Summary
La investigación preliminar confirma que la hemorragia subaracnoidea (HSA) causa la muerte de los pericitos cerebrales. La evaluación de la contractilidad de los pericitos después de la HSA requiere la diferenciación entre pericitos cerebrales viables y no viables. Por lo tanto, se ha desarrollado un procedimiento para marcar pericitos cerebrales viables y no viables simultáneamente en secciones cerebrales, lo que facilita la observación utilizando un microscopio confocal de alta resolución.
Abstract
Los pericitos son células murales cruciales situadas dentro de la microcirculación cerebral, fundamentales para modular activamente el flujo sanguíneo cerebral a través de ajustes de contractilidad. Convencionalmente, su contractilidad se mide observando los cambios morfológicos y los cambios de diámetro capilar cercanos en circunstancias específicas. Sin embargo, la fijación posterior al tejido, la evaluación de la vitalidad y la consiguiente contractilidad pericitaria de los pericitos cerebrales de los que se obtienen imágenes se ven comprometidas. Del mismo modo, el etiquetado genético de los pericitos cerebrales se queda corto a la hora de distinguir entre pericitos viables y no viables, especialmente en afecciones neurológicas como la hemorragia subaracnoidea (HSA), donde nuestra investigación preliminar valida la desaparición de los pericitos cerebrales. Se ha diseñado un protocolo fiable para superar estas limitaciones, que permite el marcaje fluorescente simultáneo de pericitos cerebrales funcionales y no funcionales en secciones cerebrales. Este método de etiquetado permite la visualización al microscopio confocal de alta resolución, marcando simultáneamente la microvasculatura del corte de cerebro. Este innovador protocolo ofrece un medio para evaluar la contractilidad del pericito cerebral, su impacto en el diámetro capilar y la estructura del pericito. La investigación de la contractilidad de los pericitos cerebrales en el contexto de la HSA permite comprender mejor sus efectos sobre la microcirculación cerebral.
Introduction
Los pericitos cerebrales, que se distinguen por sus protuberancias delgadas y cuerpos celulares que sobresalen, rodean la microcirculación 1,2. Mientras que el aumento del flujo sanguíneo cerebral es impulsado predominantemente por la dilatación capilar, las arterias más pequeñas exhiben tasas más lentasde dilatación. La contractilidad pericitaria ejerce influencia sobre el diámetro capilar y la morfología pericitaria, impactando en la dinámica vascular4. La contracción de los pericitos cerebrales conduce a la constricción capilar y, en escenarios patológicos, la contracción excesiva puede impedir el flujo de eritrocitos5. Varios factores, incluida la norepinefrina liberada del locus coeruleus, pueden inducir la contracción de los pericitos cerebrales dentro de los capilares6. Con un papel regulador en el flujo sanguíneo cerebral, los pericitos exhiben síntesis de 20-HOTE, sirviendo como sensor de oxígeno durante la hiperoxia7. La contracción de los pericitos cerebrales provocada por el estrés oxidativo-nitrativo afecta negativamente a los capilares5. A pesar de las investigaciones in vivo y ex vivo sobre la contracción de los pericitos cerebrales8, persiste un conocimiento limitado con respecto a la obtención de imágenes de pericitos cerebrales viables y no viables dentro de cortes de cerebro.
De manera crucial, las imágenes posteriores a la fijación tisular de los pericitos cerebrales comprometen su vitalidad y la posterior evaluación de la contractilidad. Además, en escenarios como los trastornos neurológicos (p. ej., hemorragia subaracnoidea - HSA), el marcaje transgénico de los pericitos cerebrales no logra diferenciar entre pericitos viables y no viables, como lo confirma nuestro estudio preliminar de muerte de pericitos cerebrales inducida por HSA9.
Para superar estos desafíos, empleamos TO-PRO-3 para marcar pericitos vivos, mientras que los fallecidos se tiñeron con yoduro de propidio (PI). Utilizamos tecnologías de imágenes confocales de alta resolución para visualizar pericitos cerebrales viables y no viables en cortes de cerebro, al tiempo que preservamos la actividad de los cortes durante la obtención de imágenes. Este artículo tiene como objetivo presentar un método reproducible para obtener imágenes de pericitos cerebrales viables y no viables en cortes de cerebro, que sirva como una herramienta valiosa para investigar el impacto de los pericitos cerebrales en la microcirculación cerebral después de la HSA.
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Protocol
El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Ética y Uso Animal de la Universidad Médica de Kunming (kmmu20220945). Para el presente estudio se utilizaron ratas Sprague-Dawley (SD) de ambos sexos, de 300-350 g.
1. Inducir el modelo SAH
- Anestesiar a las ratas con isoflurano al 2% y oxígeno al 100%. Mantener la anestesia suministrando anestesia inhalatoria continua con isoflurano (1%-3%). Asegure la cabeza de la rata con un aparato estereotáxico (consulte la Tabla de materiales).
- Cree el modelo SAH siguiendo los pasos que se indican a continuación.
- Inserte una aguja de microinyección en la cisterna supraselar. A continuación, inyecte sangre autóloga de la arteria de la cola de la rata (sin anticoagulante) en la cisterna supraselar utilizando una bomba de jeringa (ver Tabla de materiales).
- Implantar una aguja de microinyección en el ventrículo cerebral lateral derecho utilizando las coordenadas mencionadas: bregma, −0,8 mm; lateral, 1,4 mm; profundidad, 4 mm9. Para los grupos de HSA, inyecte 0,2 ml de sangre de la arteria de la cola de rata. Para grupos simulados, administrar el mismo volumen de suero fisiológico isotónico (Figura 1A).
2. Preparación y estabilización de cortes de cerebro
- Anestesiar profundamente a las ratas con inhalación de isoflurano al 2%. Después de la decapitación, extraiga todo el cerebro y sumérjalo en líquido cefalorraquídeo artificial helado (ACSF, por sus siglas en inglés).
NOTA: Utilice soluciones de ACSF recién preparadas con la siguiente composición: 134 mM de NaCl, 2,8 mM de KCl, 29 mM de NaHCO3, 1,1 mM de NaH 2 PO 4, 1,5 mM de MgSO4, 2,5 mM de CaCl2y 10,11 mM de D-glucosa (ver Tabla de Materiales). Mantenga un pH entre 7,3 y 7,4. - Utilice un vibrátomo (ver Tabla de materiales) para preparar cortes agudos de cerebro con un grosor de 200 μm de las ratas SD en ACSF helado que se airea con 5% de CO 2 y 95% deO2 (Figura 2).
- Coloque los cortes agudos de cerebro de 200 μm de espesor en una cámara de almacenamiento sobre una malla de nailon sumergida en ACSF. Equilibrar la solución ACSF con 95% deO2 y 5% de CO2, manteniendo un rango de temperatura de 35-37 °C. Deje que los cortes de cerebro se estabilicen durante 2 h, dándoles tiempo para adaptarse (Figura 3).
3. Marcaje de pericitos en cortes cerebrales agudos con TO-PRO-3
NOTA: Los pericitos de cortes agudos de cerebro se marcaron con fluorescencia utilizando el trazador TO-PRO-310.
- Añadir el colorante fluorescente TO-PRO-3 al ACSF, consiguiendo una concentración final de 1 μM. Incubar los cortes agudos de cerebro a temperatura ambiente en un ambiente oscuro con el ACSF que contiene TO-PRO-3 durante 20 min.
NOTA: Recuerde usar guantes de látex mientras manipula TO-PRO-3 para su protección. - Transfiera el colador de malla de nylon, que transporta las rodajas de cerebro, de la cámara de carga a una cámara de enjuague de placas de 6 pocillos (consulte la Tabla de materiales). Deje que los cortes de cerebro permanezcan en la cámara de enjuague durante 10 minutos (Figura 4D).
NOTA: Este paso de enjuague finaliza el proceso de tinción, disminuye el etiquetado de fondo y evita la tinción inespecífica. - Enjuague las preparaciones durante un total de 15 minutos con una solución de ACSF equilibrada con una mezcla de 5% de CO 2 y 95% de O2. Este paso de enjuague detiene la absorción del tinte y minimiza el etiquetado de fondo (Figura 4C).
4. Tinción de pericitos no vitales de la microcirculación cerebral en cortes cerebrales agudos
- Incubar cortes de cerebro precargados con TO-PRO-3 a 37 °C con isolectina B4 conjugada con Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4; 5 μg/mL, ver Tabla de Materiales) durante 30 min en un ambiente oscuro. Después de la incubación, enjuague las rodajas de cerebro durante 15 minutos en ACSF (Figura 4E).
- Incubar las rodajas de cerebro en ACSF gaseado con 5% de CO2 y 95% deO2 como de costumbre. Añadir yoduro de propidio (PI) a una concentración de 37 μM a ambas soluciones a 37 °C. Esto etiquetará los pericitos cerebrales no vitales. Incubar las preparaciones en esta solución de ACSF durante 60 minutos en la oscuridad (Figura 4F).
- A continuación, enjuague las preparaciones durante 15 minutos con soluciones ACSF para detener la absorción del tinte y minimizar el etiquetado de fondo.
5. Obtención de imágenes de pericitos cerebrales vitales y no vitales en cortes cerebrales agudos
- Transfiera suavemente las rodajas de cerebro a platos confocales con fondo de vidrio (consulte la Tabla de materiales) utilizando pipetas Pasteur de plástico. Llene los platos con una solución de ACSF previamente equilibrada con 5% de CO2 y 95% deO2. Use una malla de hierro para asegurar las rodajas de cerebro de rata en su lugar.
- Transfiera las placas confocales con fondo de vidrio a la platina de un microscopio confocal. Coloque el corte agudo de cerebro en el fondo de la placa y transfundíquelo con una solución de ACSF equilibrada con una mezcla de 95% deO2 y 5% de CO2 durante la obtención de imágenes de microscopía confocal (Figura 5A y Figura 5Ab').
- Visualice las células de la pared de la microvasculatura cortical cerebral utilizando un objetivo de 40x. Capture pilas de imágenes utilizando software compatible (consulte la Tabla de materiales). Utilice filtros apropiados para IB4 (excitación/emisión 460 nm/520 nm), PI (excitación/emisión 545 nm/595 nm) y TO-PRO-3 (excitación/emisión 606 nm/666 nm) (Figura 5D).
NOTA: Capture imágenes con los siguientes detalles: lente de objetivo 40× DIC N1, 3 × 12 bits: 512 × 512 píxeles (0,22 × 0,22 mm), calibración: 0,42 μm/px. - Identificar la microvasculatura cerebral y los pericitos en función de su red y morfología. Localice una región específica que contenga una red de microvasculatura cerebral en cada corte de cerebro y capture imágenes.
- Anote cuidadosamente la ubicación de la imagen para garantizar la coherencia en las capturas posteriores (Figura 5B, C). Para un mayor procesamiento y análisis, utilice un software de análisis de imágenes (ImageJ) y un software de edición de fotos (consulte la tabla de materiales).
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Representative Results
En condiciones fisiológicas normales, los pericitos cerebrales generalmente no sufren muerte celular. La figura 6 ilustra este fenómeno, donde el amarillo indica la presencia de pericitos cerebrales vitales; Los pericitos cerebrales no muestran tinción con PI, lo que indica su viabilidad. Para investigar más a fondo si los pericitos permanecen unidos a la microvasculatura después de la muerte celular, se emplearon métodos en un modelo de rata SAH y se realizaron imágenes posteriores.
Se han desarrollado métodos para obtener imágenes de pericitos cerebrales vitales y no vitales en cortes de cerebro después de la HSA. Como se muestra en la Figura 7, los pericitos cerebrales vitales (flechas azules) se encuentran dentro de la microvasculatura, mientras que los pericitos cerebrales no vitales están representados por flechas blancas. Esta visualización simultánea permite la identificación de pericitos cerebrales vitales y no vitales dentro de cortes de cerebro. Además, se observó que los pericitos cerebrales no vitales marcados con PI permanecían unidos a toda la microvasculatura.
Figura 1: Modelo de HAS . (A) La cabeza de la rata estaba firmemente asegurada al aparato estereotáxico para asegurar la estabilidad. El modelo de HSA fue inducido mediante la inserción cuidadosa de una aguja estereotáxica en la cisterna supraselar. (B,C) En el modelo SAH, la sangre entra en el espacio subaracnoideo dentro del cráneo, afectando al cerebro. Los hemisferios cerebrales se llenan de sangre aproximadamente 24 h después de la HSA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Preparación aguda de cortes de cerebro entero . (A) La cámara inferior se recubrió con pegamento de agarosa para su fijación. (B) El pegamento se aplicó meticulosamente a la cámara inferior para que se adhiriera firmemente al cerebro. (C) El tanque circundante se llenó con ACSF helado para mantener la temperatura. (D) El espesor de sección deseado se definió cuidadosamente. (E,F). Los trozos de cerebro se transfirieron meticulosamente a una placa de 6 pocillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Pipetas de transferencia y carga de colorante en una placa de 6 pocillos. (A) Los cortes agudos de cerebro se transfirieron utilizando pipetas plásticas Pasteur (3 mL). La longitud de la pipeta utilizada en (a) era de 18,2 cm. Para (b) y (c), la punta fina de la pipeta Pasteur de plástico se recortó cuidadosamente para evitar cualquier daño potencial a los cortes de cerebro durante la transferencia. Las placas de 6 pocillos se transfirieron eficientemente de (B) a (C) para la tinción de fluorescencia en un baño de agua a 37 °C. (B) Un pocillo de la placa de 6 pocillos acomodaba un pequeño colador de malla de nylon, con una tubería fina colocada para el suministro de gas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Incubación de cortes agudos de cerebro. Se siguió meticulosamente un procedimiento sistemático para marcar los pericitos con TO-PRO-3 en los cortes agudos de cerebro. (A) Inicialmente, un pocillo de una placa de seis pocillos (12 × 8 cm) se llenó con 10 mL de ACSF, asegurando una aireación adecuada mediante el burbujeo de la solución utilizando un tubo fino conectado a una mezcla de 95% deO2 y 5% de CO2. (B) Posteriormente, los cortes de cerebro se transfirieron meticulosamente a la placa de seis pocillos. (C) Se introdujeron 10 μL de la solución madre TO-PRO-3 en la cámara de carga de colorante, agitando suavemente para facilitar la disolución del colorante (D). (E,F) Para caracterizar aún más los cortes de cerebro, se realizó tinción con IB4 (1 μM en ACSF) y PI (1 μM en ACSF). Estos pasos secuenciales permitieron el marcaje exitoso de pericitos con TO-PRO-3 en cortes agudos de cerebro, lo que facilitó el análisis y examen posterior de los pericitos cerebrales marcados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imágenes de pericitos cerebrales vitales y no vitales en cortes de cerebro. (A) La solución se equilibra con una mezcla de 95% deO2 y 5% de CO2 suministrada a través del tubo. (B-E) Configuración para la obtención de imágenes de alta resolución de células marcadas con TO-PRO-3, endoteliales marcadas con IB4 y marcadas con PI en cortes cerebrales agudos. (E) Microscopía confocal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Imagen de pericitos cerebrales vitales en cortes de cerebro. (A) La microvasculatura cerebral se marcó con IB4 (verde). (B) Las células no vitales se marcaron con PI. (C) Los pericitos vitales fueron marcados con TO-PRO-3 (amarillo). (D) Se muestra la imagen combinada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Imagen representativa de pericitos cerebrales vitales y no vitales en un corte de cerebro después de la HSA. (A) La microvasculatura cerebral se marcó con IB4 (verde). (B) Las células no vitales se marcaron con PI (rojo). (C) Los pericitos vitales fueron marcados con TO-PRO-3 (amarillo). (D) Se muestra la imagen combinada. Las flechas azules indican ejemplos de pericitos cerebrales vitales, mientras que las flechas blancas indican ejemplos de pericitos cerebrales no vitales. Cabe destacar que los núcleos de los pericitos no sobresalen por encima de la superficie microvascular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Correlación positiva entre el número de pericitos no vitales y el tiempo después de la HAS. Se emplearon imágenes confocales de alta resolución para capturar pericitos cerebrales en varios puntos de tiempo después de la HSA. La muerte celular notable de los pericitos cerebrales comenzó a las 6 h después de la HSA, como lo indican las flechas blancas en (A). Posteriormente, hubo un aumento sustancial de la muerte de pericitos a partir de las 6 h. El recuento de pericitos no vitales mostró una correlación positiva con el tiempo transcurrido después de la HSA, como se muestra en (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Se han desarrollado técnicas de imagen confocal de alta resolución para visualizar los pericitos cerebrales vitales, los pericitos cerebrales no vitales y la microvasculatura en cortes cerebrales. En cortes agudos de cerebro de rata, el proceso implica el marcaje inicial de pericitos con TO-PRO-311, seguido de células endoteliales microvasculares con IB412; posteriormente, se realiza la identificación de los pericitos fallecidos mediante PI. Este protocolo es sencillo, reproducible y altamente aplicable para la investigación funcional.
Para rastrear específicamente los pericitos cerebrales dentro del sistema nervioso, se emplea el fluoróforo rojo lejano TO-PRO-3. Mientras que TO-PRO-3 tiñe predominantemente los núcleos del tejido fijo13, se incorpora selectivamente a los pericitos vivos ex vivo cuando se aplica en solución salina fisiológica14. Estudios previos han afirmado la identificación inequívoca de pericitos cerebrales murinos mediante TO-PRO-315. Este fluoróforo marca eficazmente los pericitos cerebralesvitales 11. Por el contrario, el PI, un fluorocromo cargado comúnmente utilizado para la evaluación de la viabilidad celular en tiempo real12, sirve como marcador de deterioro de las células cuando se aplica antes de la fijación (tinción de PI previa a la fijación)16. Sin embargo, dado que las características morfológicas de los pericitos, en particular sus núcleos, no se extienden por encima de la superficie microvascular, distinguir entre núcleos endoteliales y de pericitos mediante tinción de PI puede ser un desafío, como lo indica la flecha blanca en la Figura 8A. Los estudios con microscopía electrónica para la reconstrucción tridimensional de la región CA1 del hipocampo de la rata han sugerido que aproximadamente un tercio del endotelio está cubierto por los somas y las apófisis de los pericitos17.
En la Figura 6, se observan pericitos cerebrales marcados con TO-PRO-3 dentro de la microvasculatura. Las imágenes confocales de la microvasculatura cerebral marcada con IB4 y PI revelan que solo unas pocas células sufren muerte celular durante el proceso de seccionamiento, como lo demuestra la ausencia de células muertas positivas para PI en la Figura 6. En consecuencia, se utiliza el modelo SAH para investigar la presencia de pericitos no vitales. La figura 7 ilustra que, dentro de los cortes de cerebro, la muerte celular es más prominente en los pericitos en comparación con las células endoteliales. Además, en la Figura 8A, se observa un aumento significativo de la muerte pericitaria a partir de las 6 h después de la HSA. La figura 8B muestra una correlación positiva entre el número de pericitos no vitales y el tiempo transcurrido después de la HSA. Sin embargo, no se ha documentado un estudio exhaustivo de imágenes de pericitos cerebrales vitales y no vitales hasta el mejor conocimiento actual.
En la actualidad, sigue siendo incierto si los pericitos de otras especies o sistemas (p. ej., corazón, intestino delgado) también manifiestan estados vitales y no vitales en cortes agudos después de la HSA. En conclusión, el protocolo proporcionado ofrece un enfoque replicable para obtener imágenes de pericitos cerebrales vitales y no vitales en cortes de cerebro posteriores a la HSA. Debido a su simplicidad y fiabilidad, esta técnica puede emplearse para revelar la diversidad funcional y estructural de los pericitos en cortes de cerebro y facilitar investigaciones celulares detalladas en varios modelos de enfermedades relacionadas con la fisiopatología de los pericitos.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
El estudio contó con el apoyo de subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81960226,81760223); la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Yunnan (202001AS070045,202301AY070001-011)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
| Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
| Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
| Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |
References
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