Summary
予備調査では、くも膜下出血(SAH)が脳周皮細胞の死にを引き起こすことが確認されています。SAH後の周皮細胞の収縮性を評価するには、生存可能な脳周皮細胞と生存不可能な脳周皮細胞を区別する必要があります。そこで、高分解能共焦点顕微鏡を用いた観察を容易にするために、脳切片で生存可能な脳周皮細胞と非生存脳周皮細胞を同時に標識する手順が開発されました。
Abstract
周皮細胞は、脳の微小循環内に位置する重要な壁細胞であり、収縮性の調整を介して脳の血流を積極的に調節する上で極めて重要です。従来、それらの収縮性は、特定の状況下での形態学的変化と近くの毛細血管直径の変化を観察することによって測定されていました。しかし、組織固定後の活力の評価と、それに続く画像化された脳周皮細胞の周皮細胞の収縮性が損なわれます。同様に、脳周皮細胞の遺伝的標識は、特にくも膜下出血(SAH)などの神経学的状態において、生存可能な周皮細胞と生存不可能な周皮細胞を区別するのに不十分であり、予備調査で脳周皮細胞の死が検証されています。これらの制約を克服するために信頼性の高いプロトコルが考案され、脳切片の機能的および非機能的な脳周皮細胞の両方の蛍光タグ付けが可能になりました。この標識法により、高解像度の共焦点顕微鏡による可視化が可能になり、同時に脳スライスの微小血管系をマーキングすることができます。この革新的なプロトコルは、脳周皮細胞の収縮性、毛細血管径への影響、および周皮皮構造を評価する手段を提供します。SAHの文脈の中で脳周皮細胞の収縮性を調べることで、脳微小循環に対するその影響についての洞察に満ちた理解が得られます。
Introduction
脳周皮細胞は、細い隆起と突出した細胞体によって区別され、微小循環を取り囲んでいます1,2。脳血流増強は主に毛細血管拡張によって引き起こされるが、細い動脈は拡張速度が遅い3。ペリサイトの収縮性は、毛細血管径とペリサイトの形態に影響を与え、血管動態に影響を与えます4。脳周皮細胞の収縮は毛細血管収縮につながり、病理学的シナリオでは、過度の収縮が赤血球の流れを妨げる可能性があります5。座骨髄から放出されるノルエピネフリンを含むさまざまな要因が、毛細血管内の脳周皮細胞の収縮を誘発する可能性があります6。ペリサイトは、脳血流の調節に関与し、20-HETE合成を示し、高酸素症の際に酸素センサーとして機能します7。酸化的・硝化的ストレスによる脳周皮細胞の収縮は毛細血管に悪影響を及ぼす5.脳周皮細胞の収縮に関するin vivoおよびex vivoの両方の研究にもかかわらず8、脳スライス内の生存可能および非生存可能な脳周皮細胞のイメージングに関する限られた知識が残っています。
重要なことに、脳周皮細胞の組織固定後のイメージングは、それらの活力とその後の収縮性評価を損ないます。さらに、神経疾患(くも膜下出血など-SAH)などのシナリオでは、脳周皮細胞のトランスジェニック標識は、生存可能な周皮細胞と生存不可能な周皮細胞を区別できないことが、予備的なSAH誘発性脳周皮細胞死研究によって確認されています9。
これらの課題を克服するために、TO-PRO-3を使用して生きた周皮細胞を標識し、死亡したペリサイトはヨウ化プロピジウム(PI)で染色しました。高解像度の共焦点イメージング技術を使用して、イメージング中にスライス活性を維持しながら、脳スライス内の生存可能な脳周皮細胞と生存不可能な脳周皮細胞を視覚化しました。本稿は、SAH後の脳微小循環に対する脳周皮細胞の影響を調査するための貴重なツールとして役立つ、脳スライス中の生存可能および非生存の脳周皮細胞をイメージングするための再現性のある方法を提示することを目的としています。
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Protocol
実験プロトコルは、昆明医科大学の動物倫理および使用委員会(kmmu20220945)によって承認されました。本研究では、雌雄300〜350gのSprague-Dawley(SD)ラットを使用しました。
1. SAHモデルの誘導
- 2%イソフルランと100%酸素を使用してラットを麻酔します。イソフルラン(1%〜3%)を連続吸入麻酔に供給することにより、麻酔を維持します。.脳定位固定装置を使用してラットの頭を固定します( 材料表を参照)。
- 以下の手順に従って SAH モデルを作成します。
- マイクロインジェクションニードルを上槽に挿入します。次に、シリンジポンプを使用して、ラットの尾動脈(抗凝固剤なし)から自家血液を上槽槽に注入します( 材料表を参照)。
- 上記の座標を使用して、右外側脳室にマイクロ注射針を埋め込みます:ブレグマ、-0.8 mm;横方向、1.4 mm;奥行き、4 mm9。SAH群の場合、0.2 mLのラット尾動脈血を注入します。偽グループの場合、同じ量の等張生理食塩水を投与します(図1A)。
2.脳スライスの準備と安定化
- 2%イソフルラン吸入を使用してラットに深く麻酔をかけます。.斬首後、脳全体を摘出し、氷冷した人工脳脊髄液(ACSF)に浸します。
注:134 mM NaCl、2.8 mM KCl、29 mM NaHCO3、1.1 mM NaH 2 PO 4、1.5 mM MgSO4、2.5 mM CaCl2、10.11 mM D-グルコースの組成で新たに調製したACSF溶液を使用してください(材料表を参照)。pHを7.3〜7.4に維持します。 - ビブラトーム(材料表参照)を使用して、5%CO2および95%O2で曝気した氷冷ACSF中のSDラットから厚さ200μmの急性脳スライスを調製します(図2)。
- 厚さ200μmの急性脳スライスを、ACSFに浸したナイロンメッシュの保存チャンバーに入れます。ACSF溶液を95%O2 および5%CO2で平衡化し、35〜37°Cの温度範囲を維持します。 脳スライスを2時間安定させ、調整する時間を与えます(図3)。
3. TO-PRO-3による急性脳切片の周皮細胞の標識
注:急性脳切片由来の周皮細胞は、トレーサーTO-PRO-310を用いて蛍光標識した。
- 蛍光色素TO-PRO-3をACSFに添加し、最終濃度1 μMにします。 急性期の脳スライスを室温で、TO-PRO-3を含むACSFとともに暗所で20分間インキュベートします。
注意: 保護のため、TO-PRO-3を取り扱うときは、ラテックス手袋を着用することを忘れないでください。 - 脳スライスを運ぶナイロンメッシュストレーナーをローディングチャンバーから6ウェルプレートリンスチャンバーに移します( 材料表を参照)。脳スライスをすすぎチャンバーに10分間留置します(図4D)。
注:このすすぎステップは、染色プロセスを終了し、バックグラウンド標識を減らし、非特異的染色を防ぎます。 - 5% CO 2 と 95% O2 の混合物で平衡化した ACSF 溶液を使用して、調製物を合計 15 分間すすぎます。このすすぎステップにより、色素の取り込みが停止され、バックグラウンド標識が最小限に抑えられます(図4C)。
4. 急性脳切片における脳微小循環の非生命周皮細胞の染色
- TO-PRO-3をプレロードした脳スライスを、イソレクチンB4をAlexa Fluor 488(FITC-ISOB4;5 μg/mL、 材料表参照)に結合させた状態で37°Cで暗所で30分間インキュベートします。インキュベーション後、脳スライスをACSFで15分間すすぎます(図4E)。
- 通常どおり、5%CO2および95%O2でガス化したACSFで脳スライスをインキュベートします。37°Cで両方の溶液に37μMの濃度のヨウ化プロピジウム(PI)を加えます。 これにより、非重要な脳周皮細胞がラベル付けされます。このACSF溶液中で調製物を暗所で60分間インキュベートします(図4F)。
- 次に、調製物をACSF溶液で15分間すすぎ、色素の取り込みを停止し、バックグラウンド標識を最小限に抑えます。
5. 急性期脳切片におけるバイタルおよび非バイタル脳周皮細胞のイメージング
- プラスチック製のパスツールピペットを使用して、脳のスライスをガラス底の共焦点皿(材料表を参照)に静かに移します。5%CO2および95%O2で事前に平衡化したACSF溶液を皿に充填します。鉄のメッシュを使用して、ラットの脳スライスを所定の位置に固定します。
- ガラス底の共焦点ディッシュを共焦点顕微鏡のステージに移します。急性脳スライスを皿の底に配置し、共焦点顕微鏡イメージング中に95%O2と5%CO2の混合物で平衡化したACSF溶液で9を灌流します(図5Aおよび図5Ab')。
- 大脳皮質微小血管系の壁細胞を40倍の対物レンズで可視化します。互換性のあるソフトウェアを使用して画像スタックをキャプチャします( 材料表を参照)。IB4(励起/発光 460 nm/520 nm)、PI(励起/発光 545 nm/595 nm)、TO-PRO-3(励起/発光 606 nm/666 nm)に適したフィルターを使用します(図5D)。
注:40× DIC N1対物レンズ、3×12ビット:512×512ピクセル(0.22 × 0.22 mm)、キャリブレーション:0.42 μm / px。 - 脳微小血管系と周皮細胞を、そのネットワークと形態に基づいて同定します。各脳スライス上の脳微小血管系ネットワークを含む特定の領域を特定し、画像をキャプチャします。
- その後のキャプチャで一貫性を確保するために、イメージング位置を注意深くメモします(図5B、C)。さらなる処理と分析には、画像解析ソフトウェア(ImageJ)と写真編集ソフトウェア( 材料表を参照)を使用します。
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Representative Results
通常の生理学的条件下では、脳周皮細胞は一般に細胞死を経験しません。 図6 はこの現象を示しており、黄色は重要な脳周皮細胞の存在を示しています。脳周皮細胞はPIによる染色を示さず、生存率を示しています。細胞死後も周皮細胞が微小血管系に付着したままであるかどうかをさらに調べるために、SAHラットモデルで方法を採用し、その後のイメージングを実施しました。
SAH後の脳スライス中の重要な脳周皮細胞と非重要な脳周皮細胞の両方をイメージングする方法が開発されています。 図7に示すように、重要な脳周皮細胞(青い矢印)は微小血管系内にあり、非重要な脳周皮細胞は白い矢印で表されています。この同時可視化により、脳スライス内の重要な脳周皮細胞と非重要な脳周皮細胞の両方を同定することができます。さらに、PI標識された非重要な脳周皮細胞が微小血管系全体に付着したままであることが観察されました。
図1:SAHモデル 。 (A)ラットの頭部を脳定位固定装置にしっかりと固定し、安定性を確保した。SAHモデルは、脳定位固定針を上槽に慎重に挿入することによって誘導されました。(B、C)SAHモデルでは、血液が頭蓋骨内のくも膜下腔に入り、脳に影響を与えます。大脳半球は、SAHの約24時間後に血液で満たされます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:急性全脳スライス調製 。 (A)底部チャンバーを固定用アガロース接着剤でコーティングした。(B)接着剤は、脳にしっかりと密着するように、底のチャンバーに細心の注意を払って塗布されました。(C)周囲のタンクを氷冷ACSFで満たし、温度を維持した。(D)所望の切片の厚さを慎重に定義した。(E,F)です。脳の切片は細心の注意を払って6ウェルプレートに移されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:6ウェルプレートへの移し替えピペットと色素ローディング 。 (A)急性期の脳切片は、プラスチック製のパスツールピペット(3 mL)を使用して移し替えました。(a)で用いたピペットの長さは18.2cmであった。(b)と(c)については、プラスチック製のパスツールピペットの先端を慎重にトリミングし、移植中に脳スライスに損傷を与えないようにしました。6ウェルプレートを(B)から(C)に効率的に移行し、37°Cのウォーターバスで蛍光染色を行いました。(B)6ウェルプレートの1ウェルには、小さなナイロンメッシュストレーナーが収容され、ガス供給用に細いチューブが配置されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:急性脳スライスのインキュベーション。 急性脳切片の周皮細胞をTO-PRO-3で標識するために、体系的な手順を細心の注意を払って実行しました。(A)最初に、6ウェルプレート(12×8cm)の1ウェルに10mLのACSFを充填し、95%O2 と5%CO2の混合物に接続された細いチューブを使用して溶液をバブリングすることにより、適切な曝気を確保しました。(B)続いて、脳スライスを細心の注意を払って6ウェルプレートに移した。(C)10μLのTO-PRO-3原液を色素ローディングチャンバーに導入し、色素の溶解を促進するために穏やかに撹拌した(D)。(E、F)脳切片をさらに特徴付けるために、IB4(ACSFで1 μM)およびPI(ACSFで1 μM)で染色を行いました。これらの一連のステップにより、急性脳切片におけるTO-PRO-3による周皮細胞の標識に成功し、標識された脳周皮細胞のその後の分析と検査が容易になりました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:脳切片中の重要な脳周皮細胞および非重要な脳周皮細胞のイメージング。 (A)溶液は、チューブを通して送達された95%O2および5%CO2の混合物で平衡化される。(B-E)急性脳スライスにおけるTO-PRO-3標識細胞、IB4標識内皮細胞、およびPI標識細胞の高解像度イメージングのためのセットアップ。(E)共焦点顕微鏡。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:脳切片中の重要な脳周皮細胞の画像 。 (A)脳微小血管系をIB4(緑色)で標識した。(B)非生命細胞をPIで標識した。(C)バイタルペリサイトをTO-PRO-3(黄色)で標識しました。(D) 結合した画像が表示されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図7:SAH後の脳切片におけるバイタルおよび非バイタル脳周皮細胞の代表画像 。 (A)脳微小血管系をIB4(緑色)で標識した。(B)非生命細胞をPI(赤)で標識した。(C)バイタルペリサイトをTO-PRO-3(黄色)で標識しました。(D) 結合した画像が表示されます。青い矢印は重要な脳周皮細胞の例を示し、白い矢印は非重要な脳周皮細胞の例を示しています。特に、周皮細胞の核は微小血管表面より上に突き出ていません。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図8:非重要な周皮細胞の数とSAH後の時間との間の正の相関。 高分解能共焦点イメージングは、SAH後のさまざまな時点で脳周皮細胞をキャプチャするために採用されました。脳周皮細胞の顕著な細胞死は、(A)の白い矢印で示すように、SAHの6時間後に始まりました。その後、6時間以降に周皮細胞死が大幅に増加しました。.非生命周皮細胞の数は、(B)に示すように、SAH後の経過時間と正の相関を示しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
重要な脳周皮細胞、非重要な脳周皮細胞、および脳スライスの微小血管系を視覚化するための高解像度共焦点イメージング技術を開発しました。急性ラットの脳切片では、このプロセスでは、TO-PRO-311による周皮細胞の最初の標識、続いてIB412による微小血管内皮細胞の標識が伴います。その後、PIを用いて死亡した周皮細胞の同定を行います。このプロトコールは、簡単で再現性が高く、機能研究に非常に適用できます。
神経系内の脳周皮細胞を特異的に追跡するために、遠赤色蛍光色素TO-PRO-3が用いられます。TO-PRO-3は、主に固定組織の核を染色するが13、生理食塩水に適用した場合、ex vivoで生体内の生きた周皮細胞に選択的に取り込まれる14。以前の研究では、TO-PRO-3を使用したマウスの脳周皮細胞の明確な同定が確認されています15。この蛍光色素は、重要な脳周皮細胞を効果的に標識する11。対照的に、リアルタイムの細胞生存率評価に一般的に利用されている荷電蛍光色素であるPIは12、固定前(固定前のPI染色)に適用すると、細胞の劣化のマーカーとして機能します16。しかし、ペリサイト、特にペリサイトの核の形態学的特徴は微小血管表面より上には及ばないため、 図8Aの白い矢印で示すように、PI染色による内皮核とペリサイト核の区別は困難な場合があります。ラット海馬のCA1領域を3次元的に再構成するための電子顕微鏡を用いた研究では、内皮の約3分の1がペリサイトの体細胞と突起で覆われていることが示唆されている17。
図6では、TO-PRO-3で標識された脳周皮細胞が微小血管系内で観察されています。IB4とPIで標識された脳微小血管系の共焦点画像は、図6のPI陽性死細胞がないことから明らかなように、切片形成プロセス中に細胞死を経験する細胞はごくわずかであることを明らかにしています。その結果、SAHモデルは、非重要な周皮細胞の存在を調査するために利用されます。図7は、脳スライス内では、内皮細胞と比較して周皮細胞で細胞死がより顕著であることを示しています。さらに、図8Aでは、SAHの6時間後から周皮細胞死の有意な増加が観察されています。図8Bは、非生命周皮細胞の数とSAH後の経過時間との間に正の相関関係があることを示しています。それにもかかわらず、重要な脳周皮細胞と非重要な脳周皮細胞の両方を画像化する包括的な研究は、現在の知識の限りでは文書化されていません。
現在のところ、他の種または系(心臓、小腸など)の周皮細胞も、SAH後の急性スライスでバイタル状態と非バイタル状態を示すかどうかは不明のままです。結論として、提供されたプロトコルは、SAH後の脳スライスにおけるバイタルおよび非バイタル脳周皮細胞の両方をイメージングするための複製可能なアプローチを提供します。その簡便さと信頼性により、この技術は、脳スライスにおける周皮細胞の機能的および構造的多様性を明らかにし、周皮細胞の病態生理学に関連するさまざまな疾患モデルにおける詳細な細胞調査を容易にするために使用できます。
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Disclosures
著者らは、競合する金銭的利害関係はないと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学基金会(81960226,81760223)からの助成金によって支援されました。雲南省自然科学財団(202001AS070045,202301AY070001-011)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
| Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
| Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
| Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |
References
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