקטין את מספר בעלי החיים שיש להקריב כדי להעריך אנסטומוזות כלי דם ומאפשר הזדמנות ללמוד טיפולים במשך מספר שבועות והשפעתם על כלי הדם.
מגבלות
יש לציין כי בעוד שגרסאות מרובות של מודל OLT התרחשו כדי לשכלל את הטכניקה שלו, ההדמיה של האנסטומוזות באמצעות microCT היא עדיין תהליך מתמשך. יתר על כן, OLT עכבר מציע תובנה ייחודית על רפואת השתלות. עם זאת, זה לא מודל מקיף כפי שקשה לשמור על עכברים אלה בחיים מעבר לשבוע אחד. יש להשתמש גם במודלים נוספים להשתלות כדי לבסס ניסויים פרה-קליניים.
מסקנות
ההתקדמות בתחום המיקרו-CT התקדמה במהירות בעשור האחרון, ומספקת לחוקרים כלים חדשים שלא יסולא בפז בתחום המודלים של בעלי חיים וההשתלות. בעתיד, הדמיה תלת-ממדית מפורטת יותר תציע תובנות נוספות לגבי מחקר וגילוי.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
SMB נתמך על ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (NIDDK) מענק R01DK1234750. BAW נתמך באמצעות המכון הלאומי לבריאות לב, ריאות ודם מענק המכון הלאומי R01HL143000.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 Blade | Fisher Scientific | 3120030 | |
| 4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| 6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
| 7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
| 8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
| 10-0 nylon suture | AD Surgical | M-N510R19-B | |
| 20 G Angiocath | Boundtree | 602032D | |
| 30 G Needle | Med Needles | BD-305106 | |
| Baytril (enrofloxacin) Antibacterial Tablets | Elanco | NA | |
| Bovie Chang-A-Tip High Temp Cauterizer | USA Medical and Surgical Supplies | BM-DEL1 | |
| Bulldog Vein Clamp 1 1/8 | Ambler Surgical USA | 18-181 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | ||
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Store | RS-5668 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science tools | 11254-20 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11252-50 | |
| Dumont Medical #5/45 Forceps - Angled 45° | Fine Science tools | 11253-25 | |
| ExiTron nano 12000 | Miltenyi Biotec | 130 - 095 - 698 | CT contrast agent |
| Forceps | Fine Science tools | 11027-12 | |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Roboz Surgical | RS-7112 | |
| heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| histidine-trypotophan-ketoglutarate | University Pharmacy | NA | |
| Insulated Container | YETI | ROADIE 24 HARD COOLER | https://www.yeti.com/coolers/hard-coolers/roadie/10022350000.html |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
| Mirco Serrefines | Fine Science tools | 18055-05 | |
| Mouse Rectal Temperature Probe | WPI Inc | NA | |
| NEEDLE HOLDER/FORCEPS straight | Micrins | MI1540 | |
| PE10 Tubing | Fisher Scientific | BD 427400 | |
| perfadex | XVIVO Perfusion AB | REF99450 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | NA | |
| saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
| Scissors | Fine Science tools | 14090-11 | |
| Small Mouse Restraint – 1” inner diameter | Pro Lab Corp | MH-100 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent scientific | SS-MVG-Module | |
| Surgical microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| U-CTHR | MI Labs | NA | CT Scanner software |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
| Yasagil clamp | Aesculap | FT351T | |
| Yasagil clamp | Aesculap | FT261T | |
| Yasagil clamp applicator | Aesculap | FT484T |
References
- Rana, A., et al. Survival benefit of solid-organ transplant in the United States. JAMA Surgery. 150 (3), 252-259 (2015).
- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E.
- Nakano, R., et al. Dendritic cell-mediated regulation of liver ischemia-reperfusion injury and liver transplant rejection. Frontiers in Immunology. 12, 705465 (2021).
- Nakamura, K., et al. Antibiotic pretreatment alleviates liver transplant damage in mice and humans. Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3420-3434 (2019).
- Lee, S. K., et al. Patient-derived Avatar mouse model to predict the liver immune homeostasis of long-term stable liver transplant patients. Frontiers in Immunology. 13, 817006 (2022).
- Li, S. P., et al. Characterization and proteomic analyses of proinflammatory cytokines in a mouse model of liver transplant rejection. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 5188584 (2022).
- Huang, D. R., Wu, Z. J., Zhu, Y. Modified arterialization of orthotopic liver transplantation in a mouse model. Hepatobiliary Pancreatic Disease International. 9 (3), 264-268 (2010).
- Yokota, S., et al. Orthotopic mouse liver transplantation to study liver biology and allograft tolerance. Nature Protocols. 11 (7), 1163-1174 (2016).
- Chen, X. C., et al. Reduced complications after arterial reconnection in a rat model of orthotopic liver transplantation. Journal of Visual Experiments. (165), e60628 (2020).
- Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visual Experiments. (96), e52309 (2015).
- Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
- Lee, Y. G., et al. A rat lung transplantation model of warm ischemia/reperfusion injury: optimizations to improve outcomes. Journal of Visual Experiments. (176), e62445 (2021).
- Di Martino, M., et al. Imaging follow-up after liver transplantation. British Journal of Radiology. 89 (1064), 20151025 (2016).
- Vardar, B. U., Dupuis, C. S., Goldstein, A. J., Vardar, Z., Kim, Y. H. Ultrasonographic evaluation of patients with abnormal liver function tests in the emergency department. Ultrasonography. 41 (2), 243-262 (2022).
- Marx, J. Imaging. Animal models: live and in color. Science. 302 (5652), 1880-1882 (2003).
- Maehara, N. Experimental microcomputed tomography study of the 3D microangioarchitecture of tumors. European Radiology. 13 (7), 1559-1565 (2003).
- Garcia-Sanz, A., Rodriguez-Barbero, A., Bentley, M. D., Ritman, E. L., Romero, J. C. Three-dimensional microcomputed tomography of renal vasculature in rats. Hypertension. 31, 440-444 (1998).
- Badea, C., Hedlund, L. W., Johnson, G. A. Micro-CT with respiratory and cardiac gating. Medical Physics. 31 (12), 3324-3329 (2004).
- Ma, G., et al. Assessment of hemodynamics in a rat model of liver cirrhosis with precancerous lesions using multislice spiral CT perfusion imaging. BioMed Research International. 2013, 813174 (2013).
- Mannheim, J. G., et al. Comparison of small animal CT contrast agents. Contrast Media and Molecular Imaging. 11 (4), 272-284 (2016).
- Rothe, J. H., et al. Time course of contrast enhancement by micro-CT with dedicated contrast agents in normal mice and mice with hepatocellular carcinoma: comparison of one iodinated and two nanoparticle-based agents. Academic Radiology. 22 (2), 169-178 (2015).
