Summary
在该协议中，我们讨论了在小鼠中成功实施原位肝移植（OLT）模型。此外，还讨论了在小鼠成功进行OLT后进一步分析同种异体移植物通畅性的佐剂，特别是利用显微计算机断层扫描（microCT）扫描。
Abstract
显微计算机断层扫描 （microCT） 血管造影是研究人员的宝贵资源。该技术的新进展允许获得高质量的微脉管系统图像，并且是器官移植领域的高保真工具。在这种小鼠原位肝移植 （OLT） 模型中，microCT 提供了实时评估同种异体移植物吻合的机会，并且具有不必牺牲研究动物的额外好处。对比度的选择以及图像采集设置可创建高清图像，为研究人员提供宝贵的信息。这允许评估程序的技术方面，并可能在较长的时间内评估不同的治疗方法。在该协议中，我们以逐步的方式详细介绍了小鼠的OLT模型，并最终描述了可以提供高质量图像的microCT协议，这有助于研究人员对实体器官移植进行深入分析。我们提供了小鼠肝移植的分步指南，并简要讨论了通过microCT血管造影评估移植物通畅性的方案。
Introduction
移植是终末期肝病唯一有效的治疗方法。不可否认，肝移植的益处非常好，中位生存期为 11.6 年，而等待名单上的生存期为 3.1 年1。然而，存在重大限制，限制了肝移植的广泛应用，最重要的是缺乏合适的高质量供体器官。因此，扩大供体器官库将需要创新的策略，允许使用目前被认为不适合的同种异体移植物，从而增加移植的安全边际。因此，为了改善肝移植的可及性，必须在小动物身上进行临床前研究。
移植研究特别重要的是移植的体内模型。小鼠原位肝移植 （OLT） 已经存在了近 30 年2，对于研究移植的许多方面至关重要，包括免疫反应的表征、缺血再灌注损伤、急性排斥反应、新型药物的治疗效果和长期生存率 3,4,5,6,7 .使用小鼠研究移植至关重要，因为它允许使用转基因小鼠品系来研究特定分子途径对移植结果的影响。先前已建立的小鼠肝移植方案已得到很好的描述8,9。
肝上和肝下腔静脉 （IVC）、门静脉 （PV） 和胆总管 （CBD） 存在多种吻合方法。它们通常依赖于手部吻合术或类似于小鼠肺移植的改良血管袖带技术 10,11,12。受体小鼠的长期研究和生存以及持续小鼠肝移植计划的发展的一个重要步骤是评估这些关键吻合的能力。在临床环境中，评估同种异体肝移植通畅性的影像学检查通常依赖于超声和计算机断层扫描（CT）13,14。与超声相比，CT 具有明显的优势，因为它可以提供整个腹部的视图，包括每个吻合口，尽管在小动物中用超声获得这些视图可能特别困难。为了加强动物研究以及我们可以从这些损伤和疾病模型中收集的信息，已经投入了大量研究和资源来开发准确的 microCT15,16。在这里，我们描述了原位小鼠肝移植的方案（图1），并简要描述了microCT评估同种异体移植物通畅性和吻合术耐久性的方案。
Protocol
雄性C57BL / 6J小鼠（30g体重）在无病原体条件下饲养在全国儿童医院动物设施中。所有程序均根据 NIH 和国家研究委员会的《实验动物人道护理和使用指南》并经全国儿童医院机构动物护理和使用委员会（IACUC 协议 AR17-00045）批准，以人道方式执行。有关本协议中使用的所有材料、仪器和设备的详细信息，请参阅 材料表 。
1. 移植手术的初始设置
- 设置手术器械。
- 设置手术监测设备（即心率监测设备、脉搏血氧、模块化监测系统）和麻醉机。
- 如果可用，将手术加热板打开至42°C。
- 确保打开通风和麻醉机以加热异氟烷蒸发器。用 30 mL 液体异氟醚填充麻醉储液器，并确保呼吸机连接到氧气。
注意：在本协议中，我们不给动物插管;仅使用鼻锥进行氧合。
- 记录受体和供体小鼠的体重。
- 打开高倍手术显微镜，根据外科医生的喜好调整高度和焦点。确保打开剩余的手术设备（即电烙设备）。
- 准备和布置手术器械，以及 10-0 尼龙的手术扎带（图 2）。
注意：所有手术器械均在121°C下高压灭菌30分钟。此外，手术器械的不同配置可能同样有效。 - 为门静脉 （PV） 和胆总管 （CBD） 支架准备袖带（图 3）。将血管导管和PE10放在高倍显微镜下的无菌表面上。使用 #11 手术刀片，切割血管导管以形成一个 1.5 毫米长的袖带，袖带主体顶部有一个约 0.75 毫米的标签;将聚乙烯管 （PE10） 切割成 2.5 毫米的长度。将袖带和支架存放在无菌盐水中，直到准备好使用。
注意：该移植模型利用 20 G 血管导管制作用于 PV 重建的袖带，以及用于重建 CBD 的聚乙烯管 10 （PE10）。所有其他吻合口都是手工缝制的。 - 准备解决方案。准备肝素注射液，该注射液将在 0.5 mL 组氨酸 - 色氨酸 - 酮戊二酸 （HTK） 溶液中以 100 U 递送。将生理盐水、肝素盐水、PBS 和 HTK 保存溶液储存在冰上。
2. 供体小鼠采购
- 通过将供体小鼠置于异氟烷吸入室中来诱导供体小鼠的麻醉。确保异氟烷浓度约为 2.5%，氧流量为 2 mL/min。等待 5 分钟，以形成麻醉手术平面。为确保适当的麻醉水平，脚趾捏住鼠标以引起反应;缺乏反应表明已达到适当的麻醉水平。
- 使用电子剪子剃掉鼠标的腹部，然后将鼠标置于加热板上的仰卧位。用聚维酮碘清洁腹部，然后用70%乙醇清洁。将眼药膏放在小鼠的眼睛下方以防止干燥。
- 将小鼠置于高倍显微镜下，并使用2%浓度的异氟醚吸入2%浓度的氧气流量保持小鼠处于麻醉状态。
- 用一把剪刀（外科医生首选）从剑突到耻骨联合进行中线剖腹手术。接下来，进行额外的横向切口，以创建低于肋骨的“十字状”图案。使用蚊子止血钳，缩回剑突以充分暴露腹部内容物。
注意：镊子可以根据外科医生的喜好固定。 - 将肠子内脏取出，然后用湿纱布海绵将其放在腹腔左侧。通过取下所有韧带附着物来动员肝脏。
- 暴露适当的肝动脉 （pHA）。使用曲线镊子对血管进行骨架化，并用 10-0 尼龙缝合线结扎。
- 使用尖锐和钝性解剖的组合解剖CBD的整个长度。尽可能靠近胰腺上缘进行导管切开术（足够大，适合CBD支架），以提供足够的长度以备将来使用（距肝脏下缘~1厘米）。用细镊子将胆管支架插入 CBD，并用 10-0 尼龙缝合线固定。使用10-0尼龙缝合线结扎CBD的远端（图4）。
- 使用湿纱布海绵将右肝叶缩回剑突并暴露 IVC。将肝下IVC（IHIVC）从腹膜后移开，并使用手持烧灼装置烧灼右肾上腺静脉（见 材料表）。
- 解剖右肾动脉和静脉，分别用7-0和10-0尼龙结扎。切开右肾静脉和动脉以及剩余的韧带附件。最后，切除右肾。
注意：这样做是为了在最终切割 IHIVC 时获得更好的曝光。 - 用 30 G 针头通过 PV 注入 0.5 mL 冷 HTK 和 100 U 肝素溶液。等待 1 分钟，让肝素系统分布。切开脾静脉和肠系膜上静脉上方的门静脉。
- 用30G针头在IHIVC中缓慢注射含有肝素的冷HTK保存溶液，以灌注供体肝脏。一旦来自 PV 的流体变清澈，就停止注入溶液。注射完成后，在右肾静脉上方的 IHIVC 上放置一个微型夹具，并在夹具下方切割。完成此步骤后，关闭呼吸机并停止使用异氟烷，因为动物刚刚被安乐死。
- 将CBD远端切到先前放置在步骤2.7中的支架上。此外，识别囊性导管，并用 10-0 尼龙缝合线结扎导管。接下来，用一把镊子抓住胆囊的圆顶，并使用尖锐和钝性解剖的组合从胆囊窝中解剖出来。一旦胆囊充分活动，使用一把弹簧剪刀，通过在先前放置的缝合线上方切割囊管来完成胆囊切除术。
- 肝脏下缩回以暴露肝上IVC（SHIVC）。切开 SHIVC，特别注意为受体动物的吻合提供足够的长度。
- 解剖肝脏的游离附加韧带附着物，并 离 体输送供体肝脏，并将器官放入装有冷盐水的容器中。
3.同种异体肝移植的背台制备
- 将冰块放入绝缘容器中，然后将培养皿放在冰床上。用冷盐水填充培养皿。将同种异体肝移植物放入培养皿中，使内脏表面暴露。
- 将 PV 穿过先前选择的袖带，并穿过静脉，使内皮内表面暴露出来。用 10-0 尼龙缝合线固定袖带。确保缝合线位于袖带的凹槽内以获得最佳效果（图 5）。
- 调整同种异体肝移植以暴露SHIVC并放置两个8-0尼龙分别在 3' 和 9 点钟方向缝合，用于最终吻合受体动物。再次调整肝脏同种异体移植物以暴露IHIVC并放置两个8-0尼龙分别在 3' 和 9 点钟方向缝合，用于最终吻合受体动物。
4. 收件人操作
注意：由于这是无菌手术，请使用手套和适当的个人防护设备并服用抗生素。手术时皮下注射 0.1 mg/kg 丁丙诺啡作为术前镇痛剂。
- 像在供体操作中一样暴露 pHA;仅使用中线剖腹手术，而不是先前描述的腹部切口。
- 动员肝脏并切断所有韧带附着物。此外，用 10-0 尼龙缝合线结扎左侧膈血管和食管旁血管。
- 将肝脏向下缩回，从腹膜后解剖出 SHIVC。接下来，将肝脏向上缩回并从腹膜后解剖 IHIVC。必要时使用与前面描述的相同的技术烧灼小桥静脉和腰静脉。
- 用手持烧灼术烧灼右肾上腺静脉，并暴露肝门。用 10-0 尼龙缝合线连接 pHA。接下来，从PV中解剖出CBD，并在靠近CBD分叉处的7-0缝合线中连接CBD，为CBD吻合提供足够的长度。
- 利用微夹住肝下 IVC，并用 7-0 缝合线暂时结扎 PV。开始肝脏期。停止吸入异氟烷。
注意：夹紧门静脉和IVC后，肝静脉回流在肝脏阶段完全阻塞。吸入麻醉剂异氟醚由肝脏代谢;因此，它的吸入会暂时停止，因为蓄积会导致心肺衰竭。 - 通过天然肝脏的PV，用30G针头注射0.5mL肝素盐水以冲洗器官。
- 在 SHIVC 和 IHIVC 上放置微血管夹，尽可能靠近和远端，以留出足够的吻合长度。切断天然 SHIVC、IHIVC、PV（靠近先前放置的缝合线）和任何剩余的韧带附着物到接受者的天然肝脏，并在 体外输送天然肝脏。
注意： IHIVC 夹应位于右肾静脉上方。 - 将供体同种异体移植物置于腹腔内，并缩回供体同种异体移植物的肺门以暴露 PV。使用 30 G 针头用 0.5 mL 肝素盐水冲洗供体和天然 PV，以对血管进行除气以避免空气栓塞。然后，将先前制作的供体 PV 袖带插入受体肝 PV 的管腔中，如有必要，放置固定缝合线以帮助吻合（8-0 缝合线）。用 7-0 缝合线固定吻合口（图 6）。
- 将电路板旋转 180°。用 10-0 尼龙缝合线与供体和天然 SHIVC 进行手工缝合吻合。完成后壁吻合后，用 0.5 mL 肝素盐水冲洗以去除空气以避免空气栓塞。上壁完全吻合（图7）。
- 先取下PV的结扎缝合线;然后，从 SHIVC 中取出血管夹以开始再灌注。结束肝脏期并重新开始异氟烷吸入。用 10-0 尼龙缝合线进行手工缝合，与 SHIVC 吻合术相同的方式重建 IHIVC。完成重建后，从天然和供体IHIVC中取出微夹以重新灌注（图8）。
- 通过在先前放置的缝合线附近的受体 CBD 上进行导管切开术来执行 CBD 吻合术。将供体CBD中的支架插入受体CBD腔，并用10-0缝合线固定吻合口（图9）。
- 用 1 mL 生理盐水冲洗腹腔;检查止血情况并烧灼任何剩余的出血血管。使用 6-0 缝合线将腹部切口分两层闭合。
- 将动物置于温暖的培养箱（42°C）中进行恢复，在动物恢复意识和足够的活动之前，不要让动物无人看管。术后皮下注射 0.1 mg/kg 丁丙诺啡，术后 48 小时每 8 至 12 小时继续给药一次。此外，手术后通过受体动物的水瓶给予卡洛芬（0.2 mL 溶解在 400 mL 水中）长达 7 天。观察受体动物4-5小时，一旦它完全康复，将其放回饲养地点，因为现在可以安全地与其他动物在一起。
注意：止痛药和抗生素可以根据当地动物伦理委员会的建议进行管理。
5. 小鼠microCT血管造影成像
- 在观察小鼠预定的研究间隔后，准备小鼠使用microCT血管造影评估同种异体移植物的通畅性。
- 确保打开通风和麻醉机以加热异氟烷蒸发器。用 30 mL 液体异氟烷填充麻醉储液器，并确保呼吸机连接到氧气。打开microCT扫描仪，确保所有软件都正常运行。
- 启动microCT扫描仪系统上的采集软件。
- 在microCT单元的显示器上，单击 初始化系统 ，然后选择 CT扫描模式。
- 弹出床;安装鼠标床并锁定。
- 将加热板打开至 42 °C 作为恢复笼。
- 用 100 μL CT 造影剂填充 1 mL 注射器。连接一根 30 号针头，以便将来静脉注射造影剂。确保注射器中没有气泡。
- 将鼠标放入尾静脉约束系统中。一旦鼠标完全进入约束系统，关闭系统的门，让尾巴垂直下垂，然后用酒精溶液（70%乙醇）小心擦拭。
注意：通过用戴手套的手握住动物的尾巴几分钟来加热动物的尾巴，可以增加尾静脉插管的成功率。 - 将尾巴朝向远端，并将两根手指（食指和中指）放在靠近计划注射部位的尾巴周围。将尾巴的远端（注射部位下方）放在拇指和无名指之间。
- 用两组手指轻轻施加压力，然后用较浅的深度将针头插入静脉，确保注射器和针头与尾部平行。在释放食指在近端尾部的压力的同时，静脉注射CT造影剂。避免用注射器抽吸，因为这会导致静脉塌陷。
注意：如果针头在静脉中正确定位，则在注射过程中不应感到阻力。如果有阻力，请取出针头并将其重新插入原始注射部位上方。如果静脉插管在两次尝试后仍失败，请更换针头。 - 成功注射造影剂并取出针头后，使用无菌纱布轻轻按压注射部位以止血。
- 将小鼠转移到异氟烷吸入室中，并将浓度设置为2.5%，氧气流量为2mL / min，并等待3-4分钟。一旦建立了麻醉平面，将鼠标快速转移到microCT扫描仪床上，并将其置于扫描台上的俯卧位（图10）。
- 用适量的眼药膏覆盖动物的眼睛。将鼻锥适当地放在动物身上，并确保空气和异氟烷正确流过鼻锥。使用前面描述的相同麻醉参数（步骤5.12）。润滑并插入直肠温度探头，以在成像过程中连续监测动物的体温。
- 将呼吸器与鼠标接触。
- 使用胶带将心电图垫固定在左肢、右前肢和左后肢上。使用超声波凝胶改善心电图垫和皮肤之间的信号。
- 检查计算机软件上的心电图和呼吸信号，以确保在监视器上看到正确的 QRS 波群。为此，请选中“源设置”选项卡中的“逻辑导联”，然后选择提供最清晰 ECG 曲线的导联。
注意： 逻辑导联对应于连接到右、左胸和小腿的三个心电图垫。每条导联代表一条心电图曲线。 - 将 增益 设置为适当的信号高度，通常 4 或 8 是好的。选择 双门控。在 “显示设置” 选项卡下，调整显示设置以获得清晰的信号视图：勾选 ECG 和 RESP 旁边的框，并将每个框设置为 500。在 “触发器设置 ”选项卡下，确认已选中 通道 A、通道 B 和 DualTrig 。
- 确保还设置了以下参数： 阈值：当信号低于此值时;将值设置为 2,500; 迟滞：确保信号越过迟滞，以创建一个软件触发点，在该点开始新的触发周期;将值设置为 300; 延迟：在发送触发器之前等待;将值设置为 100; 禁止：在此期间不能产生信号，设置值为 200。
- 确保 ECG 的阈值低于滞后值，高于显示屏上 sT 段的峰值。
- 将动物推进到扫描仪中，然后按 更新图像。获取动物的 X 射线侦察图像，为随后的 microCT 图像选择适当的视野和解剖扫描覆盖范围。
- 使用以下参数进行 microCT 血管造影图像采集： 放大倍率：超聚焦，扫描角度：全 （360） 度扫描，能量：单次扫描，扫描模式：门控，设置：默认（全 360° 旋转，X 射线管默认设置为 0.33 mA 和 55 kV，每步 0.750° 度，每步 1 次投影，1 x 1 像素合并和 40 毫秒曝光时间;双门控 意味着 心脏和呼吸门控）（图 11）。
- 扫描完成后，将动物转移到预热的恢复笼中。一旦动物完全康复，将其转移回其主笼子。
- 使用系统软件重建microCT图像。上传图像后，设置蓝色条，使其跨越感兴趣的解剖区域;预览切片以使体积更小，并尽可能限制在鼠标上（此阶段有助于减小重建图像的大小）。
- 打开感兴趣轮廓的体积以优化图像边界。选择 40 μm 体素尺寸、Hann 投影滤波器 和 高斯体积滤波器 （80 μm）。转到 高级 |基于图像的门控 ，将 触发窗口 和 相位 分别调整 为 0.5 和 0.6，选择 10 相 位进行 心脏门控，然后按下 体积重建 按钮。
Representative Results
对于那些不是外科医生、不熟悉解剖学或对解释放射学结果感到不舒服的研究人员，应由受过适当培训的人员进行适当的图像分析。上述协议证明了 OLT 在小鼠中的成功。此外，为了提高研究指标并为移植的成功提供实时反馈，以及消除尸检的需要，可以使用microCT血管造影扫描来提供准确和清晰的图像。该手稿中包括代表性图像（图 11）。 体内 吻合失败的代表性图像如 图12所示。
熟悉肝脏解剖结构和脉管系统的人可以看到 IVC 的静脉吻合未闭。在某些情况下，门静脉也可以可视化，由于门静脉袖带，这在这个模型中很容易实现。开放吻合口的观察表明手术的技术成功。此外，这些图像的 3D 重建可以为研究人员提供更多信息和更详细的血管解剖结构图像。利用上述模型，OLT小鼠队列的死亡率为~40-45%。
图1：原位肝移植概述。 （A） 描绘四种不同吻合术的图形图：i） 肝上静脉注射吻合术，ii） 肝下静脉静脉吻合术，iii） 门静脉吻合术，iv） 胆总管吻合术。每个箭头表示血管或导管应切开肝上IVC（方案步骤2.13）、肝下IVC（方案步骤2.11）、门静脉（方案步骤2.10）和胆总管（方案步骤2.7）的相对位置。（B）吻合 的体内 图。比例尺 = 2 毫米。缩写：IVC = 下腔静脉。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：手术中使用的手术工具。 （A）45°细镊子，（B-E）细镊子，（F）弯曲针架/镊子，（G）直镊子，（H）血管钳具，（I）止血钳，（J）针架，（K）电烙装置，（L）#11刀片，（M）腹部牵开器，（N，O）微型剪刀，（P）细剪刀，（Q）手术剪刀，（R，S）Yasargil夹，（T）斗牛犬静脉夹，（U）微血管夹。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：门静脉袖带和胆管支架。 支架和袖带使用前的 离体 图像。比例尺 = 3.5 毫米。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：供体手术期间的胆总管支架置入术。 （A） 将胆管支架插入胆总管。（B） 胆管支架固定在胆管内。比例尺 = 2 毫米。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：在肝脏同种异体移植物的后台准备过程中放置门静脉袖带。 （A） 穿过静脉袖带的门静脉。（B） 袖带上方的静脉破裂。比例尺 = 2 毫米。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：受体手术期间的门静脉吻合术。 （A） 将静脉袖带插入受体门静脉。（B） 用缝合线固定的门静脉吻合术。比例尺 = 2 毫米。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 7：受体手术期间的肝上 IVC 吻合术。 （A） 吻合口的后壁完全。（B） 完成 SHIVC 吻合术。比例尺 = 2 毫米。缩写：IVC = 下腔静脉;SHIVC = 肝上 IVC。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 8：受体手术期间的肝下 IVC 吻合术。 （A）吻合口的后壁是完全的。（B） 完成 IHIVC 吻合术。比例尺 = 2 毫米。缩写：IVC = 下腔静脉;IHIVC = 肝下 IVC。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 9：受体手术期间的胆总管吻合术。 （A） 将胆管支架放置在受体胆总管内。（B） 固定胆管吻合口。比例尺 = 1 mm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图10：小鼠microCT血管造影动物制剂。 （A）小鼠尾静脉注射以给予造影剂。（B） 小鼠通过microCT机。缩写：microCT=显微计算机断层扫描。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 11：显示同种异体移植物通畅性的 microCT 血管造影的代表性图像。 （A，B） 在整个 IVC 中都可以看到造影剂，表明肝上和肝下吻合口的通畅性。（C） 门静脉对比，再次证明通畅。（D）脉管系统的3D重建。缩写：microCT = 显微计算机断层扫描;IVC = 下腔静脉;PV = 门静脉。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 12：显示 体内 吻合失败的代表性图像。 （A） 由于静脉变形导致血流不足，门静脉吻合失败。（B） 因出血过多导致肝上静脉注射吻合失败。比例尺 = 2 毫米。 请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
啮齿动物中的OLT在文献中得到了很好的描述2,8。要执行这种技术要求很高的手术，通常需要数年的显微手术（或一般手术），因为这涉及对解剖学和技术能力的深刻理解。在开发这个模型时，我们遇到了几个技术问题，这些问题都围绕着吻合口。特别是在PV吻合术中，吻合术通常很难稳定静脉。我们发现，放置一个或两个缝合线（外科医生偏好）有助于促进袖带放置。需要注意的是，放置更多的缝合线会增加手术时间。
此外，SHIVC 位于腹腔深处，很难放置夹子以提供足够的暴露。我们发现，如果鼠标在束缚中尽可能放松，这将增加静脉的灵活性。最终，将由外科医生通过实践确定正确的位置。此外，通过CBD吻合术，管道再次非常脆弱。放置固定缝合线以稳定导管可能很困难，并且可能将其放在一小块纱布上将有助于其稳定。最后，由于所有小型哺乳动物在麻醉时间方面都非常脆弱，因此尽快进行手术非常重要。理想的手术时间如下：1）供体手术，45-60分钟;2）背台准备，15分钟;3）接受者操作，60-80分钟。练习将有助于减少浪费的运动。
随着动物模型的进步，评估研究干预成功与否的能力也在提高。MicroCT 于 1990 年代后期首次用于对大鼠的脉管系统进行研究17。在啮齿动物中进行准确、清晰的 microCT 血管造影研究存在许多挑战。然而，大多数挑战来自这些哺乳动物的短心脏和呼吸周期。通过使用短曝光来限制运动伪影以及更高的光子通量率18，可以克服这一点。总的来说，我们发现使用心脏门控，以及调整异氟烷浓度以降低呼吸频率，产生了最清晰的图像。我们还发现，在特定阶段（肝动脉期、门静脉期和延迟期）使用啮齿动物特异性对比时间也改善了可视化19。使用 ExiTron nano 12000 对比度有几个优点，可以提高整体图像质量。它在肝脏20 和血液21 中提供最强的对比度增强。另一个优点是，在初次注射后，造影剂在肝脏中存在长达 120 小时，这可以减少相关的肝毒性，因为如果需要重复扫描，则需要较少的造影剂20。
此外，由于扫描是在用异氟烷镇静的小鼠下进行的，因此对比度增强不会随着生理学的这种变化而改变20。通过采用这些成像技术和 ExiTron 造影剂，可以清楚地评估 OLT 中成功的吻合口。MicroCT 允许在较长时间内对 体内 同种异体移植物进行无创评估。该协议减少了必须牺牲的动物数量以评估血管吻合口，并提供了在数周内研究治疗方法及其对脉管系统的影响的机会。
局限性
需要注意的是，虽然OLT模型已经进行了多次修订以完善其技术，但使用microCT的吻合口可视化仍然是一个持续的过程。此外，小鼠OLT为移植医学提供了独特的见解。然而，它不是一个包罗万象的模型，因为很难让这些小鼠存活超过 1 周。还应使用其他移植模型来进一步证实临床前实验。
结论
在过去十年中，microCT的进步迅速发展，为研究人员提供了动物模型和移植领域的宝贵新工具。未来，更详细的3D成像将为研究和发现提供进一步的见解。
Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
SMB 得到了美国国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所 （NIDDK） R01DK1234750资助的支持。BAW 由美国国立卫生研究院国家心肺和血液研究所资助R01HL143000提供支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 Blade | Fisher Scientific | 3120030 | |
| 4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| 6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
| 7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
| 8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
| 10-0 nylon suture | AD Surgical | M-N510R19-B | |
| 20 G Angiocath | Boundtree | 602032D | |
| 30 G Needle | Med Needles | BD-305106 | |
| Baytril (enrofloxacin) Antibacterial Tablets | Elanco | NA | |
| Bovie Chang-A-Tip High Temp Cauterizer | USA Medical and Surgical Supplies | BM-DEL1 | |
| Bulldog Vein Clamp 1 1/8 | Ambler Surgical USA | 18-181 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | ||
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Store | RS-5668 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science tools | 11254-20 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11252-50 | |
| Dumont Medical #5/45 Forceps - Angled 45° | Fine Science tools | 11253-25 | |
| ExiTron nano 12000 | Miltenyi Biotec | 130 - 095 - 698 | CT contrast agent |
| Forceps | Fine Science tools | 11027-12 | |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Roboz Surgical | RS-7112 | |
| heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| histidine-trypotophan-ketoglutarate | University Pharmacy | NA | |
| Insulated Container | YETI | ROADIE 24 HARD COOLER | https://www.yeti.com/coolers/hard-coolers/roadie/10022350000.html |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
| Mirco Serrefines | Fine Science tools | 18055-05 | |
| Mouse Rectal Temperature Probe | WPI Inc | NA | |
| NEEDLE HOLDER/FORCEPS straight | Micrins | MI1540 | |
| PE10 Tubing | Fisher Scientific | BD 427400 | |
| perfadex | XVIVO Perfusion AB | REF99450 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | NA | |
| saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
| Scissors | Fine Science tools | 14090-11 | |
| Small Mouse Restraint – 1” inner diameter | Pro Lab Corp | MH-100 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent scientific | SS-MVG-Module | |
| Surgical microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| U-CTHR | MI Labs | NA | CT Scanner software |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
| Yasagil clamp | Aesculap | FT351T | |
| Yasagil clamp | Aesculap | FT261T | |
| Yasagil clamp applicator | Aesculap | FT484T |
References
- Rana, A., et al. Survival benefit of solid-organ transplant in the United States. JAMA Surgery. 150 (3), 252-259 (2015).
- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E.
- Nakano, R., et al. Dendritic cell-mediated regulation of liver ischemia-reperfusion injury and liver transplant rejection. Frontiers in Immunology. 12, 705465 (2021).
- Nakamura, K., et al. Antibiotic pretreatment alleviates liver transplant damage in mice and humans. Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3420-3434 (2019).
- Lee, S. K., et al. Patient-derived Avatar mouse model to predict the liver immune homeostasis of long-term stable liver transplant patients. Frontiers in Immunology. 13, 817006 (2022).
- Li, S. P., et al. Characterization and proteomic analyses of proinflammatory cytokines in a mouse model of liver transplant rejection. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 5188584 (2022).
- Huang, D. R., Wu, Z. J., Zhu, Y. Modified arterialization of orthotopic liver transplantation in a mouse model. Hepatobiliary Pancreatic Disease International. 9 (3), 264-268 (2010).
- Yokota, S., et al. Orthotopic mouse liver transplantation to study liver biology and allograft tolerance. Nature Protocols. 11 (7), 1163-1174 (2016).
- Chen, X. C., et al. Reduced complications after arterial reconnection in a rat model of orthotopic liver transplantation. Journal of Visual Experiments. (165), e60628 (2020).
- Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visual Experiments. (96), e52309 (2015).
- Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
- Lee, Y. G., et al. A rat lung transplantation model of warm ischemia/reperfusion injury: optimizations to improve outcomes. Journal of Visual Experiments. (176), e62445 (2021).
- Di Martino, M., et al. Imaging follow-up after liver transplantation. British Journal of Radiology. 89 (1064), 20151025 (2016).
- Vardar, B. U., Dupuis, C. S., Goldstein, A. J., Vardar, Z., Kim, Y. H. Ultrasonographic evaluation of patients with abnormal liver function tests in the emergency department. Ultrasonography. 41 (2), 243-262 (2022).
- Marx, J. Imaging. Animal models: live and in color. Science. 302 (5652), 1880-1882 (2003).
- Maehara, N. Experimental microcomputed tomography study of the 3D microangioarchitecture of tumors. European Radiology. 13 (7), 1559-1565 (2003).
- Garcia-Sanz, A., Rodriguez-Barbero, A., Bentley, M. D., Ritman, E. L., Romero, J. C. Three-dimensional microcomputed tomography of renal vasculature in rats. Hypertension. 31, 440-444 (1998).
- Badea, C., Hedlund, L. W., Johnson, G. A. Micro-CT with respiratory and cardiac gating. Medical Physics. 31 (12), 3324-3329 (2004).
- Ma, G., et al. Assessment of hemodynamics in a rat model of liver cirrhosis with precancerous lesions using multislice spiral CT perfusion imaging. BioMed Research International. 2013, 813174 (2013).
- Mannheim, J. G., et al. Comparison of small animal CT contrast agents. Contrast Media and Molecular Imaging. 11 (4), 272-284 (2016).
- Rothe, J. H., et al. Time course of contrast enhancement by micro-CT with dedicated contrast agents in normal mice and mice with hepatocellular carcinoma: comparison of one iodinated and two nanoparticle-based agents. Academic Radiology. 22 (2), 169-178 (2015).
